生物转化是一种高效生产重要化学品的路线，并能实现绿色生产。但在化学工业中使用的大部分底物，如类固醇类，都是非水溶性的，其转化效率受到水溶解度低的影响。研究者采用多种方法提高底物的溶解度，如底物微粒化、环糊精包合、浊点系统和离子液体等，这些方法有的操作繁琐，有的成本较高，有的难以实现产业化[1, 2]。目前为止，添加有机溶剂是工业上疏水性化合物生物转化工艺中普遍用来改善底物溶解性的方法。但有机溶剂的用量却因为其对微生物细胞或胞内酶的不利影响受到严格控制，这大大限制了转化体系中底物的投料量，最终影响生产效能。为了突破这一瓶颈，迫切需要获得耐受有机溶剂的生物催化剂（完整细胞和酶）。其中，完整细胞作为生物催化剂具有更多的优点。如可以催化未知目标酶的反应、增加催化剂对有机溶剂的适应性、在还原生物转化中简化辅酶因子的再生过程等[3, 4, 5]。因此，开发耐有机溶剂的全细胞催化剂对于推动非水相工艺的广泛应用和深入发展具有重要的意义。
耐有机溶剂的微生物是指一类能在较高浓度有机溶剂中存活或者生长的微生物。研究者采用直接筛选分离的方法已从有机溶剂污染的环境（如水体、土壤、海洋沉积物等）中得到了多种耐受有机溶剂的微生物[6, 7, 8]。此外，也有用长期驯化或者传统诱变方法提高微生物有机溶剂耐受性的报道[9, 10, 11]，但这些方法都存在盲目性高，工作量大，研究周期长，产生的正向突变体频率低，难以有效控制变异的方向和性质等问题。
近年来，研究者已从细胞水平和分子水平对微生物有机溶剂耐受机制进行了较为全面和深入的研究，主要包括一般的应激反应、细胞膜调节机制、细胞形态的改变、细胞能量代谢调节机制、与能量偶联的溶剂外排泵及囊泡外排等，发现了许多与有机溶剂耐受性相关的特定基因[12, 13]。在此基础上，利用各种现代分子生物学技术（如基因工程、代谢工程、全局转录机制工程等）对微生物菌株进行理性改造，提高其有机溶剂耐受性是一种更为理性且高效的方法。本文总结了近年来国内外微生物有机溶剂耐性工程菌株构建方面的研究进展，并展望其在全细胞催化和环境污染治理等领域的应用前景。
1 耐受有机溶剂基因工程菌的构建 1.1 功能基因的操作主要是根据已知的有机溶剂耐性机制，对与耐性相关的功能基因（内源或者外源）基因进行操作（如突变、敲除和过表达）。但这种改造依赖于对菌株遗传背景和耐性机制的全面认识，因此多局限于大肠杆菌、酿酒酵母、假单胞菌等模式微生物。
1.1.1 热激蛋白相关基因热激蛋白（Heat shock proteins，HSP）也称分子伴侣，是细胞在外界物理化学刺激下产生的一类蛋白质，在胞内蛋白质合成、转运、折叠和降解过程中起到重要作用。有机溶剂存在的胁迫环境下，耐受菌中的大量热激蛋白被诱发，用来阻止蛋白质聚集，并协助其重新折叠以抵抗有机溶剂的毒性侵害[14, 15]。
热激蛋白GroESL由单体分别为60 kD的GroEL和10 kD左右的GroES两种成分组成。GroESL通过催化ATP水解提供能量，瞬时维持其他蛋白质在折叠过程中间态的稳定，阻止了聚集，帮助其他蛋白质形成正确构象[16]。Zingaro等[17]将groESL在大肠杆菌中进行过表达。结果表明，与对照菌株相比，重组菌株分别在4%（V/V）乙醇、0.75%（V/V）正丁醇、1.25%（V/V）2-丁醇、20%（V/V）1，2，4-丁三醇中培养48 h后，菌体浓度分别增大了12倍，2.8倍、3倍和4倍。2002年，Akiko等[18]将groESL在Acetobacter aceti中进行过表达，重组菌株在5%（V/V）乙醇条件下培养36 h后的菌体浓度与对照菌株相比增加了10倍左右，此外，重组菌株对醋酸和热条件也表现出较好的耐受性。2003年，Tomas等[19]发现在Clostridium acetobutylicum中过表达groESL可以减少丁醇对细胞的毒害作用，重组菌株在0.75%（V/V）丁醇处理2 h后的细胞存活率较对照菌株提高了85%。2012年，Mann等[20]研究发现在C. acetobutylicum分别过表达groESL、grpE和htpG时，重组菌株的丁醇耐受能力均得到明显提高。将重组菌株与对照菌株分别置于2%（V/V）丁醇中处理2 h后，对照菌株不能存活而重组菌株仍保持较高的活力，进一步研究发现，重组菌株中groESL、grpE和htpG基因的表达量较对照菌株分别提高45%、25%和56%。此外，热激蛋白GroESL的过表达也成功提高了乳酸乳球菌、副干酪乳杆菌及植物乳杆菌等其他微生物的有机溶剂耐受性[21]。
