热休克蛋白（Heat shock proteins，HSPs）又称热应激蛋白，是机体在应激状态下细胞内迅速合成的一组蛋白，具有高度保守性及应激性^[1]，HSPs可分为小分子量HSPs、HSP40、HSP60、HSP70、HSP90 和 HSP110 六个家族，同家族具有较高保守性且广泛存在于微生物、植物、动物和人体内^{[2, 3]}。高温、缺氧、感染、高渗、重金属等应激因素都可诱导HSPs的高表达^[4]。另外，它还可作为分子伴侣和不同的多肽链非特异性结合催化介导蛋白质特定构象的形成，参与体内蛋白质的折叠、装配和转运^[5]。HSP60是分子量约为60 kD的一个HSP家族，除了具有HSPs共同特征外，HSP60还可以作为一个指示危险的信号分子作用于天然免疫系统^[6]，通过激活单核白细胞、巨噬细胞、树状细胞等多种免疫细胞，诱导产生一系列细胞因子，参与免疫反应^{[7, 8, 9]}。

虾夷扇贝（Mizuhopecten yessoensis）隶属于软体动物门（Mollusca）、瓣鳃纲（Lamellibranchia）、翼形亚纲（Pterimorphia）、珍珠贝目（Pterioida）、扇贝科（Pectinidae）、虾夷扇贝属（Mizuhopecten），主要产于日本北部及俄罗斯远东地区的沿海，属于冷水性双壳贝类^{[10, 11]}。20世纪80年代初引入中国后迅速开展增养殖研究和实践。该扇贝生长快、肉质鲜美、营养丰富、经济价值高^[12]，受到广大养殖户和消费者的一致欢迎，经过20多年的探索发展，现已成为中国北方海水养殖业中重要的经济贝类之一^{[13, 14]}。然而，近年来虾夷扇贝养殖过程中出现的夏季高温死亡问题日渐突出，已成为制约其进一步发展的瓶颈。探讨该品种高温条件下的应激机理，是解决其高温死亡问题的基础。

目前，对于 HSP60的报道主要集中在鱼类中，Martin等^[15]对丝足鱼（Trichogaster trichopterus）、鲤鱼（Cyprinus carpio）、虹鳟（Oncorhynchus mykiss）和鲫鱼（Carassius auratus）的研究结果表明，在高温及酸中毒应激下鱼体中枢神经系统中HSP60表达增高；曲朦等^[16]对赤点石斑鱼弧菌应激前后的组织表达特性分析结果为攻毒后鱼体肝脏等免疫相关器官的表达量增加，表明HSP60可通过应激反应调控鱼类的免疫应答；王志新等^[17]对马氏珠母贝HSP60基因表达分析，结果表明HSP60的表达具有一定的组织特异性，在脂多糖刺激后，HSP60表达明显上调。本研究旨在克隆虾夷扇贝HSP60基因全长序列，探讨HSP60基因在虾夷扇贝不同组织中的转录特性，并研究高温对该基因的诱导转录情况，进一步确定HSP60基因在虾夷扇贝热应激过程中发挥的作用，旨在为解决该种养殖过程中的高温死亡问题提供基础数据。

实验用虾夷扇贝取自大连海洋岛海珍品养殖公司，实验前扇贝于10℃海水暂养一周，换水1次/d。

本实验使用天根动物组织总RNA提取试剂盒（离心柱型），经过裂解、挂柱、DNA酶处理、洗脱等步骤提取得到总RNA，电泳检测RNA的完整性，用核酸蛋白分析仪检测RNA纯度及浓度。

取鳃组织提取的总RNA，使用PrimeScript RT-PCR Kit（TaKaRa）进行反转录，合成的cDNA用于基因序列的克隆。分别取上述6种组织样品的总RNA，使用PrimeScript RT reagent Kit（TaKaRa）进行反转录，合成的cDNA用于实时荧光定量PCR检测MyHSP60的mRNA表达量。

根据虾夷扇贝转录组序列设计MyHSP60的特异引物MyHSP60F1/R1（表 1）进行扩增，将PCR产物送大连宝生物公司进行克隆测序，根据测序结果设计3' RACE和5' RACE引物（表 1），用SMARTer RACE cDNA Amplification Kit（Clontech）进行5' RACE和3' RACE，产物进行克隆测序。将上述实验所得测序结果进行拼接得到MyHSP60的cDNA全序列。

