水稻黄单胞水稻致病变种（Xanthomonas oryzae pv. oryzae，Xoo）引起的白叶枯病是世界水稻生产上重要的细菌性病害之一[1]。由于经济重要性以及遗传可操作性，水稻-Xoo互作已成为植物-病原物互作研究的模式系统之一[2]。随着KACC10331（韩国菌株）、MAFF311018（日本菌株）和PXO99A（菲律宾菌株）全基因组测序的完成[3, 4, 5]，为深入研究Xoo致病性的信号调控机理奠定了基础。
环二鸟苷酸（c-di-GMP）是一种存在广泛的细菌小分子第二信使，调控了毒性、生物膜形成和运动性等诸多生物学功能[6, 7, 8]。含GGDEF结构域的鸟苷酸环化酶（DGC）和含EAL或HD-GYP结构域的磷酸二酯酶（PDE）分别控制了c-di-GMP的合成和降解[9]。GGDEF、EAL和HD-GYP结构域蛋白编码基因在细菌基因组中广泛存在，形成一个复杂的信号调控网络[10]。
本研究比较分析上述菌株中GGDEF、EAL和HD-GYP结构域蛋白的种类、数量及其序列特征，鉴别基序保守的DGC或PDE、基序退化的c-di-GMP信号受体。此外，发现感知外界环境信号、调控输出结构域活性的信号输入结构域，旨在为从Xoo中鉴定DGC和PDE编码基因并研究其功能奠定基础。
1 材料与方法 1.1 材料供试菌株为PXO99A、MAFF311018和 KACC-10331，其核酸和氨基酸序列来源于NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/CP000967.1，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_007705.1，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AE013598.1）。
1.2 方法 1.2.1 蛋白保守结构域的预测利用SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）和MEME（http://meme.nbcr.net/meme/tools/meme）程序（参数设置motif宽度为最小3，最大50）预测蛋白保守结构域。
1.2.2 结构域蛋白基因的分布运用CGView Server作图，分析结构域蛋白基因在基因组的分布（参数设置为blastx，expect = 0.00001，Bacterial and Plant Plastid，filter = yes，alignment_cutoff = 85，identity_cutoff = 85）。
1.2.3 系统进化分析利用MEGA5构建系统进化树[11]，比较所有GGDEF、EAL和HD-GYP结构域蛋白的相似性；采用基于JTT矩阵基础模型最大相似法[12]，构建进化模型（bootstrap replication=1 000）[13]。
1.2.4 基因功能验证基因功能验证包括DGC/PDE酶活性、c-di-GMP结合作用以及细菌毒性相关表型等测定[14, 15, 16, 17]。
2 结果 2.1 GGDEF、EAL和HD-GYP结构域蛋白基因的鉴定PXO99A、MAFF311018和 KACC10331分别有26、26 和25个基因编码了GGDEF、EAL和HD-GYP结构域（表 1）。PXO99A和MAFF311018基因数量和类型相同，而KACC10331则比前两种菌株少一个GGDEF结构域基因（表 1和表 2）。
鉴定了几个菌株特异的、只编码GGDEF结构域基因（表 2）。PXO99A独有PXO_02615基因，但缺少与XOO2206（MAFF311018）和XOO2330（KACC10331）同源的基因；KACC10331缺少与PXO_04147（PXO99A）和XOO3786（MAFF311018）同源的基因。
2.2 GGDEF、EAL和HD-GYP结构域蛋白的同源性分析GGDEF、EAL和HD-GYP结构域蛋白基因分散于Xoo整个基因组中，但也存在一定的集聚（图 1）。同源蛋白具有高达90%以上的序列相似性，同组聚集在一个内部节点上，如单独GGDEF结构域聚集在蓝区，单独EAL结构域在绿区，GGDEF和EAL结构域杂合蛋白在黄区，HD-GYP结构域在红区。所有这些GGDEF和EAL蛋白编码基因分散在Xoo基因组各部分，但在1 800-2 900 kb的位置相对集中（图 2）。结果表明，3个菌株尤其是MAFF311018菌株和KACC10331菌株在进化上的亲缘关系很近。
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| 由77 条GGDEF、EAL 和HD-GYP 结构域的氨基酸序列构建而成 图 1 采用最大似然法构建水稻白叶枯病菌系统进化树 |
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| 红色、绿色和蓝色线分别代表PXO99A，MAFF311018 和KACC10331 基因组中c-di-GMP 代谢相关基因。最内层标尺标出基因组的具体位置，内一层是G+C 含量 图 2 水稻白叶枯病菌c-di-GMP 代谢相关基因在基因组的分布 |
39%的GGDEF结构域含有GGEEF或GGDEF保守基序（其中GGEEF占62.5%），87%的含有EAL或EVL以及HD-GYP保守基序（表 1和表 2）。每个菌株有19个GGDEF、EAL和HD-GYP基序保守的蛋白，预测它们可能是有活性的DGC或PDE；其余退化的蛋白是c-di-GMP信号受体（表 2）。
