2.深圳市绿微康生物工程有限公司，深圳 518055;
3.香港城市大学能源与环境学院，香港
2. Shenzhen Leveking Bio-engineening Co.,LTD，Guangdong Shenzhen 518055;
3. School of Energy and Environment,City University of Hong Kong，Hong Kong
脂肪酶（lipase，EC.3.1.1.3）又称为三酰基甘油酰基水解酶（triacylglycerol acylhydrolase）是一类特殊的酯键水解酶，可以催化三酰甘油酯及其它一些水不溶性酯类的水解、醇解、酯化、转酯化及酯类的逆向合成反应[1, 2, 3, 4]。脂肪酶是动物体内脂肪代谢的关键酶，被广泛应用于饲料添加、洗涤业、油脂改良、食品加工等诸多领域，是一种有较大开发价值和应用前景的多功能生物催化剂[5, 6]。目前，脂肪酶的工业制备主要采用微生物发酵的方法。黑曲霉（Aspergillus niger）是一种工业上重要的微生物，被广泛用于生产脂肪酶、纤维素酶、木聚糖酶等30多种酶制剂，且被美国FDA认定为GRAS（通常认为是安全的）菌株，其发酵产生的脂肪酶产品可以作为药品、食品和饲料的辅料及添加剂等[7, 8]。应用黑曲霉进行脂肪酶生产的另一优势是，黑曲霉能够将脂肪酶分泌到发酵液中，从而降低下游纯化成本[9]。目前，运用工业育种技术、培养基和发酵条件优化改良等方法进行提高菌种产量，降低发酵成本，是实现节能减排、提高企业竞争力的重要手段之一[10]。
响应面分析方法（Response surface methodology，RSM）是采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系，通过对函数响应面和等高线的分析，能够精确地研究各因子与响应值之间的关系，寻求最优工艺参数，解决多变量问题的一种统计方法。而Box-Behnken Design（BBD）是RSM常用的实验设计方法之一，是以较少的试验次数获得最有效、最经济试验设计和因素优化的方法，并且适用于摇瓶实验[11, 12]。近年来，RSM方法广泛应用于各种微生物发酵不同品种的培养基、培养条件及发酵工艺的优化设计中[5, 12, 13, 14]。
本文针对于产脂肪酶黑曲霉A. niger G62s菌株的摇瓶发酵条件进行优化研究，采用单因素方法考察影响菌株发酵及产酶特性的接种量、摇瓶装量、培养温度、培养时间等条件，在此基础上采用RSM对于4个主要影响产酶因素进行优化，以提高菌株产脂肪酶的能力。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株来源黑曲霉A. niger为深圳绿微康生物工程有限公司提供的生产菌株，该菌株现保藏于公司酶制剂研究中心，保藏号：A. niger G62s。
1.1.2 试剂和仪器主要试剂 酵母膏、蛋白胨、葡萄糖、玉米淀粉、豆粕、无机盐、琼脂等培养基所用试剂均为国产化学级试剂，蛋白Marker为美国thermo公司产品，脂肪酶分析所用试剂为分析级试剂。仪器 净化工作台，苏州净化设备厂；PHS-25型酸度计，杭州科晓化工仪器设备有限公司；Avanti J-30I型高效离心机，美国贝克曼库尔特有限公司；TS-3112型双层大容量摇床，上海仪纯实业有限公司；JY600凝胶电泳仪，北京君意东方电泳设备有限公司。
1.1.3 培养基斜面培养基（YPD）酵母膏10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，琼脂 15 g，蒸馏水定容至1 000 mL，pH7.0。种子培养基 葡萄糖 30 g，NaNO3 7 g，NaH2PO4 0.5 g，K2SO4 0.1 g，蒸馏水定容至1 000 mL，pH 7.2。发酵培养基 葡萄糖 20 g，玉米淀粉 10 g，豆粕 30 g，橄榄油 5 g，NaNO3 10 g，NaH2PO4 2 g，K2SO4 0.2 g，CaCO3 5 g，蒸馏水定容至1 000 mL，pH7.2。