表 1 虾夷扇贝HSP60基因克隆和定量PCR所用引物

表选项

使用天根动物组织总DNA提取试剂盒（离心柱型）提取虾夷扇贝DNA，根据MyHSP60的 cDNA序列设计引物MyHSP60F2/R2，以虾夷扇贝DNA为模板，经PCR扩增、测序和比对得到该基因第一内含子位置和序列，根据其第一内含子序列设计MyHSP60GSP1-3引物，使用Genome Walking Kit（TaKaRa）试剂盒进行PCR扩增，产物克隆测序获得MyHSP60基因启动子序列。

用ORFinder 软件（http：//www.ncbi.nLm.nih.gov/gorf/gorf.htmL）寻找基因开放阅读框（ORF）并推测氨基酸序列，用BLAST（http：//www.ncbi.nLm.nih.gov/bLast/BLast.cgi）分析蛋白的氨基酸序列^[18]，在线软件计算蛋白质等电点和分子量（http：//expasy.org/tools/protparam.html）^[19]并搜索特征序列（http：//expasy.ch/prosite）^[20]，用ClustalW的序列比对程序进行多序列比对（http：//www.biosoft.net/sms/index.htmL）^[21]，利用在线启动子分析软件Alibaba2.1（www.gene-regulation.com/pub/programs/html#alibaba2.1）对启动子区域序列进行预测，使用Mega4.1软件包进行N-J进化树的构建，设置Bootstrap重复分析1 000次^[22]。

（1）定量引物设计：根据获得的基因cDNA序列设计虾夷扇贝HSP60基因定量引物QMyHSP60-F/R，根据已有文献确定虾夷扇贝α-tubulin基因为内参基因并合成其定量引物^[23]（表 1）。

（2）定量引物标准曲线相关系数、扩增效率及产物单一性验证：取来自3枚扇贝鳃组织的混合cDNA，将其用EASY Dilution连续5次稀释5倍，得到6个浓度的 cDNA，增加一个空白样本，以上述7个样品为模板，分别用上述两对定量引物进行 Real-time PCR 反应，运行 Real-time PCR 仪上的standardcurve模式计算标准曲线的相关系数和扩增效率，运行dissocition curve程序考察PCR 产物的熔解曲线是否为单峰（单峰表示产物单一）。反应程序为：95℃预变性30 s；95℃变性20 s，58℃退火25 s，72℃延伸25 s，共40个循环，反应体积20 μL。

取9枚虾夷扇贝的外套膜、鳃、闭壳肌、肾脏、肝胰脏及血淋巴，每3个样本等量混合后提取总RNA，这样每种组织形成3个RNA样品，将它们分别反转录成 cDNA，在Real-time PCR仪上，用SYBR Green RT-PCR法测定MyHSP60基因在每种组织中的Ct值，用2^-∆∆Ct 法计算两种基因的相对转录量^[22]。数据分析采用 SPSS13.0 软件中的one way ANOVA 模块^[24]，用 LSD 方法分析不同组织中MyHSP60 mRNA 相对转录量的差异显著性（P<0.05）。

（1）样品升温及采集：升温前一天将扇贝分为试验组和对照组，每组80枚，分别放入不同的水泥池内暂养。试验组扇贝水温升至20℃，对照组扇贝水温为10℃。在升温24 h后分别取对照组和试验组扇贝各9枚，分别取上述6种组织，经液氮冷冻后入-80℃冰箱保存。

（2）升温后各组织中MyHSP60基因转录水平的测定：将升温组样本每3个混为一组，使每一时段形成3个待测样本。提取 RNA，用SYBR PrimeScript RT-PCR Kit进行反转录和QRT-PCR法测定MyHSP60基因在升温24 h后不同组织的Ct值，用2^-∆∆Ct法计算相对转录量。用SPSS13.0中的T-test比较同一组织中对照组和试验组数值差异显著性（P<0.05）。