DnaK是一种重要的热激蛋白70（Hsp70），它包含一个N末端 ATPase和一个C末端区域，dnaK在体外能溶解热变性的蛋白聚集物，在活体内能与胁迫诱导的未折叠多肽结合阻止其聚集变性，在胁迫减轻后有活性的酶又被释放出来，达到保护酶结构的作用。DnaJ是一种调节蛋白，它能活化DnaK的ATPase活性，协同完成对底物蛋白的 ATP 依赖的结合和释放[22]。2010年，Sugimoto等[23]将Escherichia coli中的dnaK基因在Lactococcus lactis中异源表达，与对照菌株相比，重组菌株在5%（V/V）乙醇中培养36 h后，菌体浓度增大了1.13倍，细胞倍增时间降低了1.29倍。同时，重组菌株对3% NaCl，高温（40℃）和0.5%乳酸（pH 5.47）都表现出良好的耐受性。Akiko等[24]将热激蛋白DnaKJ在A.aceti中进行过表达，大大提高了菌株在较高浓度乙醇下的生长能力。重组菌株在5%（V/V）乙醇中培养36 h后的OD660值约为1.2，而对照菌株仅为0.9。除此以外，重组菌株对高温胁迫也表现出较好的耐受能力。
Kang等[25]通过分析嗜冷菌Bacillus psychrosac-charolyticus 的二维电泳和串联质谱发现，热激蛋白Hsp33在3%（V/V）异丙醇处理30 min后被诱导表达。为进一步验证Hsp33功能，研究者将B.psychrosaccharolyticus中的Hsp33在E.coli进行异源表达，结果发现重组菌株经3%（V/V）异丙醇处理30 min后活细胞数与对照菌株相比提高了100倍。
除了对单个功能基因进行操作，研究者还利用多个功能基因的共表达提高微生物的有机溶剂耐受性。2012年，Zingaro等[26]在大肠杆菌中同时过表达热激蛋白GrpE和GroESL，重组菌株在5%（V/V）乙醇中培养24 h后的活菌数是对照菌株的3倍；同时过表达GroESL和ClpB的重组菌株在5%（V/V）乙醇、1%（V/V）正丁醇和1%（V/V）异丁醇中培养24 h后的活菌数较对照菌株分别提高了1130%、78%和25%；同时过表达GrpE、GroESL和ClpB的重组菌株在7%（V/V）乙醇、1%（V/V）正丁醇和25%（V/V）1，2，4-丁三醇中培养24 h后的活菌数较对照菌株分别提高了200%、390%和78%。这些研究表明，利用基因工程技术对热激蛋白相关基因进行操作是构建有机溶剂耐受菌的一种有效手段。
1.1.2 细胞膜调节机制的相关基因微生物细胞膜是细胞与外界物质交换的通道，而且对细胞内能量传导有着特殊的意义，因而直接影响微生物的有机溶剂耐受性。大量研究表明，微生物细胞主要通过增加细胞膜饱和/不饱和脂肪酸的比率、细胞膜不饱和脂肪酸的顺-反异构化及磷脂极性头部的变化来提高其有机溶剂耐受性[12, 27, 28]。
微生物细胞膜中饱和脂肪酸的相变温度高于对应的不饱和脂肪酸[29]。所以通常认为，增大脂肪酸的饱和度，可以抵消有机溶剂引起的细胞流动性的增加。如菌株Pseudomonas putida DOT-T1E接触甲苯时，通过增大脂肪酸的饱和度提高了其溶剂耐受性[30]。Oh等[31]在E.coli中敲除一个参与饱和脂肪酸降解和不饱和脂肪酸合成的基因fad的抑制基因fadR，结果表明，敲除菌株细胞膜上各种饱和脂肪酸的含量比对照菌株增加了16%，敲除菌株在终浓度为2%（V/V）的混合有机溶剂（正己烷/环己烷=1/1，V/V）中培养7 h后菌体OD600值为0.5，而对照菌株OD600值仅为0.14。Luo等[32]将E. coli W3110中编码3-羟基癸脂酰ACP脱水异构酶（主要参与饱和脂肪酸合成）的fabA在E.coli DH5α中进行过表达，结果表明，与对照菌株相比，重组菌株于3%（V/V）乙醇中培养25 h后，其饱和脂肪酸含量提高15%，菌体浓度提高了67%，而将Bacillus subtilis中编码脂肪酸脱氢酶（催化脂肪酸链上特定位置形成双键）的des基因在E.coli DH5α中进行异源表达后发现，重组菌株在3%（V/V）乙醇中培养25 h后，饱和脂肪酸含量和菌体浓度比对照菌株分别下降了10%和22%。