1.2 方法 1.2.1 菌株培养方法斜面种子培养方法：将- 80℃保藏的菌株冷冻管，用接种针取1环均匀涂布于斜面培养基表面，于30℃恒温静置培养7 d，制备成斜面种子，于3-5℃冰箱保存备用。摇瓶种子培养方法：将斜面种子用接种针取1环接种于装有30 mL种子培养基的250 mL摇瓶中，于30℃恒温220 r/min振荡培养20-32 h，见培养液浑浊，OD600值为0.24-0.5，得到摇瓶种子液备用。摇瓶发酵方法：选用500 mL摇瓶，发酵培养基装量为50 mL。摇瓶接种量按照装量的1.5%进行转种。培养温度为30℃恒温培养，220 r/min振荡培养，发酵培养时间66 h。培养好的发酵液在10 000 r/min，4℃低温下离心10 min，取上清液检测脂肪酶活性。
1.2.2 单因素实验方法在摇瓶中分别对于发酵过程的接种量、摇瓶装量、培养时间、培养温度等进行单因素实验，筛选出对酶活性影响较为显著的因素和合理的取值范围。
1.2.3 RSM方法采用“Design-Expert 8.0”软件，以脂肪酶活性为响应值，对单因素实验得到的较为显著的影响因素进行RSM设计（表 1）。采用BBD模型，得到4因素3水平共29组的试验设计，实验为3批，每批平行3瓶。实验得到的数据在 “Design-Expert 8.0”软件中的BBD模型对数据进行拟合和分析，通过ANOVA分析得到二次多项式，最终确定最优化发酵条件。
取发酵液上清20 μL，加入5 μL Loading Buffer（5×），进行SDS-PAGE电泳分析，电泳完毕后用考马斯亮蓝R250染色过夜，然后脱色获得清晰的电泳条带为止。
1.2.5 脂肪酶活性测定方法以碱滴定法测定发酵液中脂肪酶活性。取1 mL发酵液上清液，加入5 mL橄榄油和4 mL的glycine-NaCl缓冲液（pH9.4，50 mmol/L）振荡混匀，在36℃孵育15 min，加入20 mL的95%乙醇和10 mL的30% NaCl溶液终止反应。脂肪酶活性单位定义为，在一定温度和pH条件下，1 min水解底物产生1 μmol的可滴定的脂肪酸，即为1个酶活单位，以U/mL表示[15, 16]。
2 结果 2.1 摇瓶发酵条件的单因素优化首先采用单因素实验，对接种量、摇瓶装量、发酵培养温度和培养温度等4个主要的发酵条件进行初步的研究。根据A.niger G62s菌种的发酵特性，确定各个待考察因素水平，对于各个因素的取值范围比较宽，以保证试验结果能够覆盖高值点。取值范围为接种量为0.5%-4.0%，摇瓶装量为30-100 mL，发酵培养温度为25-45℃，发酵培养时间为48-96 h（图 1-图 4）。
|
| 图 1 摇瓶接种量对于脂肪酶活性的影响（n=9） |
|
| 图 4 培养时间对于脂肪酶活性的影响（n=9） |
G62s菌株在接种量为0.5%时发酵不稳定，增加接种量有利于菌株产脂肪酶。当接种量增加至2%时，发酵液的脂肪酶活性最高。而接种量继续增加，在大于2.5%时菌株产酶能力随之降低（图 1）。摇瓶装量的改变主要是影响通气量，当摇瓶装量≥50 mL时，菌株产酶能力趋于稳定，随着摇瓶装量的增加，菌种的产酶能力没有显著降低（图 2），说明该菌株发酵过程对于摇瓶装量和通气量的要求不高。培养温度可以影响菌种产脂肪酶的稳定性和能力。本实验的结果（图 3）显示，适于G62s产脂肪酶的发酵培养温度在30-32℃之间，温度过低或过高都不利于脂肪酶的产生。最适发酵培养时间则为66-78 h，延长发酵培养时间到84 h脂肪酶活性显著降低（图 4）。通过单因素考察，确定发酵条件为：接种量为2.0%，摇瓶装量为50 mL（500 mL摇瓶），培养温度为30℃，培养时间为72 h。
|
| 图 2 摇瓶装量对于脂肪酶活性的影响（n=9） |
|
| 图 3 培养温度对于脂肪酶活性的影响（n=9） |
在单因素实验基础上，采用Design-Expert 8.0软件RSM的BBD设计，针对于影响发酵的接种量（A），摇瓶装量（B），培养温度（C），培养时间（D）进行优化分析，以脂肪酶活性为响应值（Y），选择4因素，3水平，共29组实验，其中有6组为中心点重复实验（表 2）。
将得到的数据，输入至Design-Expert 8.0软件中，进行多元回归拟合，得到Y值对编码自变量A、B、C、D的二元多次回归方程为：
