1993年，ASR（Abscisic acid-stress-ripening）基因首次在番茄中被发现^[1]，随后多个物种的ASR基因被分离到。有趣的是，ASR基因在拟南芥基因组中不存在^{[2, 3]}。ASR基因编码的蛋白具有转录因子和LEA（Late embryogenesis abundant protein）蛋白的基本特征。ASR基因的功能主要是参与调控植物生长发育、衰老、果实成熟、激素信号转导以及对逆境胁迫的应答^{[2, 3]}。

多个物种的ASR基因都被报道受水分胁迫（干旱、渗透、脱水胁迫）以及ABA诱 导^{[2, 3]}，ASR基因也因此而得名。2005年Yang等^[4]研究表明，百合的ASR基因（LLA23）受ABA、脱水胁迫和高盐胁迫诱导。随后，在拟南芥中过量表达百合ASR基因（LLA23）发现，LLA23过表达株系提高了对干旱胁迫的耐受性。生理学分析表明，在干旱处理条件下，转基因株系具有较低的水散失率；在甘露醇渗透胁迫处理条件下，转基因株系的发芽率高于野生型。此外，LLA23的过量表达能够改变转基因植株中ABA和胁迫相关基因的表达水平。这一结果首次从遗传学上证明了ASR基因参与调控ABA信号转导，并能增强植物对干旱胁迫的耐受性。随后，来自于番茄、香蕉、玉米、水稻、小麦的ASR基因都被报道在提高植物抗旱性上发挥着重要作用^{[5, 6, 7, 8, 9, 10]}。这些研究结果证明了ASR基因通过减少水分散失、促进渗透平衡、减少细胞损伤、降低活性氧积累、诱导抗氧化系统等生物学过程增强植物对干旱和渗透胁迫的耐受性^{[5, 6, 7, 8, 9, 10]}。所以可以肯定，ASR基因参与ABA信号转导，并能提高植物对干旱胁迫的耐受性，但是其作用机制仍然有待于进一步研究。

木薯（Manihot esculenta Crantz）是三大薯类作物之一，全球第六大粮食作物，被誉为“淀粉之王”，是世界近8亿人口赖以生存的粮食。在我国，木薯作为新型能源、工业原料和潜在的粮食作物，具有良好的发展潜力，是热带和亚热带地区最重要的经济作物之一。木薯具有耐旱的生物学特性，一般情况下，木薯能够忍耐4-6个月的干旱胁迫，是一种典型的耐旱作物^[11]。木薯特殊的耐旱能力表现在通过丰富的根系从土壤深层吸收水分（地下2 m），通过快速的气孔关闭减少水分散失，通过老叶片脱落减少水分消耗，最终提高木薯对水分的利用效率，从而使木薯具有耐旱的特性。而且，在干旱胁迫后恢复浇水，木薯能够快速地再生新叶片，维持正常的新陈代谢，并补偿生物量^[12]。木薯在干旱胁迫下对水分的吸收、气孔运动、叶片脱落等生物学过程都是受ABA控制的关键生物学过程。因此，Okogbenin等^[12]提出ABA生物合成及信号转导可能是调控木薯特殊耐旱性的关键途径之一。最近的研究表明，木薯在适应干旱胁迫的过程中可能通过减缓生长，从而延长对干旱胁迫的耐受时间；或者通过老叶片的脱落维持一定的生长，从而抵抗干旱胁迫^[13]。虽然，近年来的研究取得了一定的研究进展，但是对木薯耐旱机理的研究还不深入。本研究从木薯克隆第一个ASR基因（MeASR），分析MeASR的细胞定位，并研究该基因在干旱和ABA处理的表达水平，旨在研究木薯中的干旱胁迫应答基因，为进一步解析木薯的耐旱机理提供参考。

实验所用木薯品种为KU50，由中国热带农业科学院热带生物技术研究所提供。

将木薯茎秆用刀切成约10 cm长的小节，每一小节含数个芽眼。将茎秆插入含有营养土和蛭石的盆中，待其发芽、生根。将生长两个月、且长势一致的木薯幼苗作为供试材料，以不处理的木薯幼苗作为对照，设置两个处理组：（1）甘露醇处理组共24颗木薯幼苗，每个样品3颗，用300 mmol/L甘露醇对木薯幼苗进行0 h、2 h、6 h、3 d、14 d、18 d、24 d和36 d灌根处理；（2）ABA处理组共21颗木薯幼苗，每个样品3颗，用100 µmol/L ABA对木薯幼苗进行0、2、6、10、24、48和72 h（甘露醇、脱落酸等生化试剂购自上海生工生物工程有限公司）喷施。取每个处理的木薯幼苗叶片用液氮冷冻，并放入-80℃超低温冰箱保存。