微生物细胞对有机溶剂的适应行为表现出明显的菌种特异性。研究表明，不饱和脂肪酸（如油酸、棕榈油酸等）对酿酒酵母的有机溶剂耐受性具有重要的作用。酿酒酵母的去饱和酶基因OLE1编码位于细胞质膜上的去饱和酶，这种酶可以通过氧化作用和依赖NADH的去饱和过程将酵母细胞中的饱和脂肪酸（棕榈酸和硬脂酸）转化为对应的不饱和脂肪酸（棕榈油酸和油酸）[33]。Kajiwarat等[34]在酿酒酵母中过表达去饱和酶基因OLEl，结果发现，重组菌株细胞内油酸、棕榈油酸这两种不饱和脂肪酸的含量较对照菌株增加5%，重组菌株对乙醇的耐受浓度提高到15%（V/V）。You 等[35]利用纹夜蛾中的膜去饱和酶基因TniNPVE与酿酒酵母去饱和酶基因OLE1的突变体进行互补。结果表明，表达纹夜蛾去饱和酶基因的重组菌株在5%（V/V）乙醇中培养48 h后的油酸和棕榈酸含量比对照菌株分别增加了2倍和减少了38%，菌体浓度比对照菌株提高了5倍左右。2003年，Zhao等[36]在C.acetobutylicum中过表达环丙烷脂肪酸合酶基因cfa，与对照菌株相比，重组菌株在对数初期的环丙烷脂肪酸含量出现了明显增加，其中C17-环丙烷脂肪酸增加27%，C19-环丙烷脂肪酸增加了91%。对数初期添加90 mmol/L丁醇后继续培养100 min，重组菌株表现出更好的丁醇耐受性，其OD600值达到0.727，而对照菌株OD600仅为0.416。
Okochi等[37]将甘露糖的磷酸转移酶ManXYZ在大肠杆菌中进行过表达，结果表明，10%（V/V）正己烷处理0.5 h后，重组菌株细胞内的正己烷含量比对照菌株降低了11%。这可能是因为ManXYZ在大肠杆菌中的表达改变了细胞膜性质（如减小了细胞膜通透性或增加细胞排除有机溶剂的能力），从而提高了其对正己烷的耐受性。
1.1.3 外排泵相关基因细胞膜作为细胞的第一道防御屏障，并不能阻挡所有的有机溶剂，当溶剂进入细胞后，会产生相应的破坏作用，面对这种情况，耐受性微生物会通过与能量偶联的外排泵机制将胞内的溶剂排出，保证其正常的生理环境。
Dunlop等[38]利用生物信息学方法，在数据库中发掘到了43个外排泵基因，并将其在大肠杆菌中表达，用7种常见的有机溶剂分别测试其耐受性，发现43株工程菌对丁醇和异戊醇的耐受性都没改变，而对其他5种（香叶酯，香叶醇，α-蒎烯，柠檬烯，法尼己）有机溶剂的耐受性均有显著提高。
AcrAB-TolC是大肠杆菌中最重要的主动外排泵系统，能够将己烷、庚烷、辛烷和壬烷等排出胞外[39]。AcrAB-TolC属于RND家族，由膜融合蛋白（AcrA）、外排转运蛋白（AcrB）和外膜通道蛋白（TolC）组成。其中，AcrAB的表达受到多种调控因子的调节，如正调控因子MarA、Rob、SoxS和Fis。其中，MarA、Rob和 SoxS 都能直接与acrAB的启动子结合，提高acrAB的转录，也能通过增加marA的表达间接促进acrAB转录。而负调控因子MarR，通过抑制marRAB的表达调控细胞内MarA的水平[40]。研究者通过对以上调控因子的过表达和突变，提高了大肠杆菌对有机溶剂的耐受性。1997年，Asako等[41]利用高拷贝质粒pHA将marA和marR基因在大肠杆菌中分别进行过表达。结果表明，对数初期加入10%（V/V）环己烷继续培养8 h后，对照菌株的活细胞数为105个/mL，过表达marA基因的重组菌株的活细胞数维持在107 个/mL，而过表达marR基因的重组菌株的活菌数仅为104个/mL。为进一步验证marR功能，2012年，Oh等[31]将大肠杆菌中的marR基因进行敲除。结果表明，敲除菌株在终浓度为2%（V/V）混合有机溶剂（正己烷/环己烷=1/1，V/V）中培养7 h后的OD600值为0.28，而对照菌株OD600仅为0.14。1995年，Nakajima等[42]利用高拷贝质粒pOST4034BR将robA基因在大肠杆菌中进行过表达。结果表明，重组菌株在10%（V/V）环己烷的条件下仍然保持一定的生长速率，倍增时间由原来的25 min延长到80 min，环己烷处理10 h后重组菌株的活细胞数维持在5×106个/mL，而对照菌株仅为103个/mL。1998年，Aono等[43]发现marA、robA和soxS的过表达使得大肠杆菌中AcrA和TolC蛋白表达量增加，有利于外排泵的活动，从而提高了菌株对环己烷的耐受能力。而敲除tolC基因的突变株却对正己烷及环己烷表现出敏感性。
