近年来，随着制药、化工、发酵等工业的迅速发展，产生了大量含氮含硫废水。氮是导致水体富营养化的主要原因，而硫化物会损害人体健康，同时可对金属产生氢脆破坏、也能加速建筑材料和艺术品等非金属材料的老化^{[1, 2, 3]}，须将其去除。一般来说，生物脱氮除硫需要反硝化细菌和硫细菌两种微生物来去除，但近年来研究证明，一些微生物能够以硝酸盐为电子受体将硫化物氧化成单质硫，相较于传统生物法分别进行脱氮、除硫，同步脱氮除硫具有节省耗氧量、缩短反应时间、减少占地面积以及可以产生单质硫利于回收等优点，对于此类能够同时利用硝酸盐和硫化物的微生物，将其称为反硝化脱硫细菌（NR-SOB）^[4]。

目前，对同步脱氮除硫菌的研究主要集中在脱氮硫杆菌（Thiobacillus denitrificans）。Subletee等^[5]使用脱氮硫杆菌对CSTR反应器进行接种发现，其对H₂S具有较高的去除率，Koenig等^[6]利用富集得到的脱氮硫杆菌对以硫磺颗粒为填料的UASB进行接种，结果表明硝酸盐的去除率几乎可达100%，刘玲花等^[7]以脱氮硫杆菌为工程菌，硫与石灰石为填料的滤柱去除地下水中的NO₃^-，结果发现去除率可以达到98%。车轩^[8]、刘宏芳^[9]和范立民^[10]等对脱氮硫杆菌的特性研究得到菌株脱氮效果最佳的初始pH为6.85，温度为32.8℃，生长最快的初始pH为6.90，温度为29.5℃。但对于其他同步脱氮除硫菌的研究还较少，因此本研究拟从实验室稳定运行的反硝化脱硫UASB反应器中富集高效同步脱氮除硫菌，旨在提高反硝化脱硫过程的效率，优化反硝化脱硫工艺性能，还可为此工艺提供生产菌种，促进该工艺的工程化应用。

 用于分离菌株的污泥来自于实验室稳定运行的UASB同步反硝化脱硫反应器中，污泥的湿密度为1.038 g/mL，MLSS=12.03 g/L，MLVSS=7.67 g/L。稳定运行时进水硫化物（以S计）、硝酸盐（以N计）和乙酸盐（以C计）的质量浓度分别为300、132和113 mg/L，当水利停留时间为12 h，进水pH在7.5左右时，去除率分别为91.4%、89.4%和87.3%，单质硫产率为83.1%。

由于硫化物易氧化且不容易控制培养基的pH，故培养基中以硫代硫酸盐代替硫化物，富集培养基成分^[10]如下：0.5% Na₂S₂O₃·5H₂O，0.4% KNO₃，0.05% NH4Cl，0.05% MgCl₂·6H₂O，0.2% KH₂PO₄，0.1% NaHCO₃，0.001%FeSO4·7H₂O，用0.01 mol/L的NaOH调节pH至7左右，121℃灭菌20 min，Na₂S₂O₃·5H₂O滤膜过滤除菌后待培养基灭菌冷却后另外加入。分离培养基和穿刺培养基在富集培养基中分别加入2%和0.5%的琼脂。

脱氮除硫试验培养基为：Na₂S·9H₂O 0.9 g，KNO₃ 0.1 g，NaHCO₃ 1 g，MgCl₂·6H₂O 0.5 g，KH₂PO₄ 2.0 g，蒸馏水1 000 mL，pH调节为7左右，硫化钠在滤膜过滤除菌后待培养基灭菌冷却后加入。

 取1 g反应器内污泥加入到含有99 mL无菌水的培养瓶中，并加入几粒玻璃珠，制成稀释浓度为10^-2的污泥悬浮液，然后从浓度为10^-2的悬浮液中取1 mL到含有9 mL无菌水的培养瓶中即成10-3污泥稀释液，依次重复稀释到10^-8，将10^-2到10^-8污泥稀释悬浮液分别取1 mL接入含有50 mL富集培养基的培养瓶中，封口置于30℃生化培养箱中静置培养3-7 d。将产气多、浑浊度大的富集培养物进行平板划线分离，挑出单菌落进行纯化。