Y = 2 085.8 + 70.67 A + 33.75 B + 63.92 C + 83.33 D - 43.25 AB + 10.5 AC - 77.25 AD - 54.75 BC - 19.75 BD - 54.5 CD - 100.15 A2 - 26.53 B2 - 75.02 C2 - 77.9 D2
在该拟合方程的基础上，对试验数据进行统计分析和模型方差分析（表 3）。结果显示，模型决定系数R2 =0.934 5，信噪比Adeq Precision = 13.22，表明方程的拟合度与可信度较高，实验误差较小。所选用的模型的P值检验显著（P<0.000 1），说明方程拟合度较好。失拟项P = 0.098 3（P>0.05），说明失拟项差异不显著，模型产生的残差值是由随机误差引起。由此可以认为该模型的选择合理，并且能够对响应值Y进行分析和预测。
根据表 3对于模型所列4个变量的方差分析，在检验项P＜0.05的说明该项的影响是显著的，否则为不显著。该模型的一次项A，B，C，D、二次项A2，C2，D2以及交互项中AD，BC，CD对于Y值影响显著（P ＜ 0.05）。其中，交互项AD影响最大（P=0.003＜0.05），即接种量与培养时间之间的交互作用最大。而其他的3个交互项AB、AC、BD，则对于Y值影响不显著（P ＞ 0.05）。
根据方差分析得出AD、BC、CD交互项对于Y值的影响（图 5）。进一步对于回归方程进行求导，得到极值点，即Y最大化时各个因素水平的取值。由软件预测可得，接种量（A）为1.9%，摇瓶装量（B）为56 mL（500 mL摇瓶），培养温度（C）为30℃，培养时间（D）为75 h。并预测在此优化的条件下，G62s菌株的产脂肪酶活性为2 121 U/mL。
|
| 图 5 因素交互作用对于脂肪酶活性的响应面分析 |
按照RSM优化前后的发酵条件对于G62s菌株的发酵液进行SDS-PAGE分析，结果（图 6）显示在箭头所指位置出现了明显的蛋白条带，说明发酵条件优化前后所产脂肪酶的相对分子量没有改变。根据软件Gel-pro 3.0计算，该条带的分子量约为33.2 kD。
|
| 图 6 G62s 的SDS-PAGE 分析 |
按照RSM优化后的摇瓶发酵条件对于G62s菌株进行验证实验，并检测脂肪酶活性，以验证RSM得到的预测值。试验进行3批，每批平行3瓶。结果（表 4）可见，优化的发酵条件其脂肪酶活性为2 129 ± 39.9 U/mL，与预测值相符（相差0.4%）。与初始发酵条件下发酵比较，脂肪酶活性提高16.7%（C.V. = 1.87%，P ＜ 0.01，差异显著），说明经过RSM优化后菌株的产脂肪酶活性获得了稳定提高。
近年来，微生物发酵产生代谢物的研究越来越多，由于培养基的内在条件（培养基组成、浓度等）及外在条件（发酵温度、时间、通气量等）都会影响微生物的生长与代谢产物的积累，因此对于发酵培养条件的优化成为了研究的热点[17]。在微生物的发酵实验中单因素方法可以最直接、有效地反应各个因素对于菌株影响，广泛应用于发酵条件的优化和菌株的特性考察[18, 19, 20]。响应面法是一种有效的统计方法，可以在更广泛的范围内考虑因素的组合、预测响应值，比一次次的单因素分析方法和正交试验更有效，因此，响应面法会更加广泛应用于发酵培养基工艺条件优化的研究中。响应面分析的关键因素包括：选择合适的研究对象及合适的实验水平，建立一个可信的有效的模型。评估相关性，预测响应值考察模型的准确性等[17，21]。王挥等[22]采用单因素试验和RSM对黑曲霉产单宁酶的摇瓶发酵条件进行优化，确定单宁浓度、培养温度、培养时间为发酵产酶影响最大的因素。其最适产酶条件为：培养温度31.7℃，转速180 r/min，单宁浓度1.5%，初始pH6.0，接种量10%，装液量20%，培养时间72 h，得到的酶活力最高值1 141.82 U/mL。吴茜茜等[23]采用单因素试验和RSM优化设计了黑曲霉（A. niger PZ321）发酵异淀粉酶的摇瓶培养条件，筛选出硝酸铵、接种量、培养温度3个主要因素，确定了最优化培养条件为接种量2%，30℃培养72 h，酶活为137.3 μ/mL；比基础培养基提高了1.71倍。