恶臭假单胞菌中有4个溶剂外排泵：ttgABC、ttgDEF、ttgGHI和srpABC。其中srpABC属于RND家族，由3部分组成，分别为内膜转运蛋白（SrpB），胞质连接蛋白（SrpA）以及外膜通道蛋白（SrpC）[44]。Kieboom等[45]从Pseudomonas putida S12中克隆得到了膜结合溶剂外排泵基因srpABC的核苷酸序列，将其转入对溶剂敏感的P.putida JK1中。结果发现，重组菌株在1%（V/V）己烷和环己烷中生长良好，而对照菌株则不能生长。
2012年，Teixeira等[46]将酵母中编码ABC转运蛋白的PDR18基因进行敲除，结果表明，6%（V/V）乙醇中处理10 h后敲除菌株的活细胞数出现明显下降，而对照菌株活细胞数呈增长趋势。2013年，Yang等[47]从Saccharomyces cerevisiae BY4741中克隆了溶剂外排泵基因（ADP1）并将其进行过表达。结果表明，与对照菌株相比，重组菌株在5%（V/V）乙醇处理条件下生长速率提高了20%，同时乙醇产量提高了10%。
1.1.4 相容性溶质合成与分解相关基因相容性溶质是一类在生理条件下不带净电荷的易溶有机渗透保护物质，能在细胞内大量积累，而不影响细胞的生理活动、DNA复制和蛋白质分子的正确折叠，对于稳定细胞组分和蛋白质分子的天然结构具有重要的作用[48]。研究表明，微生物细胞通过相容性溶质的大量积累提高其对干旱、氧化、冷和热、有机溶剂等环境胁迫的耐受性[49]。目前在细菌中发现的相容性溶质分为以下几类：氨基酸类（如脯氨酸、甘氨酸和色氨酸）、氨基酸衍生物类（如甘氨酸甜菜碱、脯氨酸甜菜碱和四氢嘧啶）、甲胺类（如肉碱和二甲基丙磺酸）、小分子肽类（如NAGGN 和 N-乙酰鸟甘酸）、双糖类（如海藻糖）、多元醇类（如甘油）和硫酸酯类[50]。但不同微生物对相容性溶质的选择不同，同一微生物在生长的不同时期对相容性溶质种类的要求也存在变化。
大部分革兰氏阳性菌积累的游离氨基酸主要是脯氨酸。Takagi等[51]通过定点突变的方法对酿酒酵母中的PROI基因（编码脯氨酸合成的关键酶——谷氨酰蛋白激酶）进行改造，结果表明，突变菌株在9%（V/V）乙醇条件下培养2 d后，细胞内的脯氨酸含量和活细胞数较对照菌株分别提高了2.7倍和1倍。研究者还对脯氨酸代谢所必须的脯氨酸氧化酶put1基因进行了敲除，结果发现，敲除菌株在9%（V/V）乙醇条件下培养2 d后，细胞内的脯氨酸含量及活细胞数分别是对照菌株的1.55倍和1.4倍，说明胞内脯氨酸含量的增加能够提高酿酒酵母对乙醇的耐受性。
海藻糖作为一种非还原的双糖，广泛存在于植物、细菌、真菌和昆虫等无脊椎动物中，它既是一种储藏性糖类，又是应激代谢和渗透保护的重要物质[52]。2012年，Moon等[53]在酿酒酵母内异源表达了来自白色链霉菌的海藻糖合成基因SALc，重组菌株在12%（V/V）乙醇中培养12 h后的细胞相对活力维持在94%，而对照菌株仅为57%。海藻糖在酸性海藻糖酶和中性海藻糖酶的催化下分解成2个葡萄糖分子。Jung等[54]利用反义RNA技术干扰酸性海藻糖酶基因（ATH1）在酿酒酵母的表达，降低了酸性海藻糖酶基因的表达量和酸性海藻糖酶活性，结果发现，8%（V/V）乙醇浓度处理8 h后，重组菌株（进行反义RNA干扰处理）到的活菌数约为对照组（未进行反义RNA干扰处理）的1.5倍。Nguyen等[55]研究了海藻糖合成途径关键基因otsBA过表达对大肠杆菌对甘油中有毒杂质耐受性的影响，结果表明，otsBA基因过表达的重组菌株可耐受60 μmol/L的过氧化叔丁醇。
2007年，HirasawaI等[56]分析了S. cerevisiae FY834和S. cerevisiaeIFO2347经5%（V/V）乙醇处理0-180 min后的DNA芯片数据。结果发现，乙醇处理后色氨酸合成相关基因（TRP1、TRP2、TRP3和TRP5）的表达量发生显著变化。为进一步证明其功能，分别将TRP1、TRP2、TRP3和TRP5基因于S. cerevisiaeYN120进行过表达，结果表明，与对照菌株相比，重组菌株在5%（V/V）乙醇培养条件下的比生长速率分别提高了32%、16%、20%和28%。