24%的GGDEF结构域蛋白具有DGC酶活性的保守结构，包括保守的GGDEF或GGEEF基序和I位点（RXXD基序）、GTP和Mg2++结合序列、GTP结合KXXXR保守序列（图 3）。PDE包含EAL和HD-GYP结构域蛋白两种类型。
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| A ：I-site、GGDEF motif 和其他位点；B ：GTP/Mg2+ 结合的保守位点；C ：GTP 结合的保守位点 图 3 MEME 分析水稻白叶枯病菌DGC 的保守序列 |
含EAL结构域的PDE具有对活性非常重要的EAL/EVL和DDFGTG保守基序；RocR的R179和Q161是c-di-GMP结合关键位点，而D295、N233、E265、E175、E352、E268、K316和Q372是Mg2++结合关键位点[18]，Mg2++为PDE活性所必须。MEME分析（图 4）表明，Xoo存在相同的保守位点。含HD-GYP结构域的PDE具有保守的HD和GYP残基，中间间隔60或61位氨基酸，HD残基对酶催化的影响非常关键。
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| A ：EAL 基序和c-di-GMP 结合保守位点；B ：DDFGTG 基序和Mg2++ 结合保守位点 图 4 MEME 分析水稻白叶枯病菌PDE 的保守序列 |
已经验证了部分不同结构域蛋白的生物学功能（表 2）。GGDEF/EAL结构域保守的PXO_01019（PdeR）是具有c-di-GMP信号降解活性的PDE[14]；GGDEF/EAL结构域退化的Filp（PXO_00403）是c-di-GMP信号受体[15]；EAL单一结构域蛋白PXO_04753（VieAxoo）突变体生物膜形成明显增多[16]；HD-GYP结构域蛋白PXO_00070（RpfCxoo）突变体毒性、EPS产生、生物膜形成能力等有显著变化[17]。
2.4 信号输入结构域的鉴定信号输入结构域通过感知外部环境信号变化，调节下游输出结构域的活性。GGDEF、EAL和HD-GYP蛋白具有多种信号接受结构域（表 1）。19%的DGC和40%的PDE具有REC结构域，接收磷酸化信号[19]。24%的DGC和27%的PDE具有PAS结构域，能感应环境氧、光、氧化还原电位、小配基以及细胞总能级的变化[20]。10%的DGC和13%的PDE包含GAF结构域，与cGMP结合后能调节催化活性[21]。HAMP仅存在于GGDEF蛋白中，与配基结合后具有调节同源二聚体受体磷酸化和甲基化的作用[22]。3个同源蛋白（PXO_02019、XOO1324和XOO1440）具有Cache_1结构域，参与细菌趋化性的小分子识别[23]。3个同源蛋白（PXO_01741、XOO1775和XOO1879）具有CHASE3结构域，涉及跨膜受体的信号接收[24]。 此外，11%的DGC和7%的PDE具有信号肽，48%的DGC和33%的PDE具有跨膜结构（表 1），表明这些信号肽可以透过或者锚定在细胞膜上，发生DGC和PDE活性的调节[25, 26]。
3 讨论本研究发现在Xoo中存在大量的c-di-GMP信号相关的基因，反映了其在细菌中具有重要的作用。其中一部分基因编码了DGC和PDE代谢酶，控制了c-di-GMP的胞内含量，另一部分结构域发生退化，可能编码了受体或结合蛋白，与c-di-GMP信号分子结合后，进而调控细菌包括毒性、生物膜形成、EPS产生和运动性等在内的诸多生物学功能。然而，c-di-GMP信号途径是一个非常复杂的调控网络，可能存在反馈抑制c-di-GMP合成的调节作用。此外，它还与双组份系统、群体感应信号系统等共同发挥作用，介导了下游的调控反应。
在其它一些与Xoo近缘关系相近的黄单胞细菌中，c-di-GMP信号基因的功能已获得了验证。橘黄单胞菌（X. citri subsp. citri）XAC0610（PXO_04155、XOO_3792和XOO_4021同源蛋白）具有DGC酶活性，虽然它并不具有GGDEF/GGEEF保守基序，但具有与Mg2++和GTP结合的保守位点[27]。水稻细菌性条斑病菌（X. oryzae pv. oryzicola）RpfG（PXO_00070、XOO_2236和XOO_2871的同源蛋白）和野油菜黄单胞菌（X. campestris）RavR具有PDE酶活性[28, 29]。磷酸化后的RavR杂合结构域蛋白具有PDE活性，去磷酸化后具有DGC酶活性[30]，这更加说明c-di-GMP代谢调控网络的复杂性。
另外，虽然已验证Xoo四个GGDEF、EAL和HD-GYP 结构域蛋白的功能，但其它大多数的功能尚有待试验分析。目前，正在对其余蛋白进行DGC/PDE活性、c-di-GMP结合作用以及细菌毒性相关表型等测定。
4 结论Xoo GGDEF、EAL和HD-GYP 结构域蛋白参与了c-di-GMP信号途径，包括作为DGC或PDE合成或降解了c-di-GMP，或作为c-di-GMP信号受体调控了细菌生物学功能。此外，多数蛋白具有感知环境信号变化的输入结构域，调控输出结构域的活性。
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