分别取1.2.1不同处理后的幼苗叶片，按照RNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司）的使用方法提取木薯总RNA。同时，利用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas公司）将提取的总RNA反转录成cDNA，并于-20℃保存备用。

以获得的cDNA第一链为模板，设计正向引物P1：5'-ATGGCAGAAGAGAATAAGCA-3'和反向引物P2：5'-TTAAAAGAGATGGTGATGCTT-CT-3'进行PCR扩增。反应体系为：Taq DNA聚合酶（康为世纪生物公司）0.5 µL，dNTP 0.5 µL，10× Buffer 2 µL，上下游引物各0.5 µL，cDNA 模板1 µL，ddH₂O 15.5 µL；反应程序为：94℃预变性5 min；94℃变性20 s，48℃退火20 s，72℃延伸30 s，35个循环；72℃延伸10 min。PCR扩增产物经回收、连接、转化后，挑取单克隆在LB液体培养基中培养，并进行PCR鉴定。然后将已鉴定的阳性克隆送华大基因生物科技公司测序。

利用DNAMAN 软件和BLAST（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）进行序列比对和保守结构预测；利用ORF Finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）及GENSCAN（http：//genes.mit.edu/GENSCAN.html）进行基因开放阅读框预测；利用MEGA 5.0软件构建进化树。

根据MeASR基因的ORF序列设计带有酶切位点NcoＩ/SpeＩ且不含终止子的引物：P3：5'-CATGCCATGGCGATGGCAGAAGAGAATAAGCA-3'；P4：5'-GGACTAGTAAAGAGATGGTGATGCTTCT-3'。从正常生长两个月的木薯幼苗叶片cDNA中扩增MeASR基因的开放阅读框，将扩增产物回收后连接到克隆载体pMD18-T上，获得重组质粒，阳性克隆测序正确后，用NcoＩ/SpeＩ进行双酶切并回收目的片段。同时，利用 NcoＩ/SpeＩ双酶切pCAMBIA1304载体，并回收载体片段。利用T4连接酶将目的片段和载体片段进行连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α后，挑取单克隆扩大培养，经PCR和质粒双酶切验证后，进行测序分析，构建成植物表达载体pCAMBIA1304-MeASR-GFP。将测序正确的阳性克隆的质粒转入农杆菌LBA4404中。利用农杆菌介导的瞬时转化法将pCAMBIA1304-MeASR-GFP导入洋葱表皮细胞中，随后将洋葱表皮放在铺有滤纸的MS培养基上，25℃暗培养16-24 h，然后制作装片，通过FluoView^TM FV1000激光扫描共聚焦显微镜观察荧光信号。

根据TaKaRa实时荧光定量标准说明书设计qRT-PCR引物（MeASR：P5 5'-TCACAAGGAAGGCGAAGA-3'；P6：5'-GCAAAGGC-AAATCCAATA-3'；MeEF1引物：P7：5'-TGAACC-ACCCTGGTCAGATTGGAA-3'，P8：5'-AACTTGGG-CTCCTTCTCAAGCTCT-3'），引物均由上海生工生物工程有限公司合成。为了保证引物的特异性，引物设计在非保守区域，PCR产物的长度维持在300 bp以内，并进行了测序分析。以1.2.2中得到的cDNA为模板，以木薯MeEF1基因为内参进行qRT-PCR分析。实时荧光定量PCR 采用SYBR Green Ⅰ试剂盒（TaKaRa公司），按照操作说明在Mx 3005P荧光定量PCR仪（吉泰生物科技有限公司）上进行。荧光定量PCR的反应程序：95℃预变性3 min；95℃变性7 s，55℃退火10 s，72℃延伸15 s，循环40次。荧光定量PCR的反应体系：SYBR GreenⅠ10 µL，ROX 0.4 µL，引物0.5 µL，cDNA模板1 µL，ddH2O 7.6 µL。每个样品的qRT-PCR实验都在相同的反应体系下进行3次生物学重复。结果分析计算采用2^-ΔΔCt 法^[14]：

ΔΔCt=（C_T，Target-C_T，Actin）_{Time x}-（C_T，Target-C_T，Actin）_{Time 0}。

根据木薯数据库中的序列信息，发现一个cDNA序列与ASR家族基因具有较高的同源性。利用P1/P2引物对正常生长两个月的木薯幼苗叶片cDNA进行PCR扩增，克隆该基因的cDNA全长序列（图 1）。将扩增产物插入T载体并测序后，经GENSCAN、Blast和ORF Finder分析发现，该cDNA 序列中存在一个330 bp的开放阅读框（ORF），编码109个氨基酸，将其命名为MeASR。BLASTN分析表明，MeASR与大豆的ASR基因（NM_001250558）具有较高的一致性（84%）。多序列比对分析（图 2）表明，该基因编码的氨基酸序列具有一个保守的组氨酸富集区，两个丙氨酸富集区，一个豆蔻酰化位点。进化树分析（图 3）表明，MeASR蛋白与番茄SlASR4亲缘关系较近。