1.2 转录因子的操作大量文献表明，细胞表型和基因并非是一一对应的线性关系，细胞表型往往是由多个基因通过复杂的代谢网络进行调控的。因此，完全依赖于单个或者多个与有机溶剂耐受性相关的功能基因（内源和外源）的操作，往往不能获得同步的、全局的最优结果，目的表型在整体水平上的提高受到一定限制。转录因子是指那些专一结合于DNA 的特定列上的、能激活或抑制其他基因转录的蛋白质。它的表达会激活多种抗逆功能基因同时表达，因此可以通过水平转移转录因子来提高生物的抗逆特性。与导入或改良个别功能基因来提高某种抗性的传统方法相比，通过改良或增强一个关键转录因子对于提高微生物抗逆性的方法则更为有效。
1.2.1 原核生物RNA聚合酶相关的转录因子原核生物细胞体内只有一种RNA聚合酶，负责基因的转录。细菌RNA聚合酶由5种不同的亚基构成。首先包含一个由α、β、β’和ω组成的核心酶。核心酶只能使已经开始合成的RNA 链延长，但不具有起始合成RNA 的能力，必须加入σ亚基才表现出全部聚合酶的活性[57]。目前大肠杆菌中发现的σ因子有7 种，分别为：σD（70）、σN（54）、σS（38）、σH（32）、σF（28）、σE（24）和σfecI。其中，σD是最主要的因子（Primary / housekeeping factor），负责与细胞生长相关的1 000多个基因的转录控制；σS则负责细胞稳定期与压力响应相关的100 多个基因的转录调控；σH调控细胞的热应激响应与压力响应基因（约40 个）；σE 则控制约5个极端热应激响应及外细胞质基因；其他几种σ因子的功能分别与N代谢调控与压力响应（σN）、鞭毛排列（σF）及柠檬酸铁代谢调控（σfecI）等几十个基因相关。目前，研究者在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、棒杆菌等模式菌株中对σ因子的结构与功能展开了深入的研究[58, 59, 60]。
2007年，美国麻省理工学院的Alper等[61]提出了“全局转录工程”的概念（Global transcription machinery engineering，gTME）。全局转录工程是一种全新的改进细胞表型的定向进化方法，主要通过易错 PCR 等技术对细胞中转录元件进行突变修饰，使细胞的转录在整体水平上发生改变，有利于由多种基因调控的性状得以改进。研究者对大肠杆菌中编码σ70因子的rpoD 基因及其上游启动子之间的序列进行易错PCR，将扩增得到的片段连接至一个低拷贝的表达载体上，转入大肠杆菌构建一个容量为106 的突变文库，然后在不同的乙醇压力下进行突变菌株的筛选。结果表明，含有突变σ70因子的大肠杆菌在含有50 g/L乙醇的LB培养基中的倍增时间为3.5 h，在含有60 g/L乙醇的LB 培养基中的倍增时间为6 h，而对照菌株在含有50 g/L乙醇的LB培养基中的倍增时间为4-6 h，在含有60 g/L乙醇的LB 培养基中已经没有明显的生长现象。最终筛选得到的优良突变株对乙醇的耐受性提高到70 g/L。这说明转录因子σ70的突变显著提高了大肠杆菌的乙醇耐受性。2012年，Ma等[62]利用TAIL-PCR技术克隆得到了革兰氏阳性菌Rhodococcus ruberTH3的σ70基因（sigA），采用易错PCR对sigA基因进行随机突变，将扩增得到的片段连接在大肠杆菌-红球菌的穿梭载体pNVA上，并电转入R. ruber TH3中，采用不同浓度的丙烯腈和丙烯酰胺进行筛选，最终获得在丙烯腈和丙烯酰胺双重压力下耐受能力最高的突变株TH3/M4N1-59，该菌株在0.6%（V/V）丙烯酰胺条件下培养48 h后，菌体浓度与对照菌株相比提高了1.6倍。Klein-Maruschamer等[63]进一步提出，由于RNA聚合酶α亚基的功能可能参与RNAP 全酶与启动子上游序列的牢固结合以及结合某些活化因子。因此，对α亚基的突变同样可以在转录水平上产生对细胞表型调控的全局扰动，从而可以获得各种性能提升的细胞表型。为此，他们在高、中、低3个频度水平上构建了RNA 聚合酶α亚基（rpoA）的随机突变库，并导入大肠杆菌。在0.9%（V/V）丁醇的压力条件下进行筛选，最终获得优良突变株L33，该菌株在0.9%（V/V）1-丁醇，1.6%（V/V）2-丁醇，0.25%（V/V）1-戊醇和0.6（V/V）3-戊醇条件下培养12 h后，菌体浓度与对照菌株相比分别提高了125%、25%、120%和46%。