 将纯化分离出的菌株进行脱氮除硫试验，即将初筛菌株接种至含有100 mL脱氮除硫培养基的灭菌锥形瓶中，做2个重复，同时以未接种的培养基作为空白对照，30℃下培养2 d。测定培养前后培养液中的NO₃^--N及S^2--S含量，对两个平行实验的结果取平均值，以空白对照的结果进行校正，然后计算各菌株的NO₃^--N及S^2-的去除率。

 菌株的生理生化实验参照文献[11]进行鉴定，采用Ezup柱式细菌基因组 DNA 抽提试剂盒提取准备鉴定菌株的基因组DNA，以细菌的通用引物27F（5'-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）进行PCR扩增，PCR扩增反应体系为DNA模板（基因组DNA 20-50 ng/μL）0.5 μL；10×Buffer（with Mg²⁺）2.5 μL；dNTP混合物（各2.5 mmol/L）1 μL；DNA聚合酶0.2 μL；正反引物（10 μmol/L）各0.5 μL；加双蒸水至25 μL。PCR扩增条件为：94℃ 4 min；94℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃ 1 min，30个循环；72℃ 10 min，修复延伸；最后4℃终止反应。纯化得到的PCR产物测序委托上海生物工程技术有限公司进行，将测得的16S rDNA序列后将结果输入核糖体数据库（http：//rdp.cme.msu.edu/index.jsp）进行BLAST比对，利用DNASTAR软件中MegAlign建立系统发育树。

将保存备用的菌株H3和H7分别进行两次活化、划线分离至平板表面为均一的菌落，分别用无菌生理盐水洗下菌苔，在250 mL三角瓶中装入100 mL培养液和5%菌悬液（V/V）NO₃^--N和S^2--S设定为40 mg/L和100 mg/L，初始pH值依次调控至为3、4、5、6、7、8和9，在30℃摇床内以120 r/min振荡培养，通过培养液的OD值（λ=600 nm）的测定和NO₃^--N去除率的变化来判断菌体的生长和代谢情况。

同样，在250 mL三角瓶中装入100 mL培养液和5%菌悬液（V/V），NO₃^--N和S^2--S设定为40 mg/L和100 mg/L，初始pH值依次调控7左右，温度依次设定为10、15、20、25、30、35和40℃摇床内以120 r/min振荡培养，通过测定培养液的OD值（λ=600 nm）和NO₃^--N去除率的变化来判断菌体的生长和代谢情况。

 用无菌去离子水配置盐度分别为0%、0.5%、1%、2%、4%和8%的培养基，30℃培养24 h后测定OD600值。

 所有水样经离心后取上清液进行测定，pH采用雷磁PHSJ-4A型pH计测量，NO₃^--N采用紫外分光光度法，NO₂^--N采用N-（1-萘基）-乙二胺光度法，S^2--S采用亚甲蓝法分光光度法。

从反应器内共定向分离出7株产气较多的脱氮除硫菌（编号H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7），分别进行脱氮除硫试验，30℃培养2 d后对NO₃^--N和S^2--S去除率进行测定和计算。结果（表 1）表明，相较于空白灭菌对照的脱氮除硫率，7株菌株都具有一定的脱氮除硫率，其中以H3和H7最为显著，脱氮除硫率分别达到71%、47.8%和65.2%、44.8%。因此将H3和H7作为实验菌株进行进一步的鉴定。

表 1 初筛株的脱氮除硫试验结果/（mg·L^-1）

表选项

H3和H7都为革兰氏染色阴性，在固体琼脂培养基上生长时菌落呈淡黄色，粘液状。H3和H7的生理生化实验结果相似，接触酶和氧化酶测定阳性，不能使明胶液化，可水解淀粉，葡萄糖产酸实验阳性。

图 1为H3和H7的16S rDNA全长PCR扩增结果，用等量的水代替模板作阴性对照无条带出现，证明PCR扩增结果可信，菌株H3和菌株H7的16S rDNA序列长度分别为1 444 bp和1 430 bp，16S rDNA序列测定结果表明菌株H3与Pseudomonas stutzeri CONC12菌株的序列同源性为99.6%，与Pseudomonas sp. Da2菌株的序列同源性为98.8%，菌株H7与Pseudomonas stutzeri CONC12，Pseudomonas stutzeri ST27MN3和Pseudomonas stutzeri 19smn4的序列同源性都为98.9%。

图 1 H3 和H7 的16S rDNA 全长扩增结果

图选项

菌株H3和H7在系统分类中的位置如图 2和图 3所示，结合菌株的菌落特征、生理生化特点以及16S rDNA基因序列，确定H3和H7都为施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）。