M：DNA Marker；1：MeASR 基因的cDNA全长图 1 MeASR基因的cDNA全长电泳图

图选项

ABA/WDS结构域用方框表示；豆蔻酰化位点用星号表示；组氨酸富集区和丙氨酸富集区用单横线表示图 2 MeASR与其它ASR的多序列比对分析

图选项

图 3 MeASR与水稻、番茄、玉米ASR家族成员的系统进化树

图选项

利用农杆菌介导的瞬时转化法将构建成功的植物表达载体pCAMBIA1304-MeASR-GFP和pCAMBIA1304空载体分别导入洋葱表皮细胞，25℃暗培养24 h后，在激光共聚焦显微镜下观察绿色荧光蛋白信号在细胞内的分布，结果（图 4）显示，pCAMBIA1304-MeASR-GFP仅在洋葱表皮细胞的细胞核中表达，而pCAMBIA1304空载体在细胞膜、细胞质和细胞核中都有分布。这些结果表明MeASR蛋白定位在细胞核上。

A：pCAMBIA1304的绿色荧光信号图；C：pCAMBIA1304的明场图；B：A与C的叠合图；D：MeASR-GFP的绿色荧光信号图；F：明场图；E：D与F的叠合图图 4 MeASR亚细胞定位分析

图选项

利用实时荧光定量PCR的方法研究了木薯在渗透胁迫及ABA处理下MeASR基因的表达水平。结果表明，经甘露醇处理2 h和6 h，MeASR表达水平显著增强，处理3-18 d轻微下降，处理时间延长至24 d时其表达水平最高（图 5-A）。在ABA处理10 h，MeASR表达无显著变化，在处理24 h 和48 h显著增强（图 5-B）。这些结果表明，MeASR能够在转录水平受渗透胁迫和ABA诱导。

A：甘露醇处理；B：脱落酸处理。误差线表示4次重复的标准差；* 表示t-检验的显著性分析（*P<0.05；**P<0.01）图 5 MeASR基因在甘露醇和脱落酸处理下的表达分析

图选项

干旱胁迫是影响植物生长发育以及作物产量和品质的重要环境因子。植物对干旱胁迫的应答主要是通过对胁迫信号的感知和转导，促进胁迫相关基因的表达和蛋白质的合成，导致生理生化的变化和代谢物的合成，从而降低胁迫所导致的伤害。植物对干旱胁迫的响应是一个非常复杂的过程，其中转录调控是植物应答干旱胁迫的一种重要方式。所以，转录因子在植物对干旱胁迫的应答过程中起着至关重要的作用^[15]。ASR蛋白具有转录因子和LEA蛋白的基本特征。一些研究表明ASR蛋白定位在细胞核中，具有转录激活活力，能够以Zn²⁺依赖的方式与DNA结合，从而激活转录。然而，ASR蛋白也被认为属于第7类和胚胎发育晚期丰富蛋白（Late embryogenesis abundant protein，LEA），具有分子伴侣功能，能够对细胞进行直接地保护^{[2, 3]}。因此，可以推测，不同的ASR家族成员可能具有不同的生化特征。亚细胞定位分析表明，MeASR蛋白定位在细胞核，这与转录因子的特征相符，这一结果与小麦TaASR1和葡萄ASR定位在细胞核中的结果一致^{[9, 16]}，为进一步研究MeASR转录因子的基本特征提供参考。

ASR家族基因被报道广泛地参与植物对干旱胁迫的应答，并且多个物种的ASR基因都被报道在提高植物抗旱性上发挥着重要作用。而且，值得注意的是，在玉米中过表达ZmASR1发现，在正常生长条件下转基因株系的产量比野生型高7%-17%。而且，在干旱胁迫下，ZmASR1转基因植株仍然能够维持这一产量性状^[7]。一些ASR家族基因的进化被证明是植物对干旱性状正向选择的结果。所以，ASR基因是作物抗性育种较为重要的候选基因。本研究分析了MeASR基因在干旱及ABA处理下的表达模式，结果表明该基因能够在转录水平显著受干旱和ABA诱导。这一研究结果与番茄ASR1、水稻OsAsr1、香蕉MpASR、玉米ZmASR1、小麦TaASR1等基因在干旱及ABA处理下的表达模式相似^{[5, 6, 7, 8, 9, 10]}。而且，这些基因已经从遗传学上被证明能够提高植物对干旱胁迫的耐受性。因此，木薯MeASR可能具有抗旱功能。

本研究克隆了木薯ASR基因MeASR，亚细胞定位结果表明MeASR蛋白定位在细胞核上。此外，利用实时荧光定量PCR对MeASR基因在干旱及ABA处理下的表达模式也进行了分析，结果表明该基因在转录水平受渗透胁迫和ABA诱导。