1.2.2 真核生物RNA聚合酶相关的转录因子真核生物细胞体内存在3种RNA聚合酶，RNA聚合酶I转录rRNA，RNA聚合酶Ⅱ转录mRNA，RNA聚合酶Ⅲ转录tRNA和其他小分子RNA，在RNA复制和转录中起作用。其中RNA 聚合酶Ⅱ引导的转录中有近75种转录因子和共刺激因子的参与[64]。转录因子spt15属于转录起始复合物部分，它是一种TATA 结合蛋白，与RNA 聚合酶Ⅱ及十几种基本转录因子结合后可以对基因组中绝大多数的mRNA 基因进行转录。因此，对其进行代谢工程操作可同时改变细胞内多个基因的转录水平，从而引起表型的改变[65]。Alper 等[64]通过易错PCR对酿酒酵母（S.cerevisiae）的RNA 聚合酶Ⅱ转录因子TFIID 中TAF25亚基和与TATA序列结合的SPT15亚基进行多轮改组突变修饰，建立二者的突变库后转化入酿酒酵母中，筛选得到的SPT15-300突变株在含有6%（V/V）乙醇的培养基中的生长速率达到了对照菌株的13倍，该菌株在12.5%（V/V）乙醇条件下培养30 h后OD600值为0.6，而对照菌株OD600仅为0.25。
SPT3是酵母菌转录起始共激活因子复合体SAGA的成分之一，负责引导TATA结合蛋白TBP（TATA-binding protein）结合到特定的启动子区。大连理工大学的赵心清等[66]对酿酒酵母中负责胁迫相关基因转录的SAGA复合体的SPT3编码基因进行易错PCR，并将易错PCR产物连接改造的pYES2.0 表达载体并转入S.cerevisiae 4126，构建了突变文库。筛选得到了在高浓度乙醇中耐受性提高的突变株M25，该菌株能在10%（V/V）乙醇中生长较好，并能利用125 g/L的葡萄糖进行乙醇发酵，此时，乙醇产量比对照菌株提高了11.7%。Hou等[67]在S.cerevisiae TH-AADY中共表达SPT3和SPT15的编码基因，结果表明，重组菌株在12%（V/V）乙醇条件下的活菌数与对照菌株相比增加了1 000倍。
1.2.3 cAMP受体蛋白（CRP）CRP是一个能调控100多个基因启动子/操纵子转录激活的因子。cAMP激活CRP后，形成cAMP-CRP复合物，该复合物能与上游启动子区的对称保守的DNA序列TGTGA-N6-TcAcA（被称为CRPbox）结合，而CRP-启动子区DNA的相互作用是调控靶基因的关键[68]。目前，大肠杆菌中的CRP正调控模型研究的非常深入。
2012年，Basak[69]通过易错PCR得到随机突变的crp基因，将其连接到载体pKSCP并电转入大肠杆菌中，利用含有0.25%（V/V）甲苯的培养基进行筛选，得到了3株甲苯耐受菌株M1、M2和M3。其中，M2突变株在0.23%（V/V）的甲苯培养43 h后的生长速率达到了0.51/h，而对照菌株未见生长，此外，M2分别在3.0%（V/V）正己烷，0.23%（V/V）对二甲苯的条件下培养53 h，其OD600均能达到2.25左右，而对照菌株均不能生长。同年Zhang等[70]对crp基因进行易错PCR，并将易错PCR产物连接到载体pKSCP并电转入E. coli DH5α，构建突变文库，最终筛选得到了能耐受高浓度1-丁醇的突变株MT5，该菌株在1.2%（V/V）1-丁醇条件下培养12 h后的生长速率为0.18 h-1，而对照菌株仅为0.09/h，采用2%（V/V）1-丁醇冲击40 min后，突变菌株MT5的细胞存活率为25%，而对照菌株仅为3%。
1.2.4 其他的转录因子 1.2.4.1 耐辐射异常球菌中的IrrEIrrE是来源于耐辐射异常球菌（Deinococcus radiodurans）的一个全局转录因子，能够通过调控一系列代谢途径进而高效提高耐辐射异常球菌 DNA 修复能力和极端辐射抗性[71, 72]。