本研究通过单因素方法结合BBD优化，得到了影响G62s菌株脂肪酶产量的主要影响因素，分析各因素之间的相互关系，得到了最优化的摇瓶发酵条件。其中，摇瓶接种由最初的1.5%提高到1.9%；摇瓶装量由50 mL提高到56 mL；培养温度30℃不变；培养时间由66 h延长到75 h，在最佳摇瓶发酵条件组合下，黑曲霉G62s的脂肪酶产量可以增至（2 129±39.9）U/mL，提高了16.7%。本研究结果与上述报道比较，尽管发酵的酶有差异，但是均为黑曲霉的发酵，其优化结果基本一致。G62s菌株发酵SDS-PAGE分析结果显示，摇瓶发酵条件改变没有影响脂肪酶的相对分子量。说明采用单因素试验和RSM优化法，对提高黑曲霉脂肪酶产量是很有效的。
4 结论黑曲霉G62s优化后的摇瓶发酵条件：在装液量56 mL的500 mL摇瓶中，1.9%接种量，于30℃培养时间75 h可得到最优化的脂肪酶产量。
G62s菌株在优化后的发酵条件下发酵得到脂肪酶活性为（2 129±39.9）U/mL，与模型预测值相符，脂肪酶活性提高16.7%，而且发酵稳定。在单因素实验的基础上通过RSM方法优化发酵培养条件，显著提高了目标菌株的脂肪酶产量。
| [1] | Jaeger KE, Egger T. Lipases for biotechnology[J]. Curr Opin Biotech, 2002, (13):390-397. |
| [2] | Gunasekaran V, Das D. Lipase fermentation:Progress and prospects[J]. Indian J Biotech, 2005, 4:437-445. |
| [3] | Vargas GDLP, Treichel H, de Oliveira D, et al. Optimization of lipase production by Penicillium simplicissimum in soybean meal[J]. J Chem Technol Biotechnol, 2008, 83(1):47-54. |
| [4] | Watanabe YS, Sato S, Sera C, et al. Enzymatic analysis of positional distribution of fatty acids in solid fat by 1, 3-Selective transesterification with Candida antarctica lipase B[J]. J Am Oil Chem Soc, 2014, 91:1323-1330. |
| [5] | Edwinoliver NG, Thirunavukarasu K, Purushothaman S, et al. G. Corn steep liquor as a nutrition adjunct for the production of Aspergillus niger lipase and hydrolysis of oils thereof[J]. J Agric Food Chem, 2009, 57(22):10658-10663. |
| [6] | 张志敏, 王琰, 王斌, 等. 甲醇耐受性脂肪酶产生菌-发酵条件的优化[J]. 河南农业大学学报, 2013, 47(3):318-324. |
| [7] | Schuster E, Dunn-Coleman N, Frisvad JC, et al. On the safety of Aspergillus niger-a review[J]. Appl Microbiol Biotech, 2002, 59(4-5):426-435. |
| [8] | 张谦, 王剑英, 林智, 等. 华根霉脂肪酶在黑曲霉中的重组表达研究[J]. 生物技术通报, 2015, 31(3):165-170. |
| [9] | Mekmouche Y, Zhou S, Cusano AM, et al. Gram-scale production of a Basidiomycetous laccase in Aspergillus niger[J]. J Biosci Bioeng, 2014, 117(1):25-27. |