图 2 菌株H3 和H7 与参考菌株基于16S rDNA 序列构建的最大似然法系统发育树

图选项

图 3 菌株H3 和H7 与参考菌株基于16S rDNA 序列构建的最大简约法系统发育树

图选项

如图 4和图 5所示，起始pH由3.0增加至9.0，H3和H7的生长量都呈现先升后降的趋势，对图进行非线性拟合，可知H3的生长最适起始pH为6.94，最适反硝化pH为6.77。而H7的生长最适起始pH为6.88，最适反硝化pH为6.56。

图 4 pH 对菌株H3 生长速率和反硝化速率的影响

图选项

图 5 pH 对菌株H7 生长速率和反硝化速率的影响

图选项

如图 6和图 7所示，温度对菌株H3和H7的生长和反硝化活性都有明显的影响，但温度对生长的影响规律并不同于其对反硝化代谢活性的影响。当温度从10℃上升到30℃时，菌体的生长速率和反硝化代谢活性是逐渐增大的；但当温度继续升高后，菌体生长速率逐渐降低，而反硝化代谢活性会继续增加然后降低。可见，菌体H3和H7的最适反硝化温度都高于最适生长温度。对图 5结果进行非线性拟合，可得菌株H3的最适生长温度为30.4℃，最适反硝化温度为31.4℃，而菌株H7的最适生长温度为30.6℃，最适反硝化温度为31.2℃。

图 6 温度对菌株H3 生长速率和反硝化速率的影响

图选项

图 7 温度对菌株H7 生长速率和反硝化速率的影响

图选项

由图 8显示，NaCl浓度低于1%时，对菌株H3和H7生长的影响不大，但当NaCl浓度在1%以上时，菌株H3和H7的生长受到较严重的影响。结果表明，菌株H3和H7都为非耐盐菌株。

图 8 NaCl 浓度对菌株H3 和H7 生长的影响

图选项

同步脱氮除硫是存在于某些菌体内的一种特殊的代谢途径，其原理是以低价硫化合物为电子供体，以硝酸盐氮为电子受体进行电子传递从而获得生长所需的能量。本实验从稳定运行的UASB工艺反硝化脱硫反应器中筛选出2株同步脱氮除硫菌，脱氮除硫率分别可以达到71%、47.8%和65.2%、44.8%。16S rDNA序列测定结果显示H3与H7都与施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）的同源性较高。目前有一些对施氏假单胞的相关报道，如周国勤等^[12]为了有效控制养殖水体中的氮素污染，研究了假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）的生长特性和反硝化活性，最适生长pH为7.0-8.0，最适生长温度为30-35℃。孔瑛等^[13]以二苯并噬吩（DBT）为模型化合物，筛选到一株石油生物脱硫菌Pseudomonas stutzeri，该菌能够在较短时间内将DBT降解为可溶于水的化合物。周晓黎等^[14]从缺氧生物滤池筛选纯化得到一株具有高效反硝化能力的异养菌，经鉴定为施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri），且该菌的亚硝酸盐还原酶能力较强。同样，弓湃等^[15]也曾研究了施氏假单胞菌亚硝酸盐还原酶基因 nirS 的转录特性，李献等^[16]也曾发现Pseudomonas stutzeri菌株能够在厌氧条件下具有脱氮除硫作用，但并未对其生长及反硝化特性进行更深入的研究。本研究筛选出了同步脱氮除硫功能菌并鉴定其种属，确定了其生长和反硝化的最佳条件，但其对氮、硫的去除效果与实际工程应用的要求还有一定的差距，尤其是除硫方面，应该继续通过反应底物的定量分析确定其同步脱氮除硫的机理，来推进该菌株在高浓度含氮含硫废水处理中的应用。

通过对稳定运行的UASB工艺反硝化脱硫反应器中的污泥进行反硝化脱硫菌的筛选分析，得到如下结论：（1）初筛了7株同步脱氮除硫菌，根据脱氮除硫实验结果筛选出2株脱氮除硫率最高的菌株H3和H7，经过菌落形态、生理生化实验和16S rDNA基因序列鉴定，确定两株都为施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri），为非耐盐菌株；（2）菌株H3和H7的生长最适起始pH为6.94和6.88，最适反硝化pH分别为6.77和6.56。H3和H7的最适生长温度为30.4℃和30.6℃，最适反硝化温度分别为31.4℃和31.2℃，两株菌种都为非耐盐菌株。