2010年，Ying等[73]将耐辐射异常球菌中irrE在运动发酵单胞菌（Zymomonas mobilis）异源表达，重组菌株在12%（V/V）乙醇条件下培养60 h后的OD600值为1.57，而对照菌株OD600仅为1.0。经20%（V/V）乙醇处理4 h后，重组菌株的活菌数比对照菌株提高了1 000倍。2011年，Chen等[74]的研究却表现出不一样的结果。野生型irrE基因在大肠杆菌中进行异源表达后不能明显提高菌株对乙醇的耐受性。因此，研究者采用易错PCR技术对野生型irrE基因进行随机突变，将易错PCR产物连接到pMG1载体并电转入E. coli DH5α中，构建容量为106的液体突变文库，在不同乙醇压力下进行筛选，最终得到乙醇耐受性提高的突变菌株E1，该菌株在3%、4%和5%（V/V）乙醇条件下培养23 h后的菌体浓度较含空质粒的对照菌株分别提高了1.6倍，3倍和48倍。经12.5%乙醇冲击1 h后，突变菌株的活菌数较含有野生型irrE菌株和含空质粒的对照菌株分别提高了10倍和100倍。这些结果表明，IrrE作为一个全局转录因子，在微生物耐受性表型的定向进化中具有遗传背景清楚、分子操作手段成熟、效果提高明显等优点，突出表现了其广泛的应用潜力。
1.2.4.2 人工转录因子人工转录因子是通过模拟天然转录因子的结构，由人为设计的DNA结合结构域和功能结构域组成。因此，可以通过改变DNA 结合结构域灵活选择其作用靶位，也可以通过改变效应结构域对目的基因进行激活、抑制、甲基化等改造。人工转录因子（ATF）目前已作为研究抗逆性的一种重要手段，具有应用灵活，方便调控目的基因表达等优点[75]。
2011年，Lee等[76]通过随机组装40个不同的锌指DNA结合蛋白，构建容量为6.4×104的人工转录因子文库，将构建的ATF连接到pACYC载体并转入大肠杆菌中，在不同浓度的丁醇压力下进行突变株的筛选，最终获得丁醇耐受性提高的菌株BT，该菌株在1.5%（V/V）丁醇中培养24 h后OD600值为0.9，而对照菌株OD600仅为0.2。
1.2.4.3 转录因子spo0Aspo0A基因对C. acetobuty-licum孢子的形成和溶剂的产生具有关键的调控作用，对多种稳定遗传的现象具有调控作用，直接或间接影响了细胞发展早期超过500种基因的表达[77]。2003年，Keith等[78]将spo0A基因在C. acetobutylicum进行过表达，结果表明，0.6%（V/V）丁醇条件下，重组菌株相较于对照菌株的丁醇耐受能力明显提高，培养70 h后，重组菌株的葡萄糖利用率为75%，而对照菌株在处理18 h后就停止了对葡萄糖的利用。
2 耐有机溶剂微生物的应用 2.1 全细胞生物转化领域中的应用生物转化体系中，有机溶剂作为反应介质具有以下优点：（1）由于底物在有机介质中的溶解度比水相中大大提高，因此可提高投料浓度；（2）减少基质和产物对酶的抑制作用，提高转化率；（3）有利于产物的分离，提高产物得率。更为重要的是，有机相中进行的微生物催化反应可以得到一些传统方法无法合成的重要物质。因此，耐有机溶剂微生物的发现和创建表现出巨大的应用价值。Faizal等[79]以甲苯为唯一碳源，从活性污泥中分离出一株恶臭假单胞菌P. putida T-57，该菌能利用丁醇、甲苯、二甲苯等多种有机溶剂，能够在甲苯和矿物盐类培养基的配比为10%-90%的范围内生长，并能忍受logP高于2.5的有机溶剂。因此，P. putidaT-57在非水相的全细胞生物转化领域具有重要的应用价值。Suzuki等[80]从土壤中筛选到一株耐二甲苯的Pseudomonas putida ST-491，该菌株能转化石胆酸生成固醇类激素的前体化合物雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮（ADD）。研究者发现，在20%（V/V）二苯醚的双相体系中投加1.33 mmol的石胆酸，转化13 d后的转化率达到60%，与不添加有机溶剂的反应体系相比，ADD的产率提高了9倍。Aono等[81]筛选得到一株耐甲苯的P. ST-200，该菌株可以在含量为10%（V/V）混合有机溶剂（二苯基甲烷/二甲苯=7/3，V/V）的双相体系中转化胆固醇（20 mg/mL），反应8 d后98%的底物被转化，其中，产物胆甾-4-烯-3，6-二酮的产率为37%。随后的研究表明，P. ST-200在含有环辛烷的双相体系中转化胆固醇的速率最快，与不添加有机溶剂的反应体系相比，反应速率提高了5倍，而且使用不同的有机溶剂可以获得不同的转化产物。