| [10] | 张谦, 贾佳, 林智, 等. 饲料用脂肪酶产生菌—黑曲霉G55高产菌株的选育[J]. 中国饲料, 2014, 16:28-32. |
| [11] | 褚以文. 微生物培养基优化方法及其优化软件[J]. 国外医药:抗生素杂志分册, 1999, 20(2):58-61. |
| [12] | Rafigh SM, Yazdi AV, Vossoughi M, et al. Optimization of culture medium and modeling of curdlan production from Paenibacillus polymyxa by RSM and ANN[J]. Int J Biol Macromol, 2014, 70:463-473. |
| [13] | 王春明, 钟超, 王凤学, 等. 一株发酵产木聚糖酶培养基的响应面优化[J]. 生物技术通报, 2015, 31(2):179-186. |
| [14] | Dobrev GT, Pishtiyski IG, Stanchev VS, et al. Optimization of nutrient medium containing agricultural wastes for xylanase production by Aspergillus niger B03 using optimal composite experimental design[J]. Bioresour Technol, 2007, 98(14):2671-2678. |
| [15] | Zhang T, Qi Z, Wang YY, et al. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Penicillium expansum PE-12 and its application in molecular breeding[J]. Microbiolog Res, 2013, 168:130-137. |
| [16] | Kouker G, Jaeger K E. Specific and sensitive plate assay for bacterial lipases[J]. Appl Environ Microbiol, 1987, 53(1):211-213. |
| [17] | 刘志祥, 曾超珍. 响应面法在发酵培养基优化中的作用[J]. 北方园艺, 2009, 2:127-129. |
| [18] | 王义强, 王启业, 马国辉, 等. 戊糖乳酸杆菌发酵产乳酸及高产菌株诱变选育[J]. 生物技术通报, 2014, 30(11):179-186. |
| [19] | 吴孔阳, 王学军, 周培华, 等. 响应面法优化黑曲霉发酵产低聚异麦芽糖培养基[J]. 食品科学, 2012, 33(19):216-222. |
| [20] | 吴升山, 倪辉, 肖安风, 等. 黑曲霉DB056产柚苷酶发酵条件初步优化[J]. 微生物学通报, 2010, 37(9):1305-1311. |
| [21] | Vohra A, Satyanarayana T. Statistical optimization of themedium components by response surface methodology to enhance phytase production by Pichia anomala[J]. Process Biochem, 2002, 37(9):999-1004. |
| [22] | 王挥, 张蕾, 黎继烈, 等. 响应面法优化黑曲霉发酵产单宁酶条件[J]. 中南林业科技大学学报, 2011, 31(10):122-126. |
| [23] | 吴茜茜, 田晓敏. 响应面法优化黑曲霉产异淀粉酶的培养方法[J]. 生物学杂志, 2014, 31(6):60-63, 78. |