Southern印迹杂交是一种在分子生物学研究中用来检测基因组DNA中特定序列的通用方法，是研究DNA图谱的基本技术。在遗传病诊断、外源基因检测、转基因植株鉴定与育种等方面均有着重要的价值^[1]。Southern杂交中根据探针标记的种类不同，可分为同位素标记和非同位素标记两大类^[2]。早期主要以同位素标记为主，该方法虽然灵敏度较高，但由于同位素具有放射性和半衰期，对实验人员身体素质及实验条件都提出了严格要求，因此使得该方法的运用受到了一定的限制。非同位素标记则克服了同位素标记法的缺点，使非同位素标记得到了更广泛的运用^[3]。非同位素标记根据标记物的不同，分为地高辛标记和生物素标记。地高辛标记探针的方法主要有PCR掺入法、随机引物法、切口平移法等^[4]。目前地高辛标记的Southern杂交技术已成功运用到棉花^[5]、烟草^[6]、水稻^[7]、玉米^[8]、油菜^[9]、小麦^[10]等农作物中并取得了良好的杂交效果。然而甘蔗是高度杂合的无性繁殖作物，其遗传背景十分复杂，表现为异源多倍体和多倍的非整倍体，具有染色体数目多，基因组庞大的特点。根据不同的栽培种，染色体数目从80-130条不等，基因组高达10 Gb，是水稻基因组的10倍以上^[11]，这使得转基因甘蔗外源基因的Southern杂交分析较其它作物困难。

本研究以转基因甘蔗及受体为材料，参考前人成功经验，从甘蔗基因组DNA提取，探针标记、基因组DNA使用量及杂交过程等对甘蔗地高辛标记探针的Southern杂交方法进行优化，旨在为转基因甘蔗的Southern杂交分析提供参考。

转基因甘蔗植株由本课题组利用农杆菌介导法获得，导入转基因植株的骨架载体为pCAMBIA3300，筛选基因为Bar基因，对照植株为非转基因ROC-22植株。

随机引物法标记探针：用XhoI酶切质粒载体pCAMBIA3300，切出564 bp的Bar基因片段，回收纯化，取纯化后的1 μg目的基因片段用于标记探针，具体标记的过程参考地高辛试剂盒I（Roche Cat. #REF 11 585 614 910）说明书。PCR法标记探针：以pCAMBIA3300质粒为PCR模板，具体标记过程参照PCR法DIG 探针合成试剂盒（Roche Cat. #REF 11 636 090910）说明书。PCR法标记结束后取2 μL标记产物进行电泳检测探针标记效率及产量，最后按照试剂盒说明书的方法进行标记效率的检测，比较两种探针标记DNA稀释样品与对照的显色强度。

DNA的提取采用改良CTAB法^[12]进行提取。对甘蔗基因组DNA酶切量、酶切时间进行了比较，旨在对酶切条件进行优化。酶切量的比较：分别取同一样品30、40、50和60 μg DNA在400 μL体系中进行酶切，酶切12 h，取5 μL检测酶切是否彻底。其余沉淀回收，溶解于35 μL的ddH₂O中，18 V跑胶过夜，观察跑胶情况。酶切时间的比较：取40 μg DNA样品在400 μL体系中进行酶切，酶切时间分别设置为：6、8、10和12 h，酶切结束后，取5 μL检测酶切效果。根据酶切量及酶切时间的比较结果，选取5个转基因株系和1个非转基因株系作为实验样品。每个样品取40 μg DNA进行酶切，酶切体系为400 μL，120 U的限制内切酶HindⅢ，37℃酶切10 h，酶切结束后用无水乙醇沉淀DNA，沉淀溶解于35 μL的ddH₂O中，65℃水浴10 min，迅速至冰上2-5 min，后18 V电泳过夜（13-16 h）。

对凝胶进行变性和中和处理，处理过程参照地高辛试剂盒说明书进行。转膜用785型真空转膜仪（Bio-Rad）进行，参照周长发等^[5]的方法。转膜结束后采用紫外交联（1200 J）固定膜上DNA。

杂交具体过程参照试剂盒说明书，杂交液用量5 mL，42℃预杂交1-3 h。探针使用量10 μL，杂交液用量5 mL，于40℃杂交18 h。杂交结束后进行洗膜处理，使用洗液II（0.5×SSC，0.1% SDS）时，于64℃洗膜。封闭液孵育时间为30 min，抗体工作液孵育时间为1 h，其余过程与试剂盒说明书相同。最后显影过程于黑暗静置，显影时间30 min-12 h，显影结束后，尼龙膜照相留存。

探针的洗脱和再次杂交参照试剂盒说明书进行。第二次杂交采用PCR法标记探针1.5 μL，具体操作同上。

采用电泳法对PCR标记的探针进行检测，未标记的Bar基因大小为423 bp，而地高辛标记探针后，由于地高辛分子的影响，使得标记的探针比相应未标记的Bar基因片段分子量大，电泳时迁移速率相对较慢，如图 1所示。

图 1 PCR 法标记Bar 基因探针的电泳检测结果

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随机引物法与PCR法探针标记效率的比较结果如图 2所示，阳性对照DNA显示6个稀释点，随机引物法显示3个稀释点，PCR法显示5个稀释点。经显色亮度比对（图中箭头所示）PCR法标记探针稀释浓度为0.3 pg/μL时，其显色强度与随机引物法标记的探针稀释浓度为3 pg/μL时的显色亮度一致。由此可见PCR法标记探针的效率高于随机引物法一个数量级。