2.2 生物燃料和生物基化学品生产上的应用随着石油资源的耗竭和温室效应等环境问题的日益突出，高效利用可再生原料生产能源和化学品已成为全球关注的重点之一。乙醇等有机溶剂是一类重要的平台化学品，被认为是极具发展潜力的生物燃料和生物基化学品[82]，但发酵终点高浓度的醇类物质会对微生物的生长和活性产生强烈的抑制和毒害作用，进而影响发酵效率。因此，开发耐有机溶剂的微生物是解决这一关键问题的有效途径。2003年，Tomas等[19]将热激蛋白（groES和groEL）在C. acetobutylicum ATCC 824中进行过量表达，重组菌株丁醇的产量比野生菌株和对照菌株分别提高 40%和 33%，代谢活性周期比野生菌株延长了215倍。2008年，Hou等[67]在S.cerevisiae TH-AADY中共表达SPT3和SPT15的编码基因，结果表明，重组菌株能在12%（V/V）乙醇中生长较好，并能利用250 g/L的葡萄糖进行乙醇发酵，与对照菌株相比葡萄糖利用率提高了49.03%，乙醇产量提高了8.09%。2012年，Mann等[20]将groESL基因在C. acetobutylicum进行过量表达，研究结果发现，重组菌株的丁醇耐受能力均得到明显提高，重组菌株丁醇产量与对照菌株相比提高了130%。
2.3 在环境污染治理领域的应用有机溶剂对环境的污染具有持久性并有致癌风险，是目前环境污染治理领域的研究难点和热点。常见的处理方法一般包括化学法、物理法和微生物法等，其中，微生物法由于处理费用低、处理效果好、不产生二次污染等优点而表现出巨大的应用潜力。李春荣等[83]从炼油厂污水池底泥中筛选得到到4株有机溶剂耐受菌株，这些菌株对石油污染物均表现出较高的降解能力。将筛选到的节细菌（Arthrob-acte sp.）接种于石油烃质量浓度为10 000 mg/L的液体培养基中，培养20 d后，石油烃的降解率达到90.8%。Paje等[84]从活性污泥中分离得到一个菌株R.sp.33，该菌株在苯浓度为174 ppm的培养基中培养30 d后，菌体的OD600维持在0.6左右，此时苯的降解率达到95%。Tao等[85]将R.erythropolis XP中的dszABCD基因在耐有机溶剂菌株P.putida Idaho中进行过表达，构建得到了耐有机溶剂的脱硫菌株P.putida A4，该菌株在10%（V/V）对二甲苯条件下培养22 h后的菌体浓度比对照菌株提高了26%。同时，该菌株在10%（V/V）对二甲苯体系下培养40 h后能够降解0.485 mmol/L的硫芴，降解率达到97%。
3 展望生物转化正在引起工业生物技术的革命性变化，主要是因为生物催化剂具有周期短、成本低、区域和立体选择性强、反应条件容易控制、对环境友好等优点。其中，生物催化剂的有机溶剂耐受性作为一种非常重要的特性，在生物燃料生产、生物修复、生物医药合成、污水处理等领域具有巨大的应用价值[86]。目前，在工业生产中，一些耐有机溶剂的酶已得到广泛应用，如脂肪酶等[87]，而耐有机溶剂的微生物（完整细胞）还少见报道。但后者在操作上表现出的简便性和灵活性使其成为近年来有机相生物催化领域的研究热点。
微生物有机溶剂耐受性是受到多个基因共同控制的复杂表型，这些基因之间存在着非常复杂的相互作用，且表达容易受到环境的影响。与其他获得耐有机溶剂微生物的方法（如自然分离和筛选、诱变等）相比，利用分子生物学技术对微生物进行遗传改造以提高其有机溶剂耐受性则表现出操作简单、目标定向、效果明显等优点。但对于一些非模式的微生物，其复杂的生理代谢过程和尚不清楚的耐性机制，以及有效的遗传操作工具的缺乏，给分子生物学的改造带来了很大的困难。近年来，随着各种组学技术（基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学等）的发展，研究者对微生物生理代谢过程的理解不断深入和全面，发现了越来越多与微生物有机溶剂耐性相关的蛋白或转录调控因子，这些都为从分子水平上系统全面的揭示微生物有机溶剂耐性机制奠定了基础，也为进一步改造和提高现有菌株的有机溶剂耐受性提供了新的靶标。因此，利用现代分子生物学技术创建耐有机溶剂的微生物将成为工业生物催化剂改造的重要方向。该工作将对促进绿色高效的生物转化和污染环境的生物修复产生重要的社会效益和巨大的经济价值。
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