RNA提取结果显示，用RNAprep pure Tissue Kit提取的各种组织的总RNA比较完整，用核酸蛋白分析仪检测的OD₂₆₀/OD₂₈₀比值在1.86-1.98之间。

通过克隆测序分析，得到了MyHSP60基因的序列全长3 368 bp（GenBank登录号为KP398510），包括长1 731 bp的开放阅读框，编码576个氨基酸。该基因编码蛋白的分子量计算值为277.77 kD，理论等电点为4.86。其中3' UTR 中有典型的加尾信号序列 AATAAA 和 poly（A）尾巴。序列中包含HSP60基因特征序列：高度保守的mt-HSP60特征序列“AAVEEGIVPGGG”，C-末端典型的GGM重复基序 “GGMGGMGGMGGMGGM”，在197-204位置含有ATP结合结构域“ITVKDGKT”。HSP60的核酸序列和推测的氨基酸序列，如图 1所示。

灰色阴影为 HSP60 的3个保守结构域，虚下划线为蛋白激酶C 磷酸化位点，波浪线为酪蛋白激酶 II 磷化位点，下划线代表 N-肉豆蔻酰化位点，双下划线代表多聚 A 加尾信号，*表示终止密码子图 1 HSP60基因的核酸序列和推测的氨基酸序列

图选项

根据第一内含子序列设计了MyHSP60基因步移引物（MyHSP60GSP1-3），利用Genome Walking Kit（TaKaRa）试剂盒进行基因步移，产物经克隆测序获得基因启动子区域序列1 236 bp，该区域包含2个TATA盒、4个CCAAT盒、3个热激元件（heat shock element，HsE），如图 2所示。

灰色阴影和下划线分别表示CCAAT盒、TATA盒顺势调控元件；方框区域表示热激元件；箭头位置表示转录起始点；波浪线表示起始密码子图 2 HSP60基因启动子区域特征

图选项

采用NCBI的BLASTp在GenBank中对MyHSP-60氨基酸序列进行同源检索，利用MEGA4.1对MyHSP60氨基酸序列与另外15个物种的HSP60氨基酸序列进行Neighbor-Joining聚类分析。系统进化分析（图 3）表明，脊椎动物、软体动物和节肢动物HSP60序列各自分开并且形成紧密相关、高度可信的簇，虾夷扇贝HSP60基因归于软体动物的簇。这说明它们起源于同一祖先的基因，这一基因的进化较为符合自然物种的进化规律。

图 3 虾夷扇贝与部分物种HSP60序列系统发育关系

图选项

用定量引物进行QRT-PCR 所得到的标准曲线显示，本实验所设计的HSP60基因和内参基因定量引物进行扩增时，标准曲线相关系数分别为0.998和0.999，扩增效率分别为98.6%和101.3%。两者QRT-PCR产物的熔解曲线均呈现单峰状态，说明PCR产物单一，无非特异性产物，用本研究所设计的定量引物进行QRT-PCR时，定量结果既与模板数量呈现良好的相关性又有严格的特异性，可以用于模板的定量研究。

通过实时PCR技术对MyHSP60基因在升温前后虾夷扇贝的鳃、外套膜、肾脏、闭壳肌、肝胰腺、血6种组织中的表达情况进行检测，结果表明MyHSP60基因在升温前后虾夷扇贝各组织中均有表达。在正常温度下MyHSP60在虾夷扇贝肾脏组织的表达水平最高，肝胰腺次之，外套膜、闭壳肌和血表达量较低。升温后虾夷扇贝肾脏中的表达量升高至对照组的2.5倍，差异极显著（P<0.01），肝胰腺、外套膜、血淋巴和闭壳肌中的转录量升高至2倍左右，差异显著（P<0.05），升温前后腮中的转录量变化不显著（图 4）。