图 2 随机引物法和PCR 法标记探针效率的比较

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甘蔗基因组不同DNA量酶切结束后，取5 μL电泳检测，酶解效果较好，差异并不明显。其余酶切产物回收后进行电泳检测如图 3所示，甘蔗基因组DNA量为30 μg 、40 μg时，泳道自上而下成均匀弥散状，电泳效果最好。但DNA量为30 μg时，由于DNA量少，泳道亮度较暗。当DNA量增加到50 μg、60 μg时，随着DNA量的增加，泳道两侧边缘出现高亮度的轨道就越明显，泳道中间DNA片段就越少。

图 3 甘蔗基因组DNA 量酶切效果检测

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40 μg DNA在400 μL体系中进行酶切时间比较，酶切6 h和8 h，酶切不充分，条带并没有成均一的弥散状。酶切10 h和12 h 的酶切效果最好，酶切产物成均匀的弥散状，酶切10 h和12 h效果较接近（图略）。根据甘蔗基因组不同DNA量的酶切及不同酶切时间的实验结果，最后确定酶切体系为：40 μg DNA在400 μL体系中加入8 μL的限制性内切酶，酶切10 h。对不同样品按此酶切体系进行酶切，酶切产物沉淀溶解后，低压过夜电泳。

图 4-A显示，采用随机引物法标记的探针杂交结果很不理想，特异性差，几乎无目的带，背景深。图 4-B显示，PCR法标记的探针杂交背景浅，杂交条带清晰，能直观的看出转基因植株的拷贝数，杂交效率较高。

图 4 不同探针标记方法的杂交结果

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随机引物法可标记的DNA长度范围为：300-1 500 bp，一般每隔20-25个核苷酸掺入一个标记的核苷酸，标记效率低^[13]。标记所需DNA量较多，一般20 μL体系需1 μg（至少300 ng）模板DNA，标记耗时，且探针需要纯化，否则容易造成杂交背景过深，影响实验结果的分析和研究。PCR标记法一般适合于小片段标记，标记效率较高，标记需要模板量较少，如基因组DNA 1-50 ng，质粒DNA 10-100 pg即可。对模板纯度要求不高，标记操作方便快捷，标记的探针无需纯化即可用于Southern杂交，该方法采用专一的酶进行标记，价格相对昂贵，但是每次杂交加入的探针量较少。本研究就随机引物法和PCR法标记探针的效率进行了比较，PCR法标记探针稀释浓度为0.3 pg/μL时，其显色强度与随机引物法标记的探针稀释浓度为3 pg/μL时的显色亮度一致，表明PCR法标记探针的标记效率显著高于随机引物法，两者相差一个数量级，该结论与之前报道的文献结果相符^[14]。从本研究的探针标记结果及最后两者的杂交结果分析，Southern杂交采用PCR标记法标记探针更为灵敏。

酶切是做好Southern杂交的前提，本实验就甘蔗基因组DNA酶切量和酶切时间进行了研究。基因组DNA酶切量依据植物基因组特性不同，使用基因组DNA量也不同，一般植物用于Southern杂交的DNA量在5-15 μg左右便可取得良好的杂交效果。本实验甘蔗基因组DNA酶切量选择在30-60 μg，主要是由于甘蔗具有染色体数目多，基因组庞大的特点，因此常规的DNA量是无法满足甘蔗Southern杂交，本团队曾用过10、20和30 μg的DNA，杂交效果都不理想，条带较弱，无法分辨植株的拷贝数。一般用于杂交的甘蔗基因组DNA酶切时间为12 h以上，时间较长^[15]。为了节约时间加快整个实验的进度，因此本实验在采用400 μL的大酶切体系前提下，进行了酶切时间为6、8、10和12 h的酶切效果比较，实验结果证明了甘蔗基因组尽管在400 μL的大酶切体系下，仍然需要较长的酶切时间才能彻底酶解。

杂交过程中杂交温度、探针加入量是实验成功的关键，不同基因的杂交温度需根据试剂盒杂交温度计算公式进行计算，杂交温度过高和过低都不利于探针与目的片段的结合。本实验依据试剂盒说明书杂交温度计算公式得出Bar基因的杂交温度为38-42℃，实验取中间值40℃作为杂交温度。探针加入量根据试剂盒说明书如果要检测复杂基因组中的单拷贝基因，探针浓度为25 ng/mL计算加入。在5 mL杂交液中PCR法标记的探针加入量为1.5 μL，随机引物法标记的探针加入量为10 μL。为了减少探针的损失，本实验将探针加入到100 μL预杂交液中，进行沸水处理变性。本实验就随机引物法与PCR法两种探针杂交结果比较，采用随机引物法探针的杂交结果背景较采用PCR法探针深，杂交条带不清晰这与之前报导的相关文献结果相符^{[5, 10]}，采用随机引物法探针进行杂交实验，产生杂交背景高，杂交条带不清晰的原因可能是由于探针没有纯化。之前有相关文献报导随机引物法如果想要获得低背景的杂交条带可以通过对标记的探针进行纯化处理^[10]。

本研究以转基因甘蔗为材料，就探针不同标记方法的比较、甘蔗基因组DNA的提取、基因组DNA酶切量、酶切时间及杂交过程等方面，对地高辛标记的Southern杂交技术进行了优化研究。使用改良的CTAB法提取的甘蔗DNA能满足后期实验的要求，PCR法标记的探针较随机引物法标记的探针更适合用于甘蔗Southern杂交，40 μg高纯度的甘蔗基因组DNA在400 μL酶切体系中，酶切10 h可获得良好的酶切效果。杂交温度40℃，杂交18 h，可获得杂交背景清晰的杂交条带。