*：差异显著（P<0.05）；**：差异极显著（P<0.01）图 4 虾夷扇贝升温前后不同组织中HSP60基因的相对转录量

图选项

本实验得到MyHSP60基因序列全长3 368 bp和启动子区序列1 236 bp，包括长1 731 bp的开放阅读框，编码576个氨基酸。包含高度保守的mt-HSP60特征序列“AAVEEGIVPGGG”，C末端典型的GGM重复基序“GGMGGMGGMGGMGGM”，还有ATP结合结构域“ITVKDGKT”。通过NCBI申请GenBank登录号为KP398510。Choresh等^[25]研究发现HSP60基因中ATP结合位点在不同物种具有高度的保守性，且该位点是此类蛋白中高度保守的区域之一^[26]。此外，在氨基酸序列不同区域有多个蛋白激酶C磷酸化位点[ST]-x-[RK]和N-肉豆蔻酰化位点G-{EDRKHPFYW}-x（2）-[STAGCN]-{P}，相关酶和其他分子的磷酸化可使细胞膜感应到的信号传递到细胞核，而N-肉豆蔻酰化位点也提示该蛋白与细胞信号传导中的磷酸化和去磷酸化有关。目前已有研究表明，HSP60可激活免疫相关因子IL-12、IL-15、B7、IL-8、MLP、MZP以及NO等，产生天然免疫反应以抵抗细菌的入侵^[7]，HSP60在免疫反应中的信号传导作用可能依赖于氨基酸序列中丰富的功能位点。

在系统进化分析中，脊椎动物、软体动物和节肢动物HSP60序列各自分开并且形成紧密相关、高度可信的簇，虾夷扇贝HSP60基因归于软体动物的簇。这说明它们起源于同一祖先的基因。可见，这一基因的进化较为符合自然物种的进化规律。在软体动物中，目前有关HSP60基因的报道比较少，尚缺乏其他软体动物的HSP60相关基因信息。虾夷扇贝HSP60的核苷酸序列和氨基酸序列与三角帆蚌（Hyriopsis cumingii）、霸王莲花青螺（Lottia gigantea）的HSP60 高度同源，高于与其他物种的同源性。因此从虾夷扇贝中克隆到HSP60基因序列，能丰富软体动物的HSP60的基因信息，为今后深入研究虾夷扇贝HSP60以及其他软体动物HSP60基因提供基础材料。

关于MyHSP60基因组织表达情况，本研究中，虾夷扇贝肾脏等6个组织中均有HSP60基因的表达，但表达水平存在差异，在肝胰腺、鳃和肾脏中的表达水平较高，体现出虾夷扇贝中HSP60的表达具有一定的组织特异性。软体动物肾脏、肝胰腺不仅是代谢最旺盛器官，同时也是发挥免疫作用的重要器官，HSP60在肾脏和肝胰腺中高表达，可能是HSP60参与了虾夷扇贝蛋白质和酶类分子的合成、应激反应以及细胞的增殖等过程。在作为呼吸器官的鳃中的高表达可能直接或间接说明HSP60在抵抗外界各种环境刺激时发挥较大作用。这一结果和王志新等^[17]对马氏珠母贝HSP60基因表达分析结果一致。已有研究表明，热休克蛋白与生物受到的胁迫之间有着极为重要的关系。高温、缺氧、感染、高渗、重金属等应激因素都可诱导热休克蛋白的高表达^[27]。在应激状态下，这类蛋白可通过保护线粒体中呼吸链的完整性和抑制凋亡通路直接或间接地保护细胞，提高细胞的耐受力，并帮助变性、不可溶的凝聚蛋白恢复天然构象^{[28, 29]}。

本研究得到MyHSP60基因序列全长3 368 bp，包括长1 731 bp的开放阅读框，编码576个氨基酸，该基因通过NCBI申请GenBank登录号为KP398510。利用基因步移技术获得MyHSP60基因启动子区域序列1 236 bp，其中包含2个TATA盒、4个CCAAT盒、3个热激元件。基于MyHSP60基因氨基酸序列构建的系统进化树与传统物种进化规律基本吻合。通过实时PCR检测结果发现HSP60在虾夷扇贝各组织中均有表达，在正常温度下MyHSP60在虾夷扇贝肾脏组织的表达水平最高，肝胰腺和腮中表达次之，外套膜、闭壳肌和血表达量较低。升温后虾夷扇贝在肾中的表达量升高极显著（P<0.01），在肝胰腺、外套膜、血淋巴和闭壳肌中表达量增高显著（P<0.05）。结果表明，MyHSP60基因在虾夷扇贝热应激过程中发挥一定作用。