吉林大学学报(医学版)  2018, Vol. 44 Issue (04): 839-844

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高丽君, 何程远, 李盈诺, 巴宏宇, 李梓僮, 夏薇, 李明成, 苑广信, 张丽华, 艾金霞
GAO Lijun, HE Chengyuan, LI Yingnuo, BA Hongyu, LI Zitong, XIA Wei, LI Mingcheng, YUAN Guanxin, ZHANG Lihua, AI Jinxia
基于双重PCR技术的鹿茸及其伪品DNA指纹特征和鉴定
Characteristics and identification of DNA fingerprint of velvet antler and its counterfeits based on duplex PCR technique
吉林大学学报(医学版), 2018, 44(04): 839-844
Journal of Jilin University (Medicine Edition), 2018, 44(04): 839-844
10.13481/j.1671-587x.20180428

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收稿日期: 2017-10-30
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高丽君, 何程远, 李盈诺, 巴宏宇, 李梓僮, 夏薇, 李明成, 苑广信, 张丽华, 艾金霞. 基于双重PCR技术的鹿茸及其伪品DNA指纹特征和鉴定[J]. 吉林大学学报(医学版), 2018, 44(04): 839-844.
GAO Lijun, HE Chengyuan, LI Yingnuo, BA Hongyu, LI Zitong, XIA Wei, LI Mingcheng, YUAN Guanxin, ZHANG Lihua, AI Jinxia. Characteristics and identification of DNA fingerprint of velvet antler and its counterfeits based on duplex PCR technique[J]. Journal of Jilin University (Medicine Edition), 2018, 44(04): 839-844.
基于双重PCR技术的鹿茸及其伪品DNA指纹特征和鉴定
高丽君1 , 何程远1 , 李盈诺2 , 巴宏宇1 , 李梓僮2 , 夏薇1 , 李明成1 , 苑广信2 , 张丽华3 , 艾金霞1     
1. 北华大学医学检验学院临床血液与体液检验教研室, 吉林 吉林 132013;
2. 北华大学药学院药物分析 教研室, 吉林 吉林 132013;
3. 吉林雷宁食品药品检测技术服务有限公司, 吉林 吉林 132013
收稿日期: 2017-10-30
基金项目: 吉林省科技厅重点科技成果转化项目资助课题（20160307030YY，20170307001YY）；吉林省发改委产业技术研究与开发项目资助课题（2015Y077）；吉林省教育厅"十二五"科学技术研究项目资助课题（吉教科合字[2015]D143）；国家级大学生创新创业训练计划项目资助课题（201711923018）；吉林省科技厅重点科技攻关项目资助课题（20160204004NY）
作者简介: 高丽君(1969-), 女, 吉林省吉林市人, 副教授, 医学硕士, 主要从事中药DNA检验方面的研究。
通信作者: 艾金霞, 副教授, 硕士研究生导师(Tel:0432-64608115, E-mail:1047085280@qq.com)
[摘要]: 目的: 分析鹿茸线粒体细胞色素b（Cytb）和细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ（COⅠ）基因特异性，建立双重PCR技术鉴别鹿茸真伪的分子指纹特征。方法: 利用碱变性法提取梅花鹿茸、马鹿茸、驯鹿茸和新西兰鹿茸的基因组DNA，应用引物设计软件Premier 5.0针对Cytb和COⅠ分别设计特异性引物（分别为Cytb1、2和COⅠ1、2、3），采用单一及双重引物分别进行PCR扩增，筛选特异性强的引物，确定最佳PCR反应条件。结果: 采用碱变性法提取的鹿茸基因组DNA片段长度为23 000bp，DNA纯度即A（260）/A（280）为1.80±0.02；应用单一引物进行PCR扩增无法鉴定鹿茸的真伪，而引物Cytb 1和COⅠ1组合后，解链温度为58℃时，梅花鹿茸（吉林、安徽）、马鹿茸均能扩增出395和525bp大小的2个片段，而驯鹿茸和新西兰鹿茸均未能扩增出相应片段；采用该提取方法及最优化的PCR反应条件，对市售样品进行检测，检测结果与实际情况完全一致。结论: 双重PCR技术可从分子水平鉴别鹿茸的真伪，该方法特异性高、实用性强，且简便快捷，在鹿茸真伪鉴别方面具有较高的应用价值。
关键词: 鹿茸    细胞色素b    细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ    双重聚合酶链反应    DNA指纹    
Characteristics and identification of DNA fingerprint of velvet antler and its counterfeits based on duplex PCR technique
GAO Lijun1, HE Chengyuan1, LI Yingnuo2, BA Hongyu1, LI Zitong2, XIA Wei1, LI Mingcheng1, YUAN Guanxin2, ZHANG Lihua3, AI Jinxia1     
1. Department of Clinical Hematology and Fluid Examination, School of Laboratory Medicine, Beihua University, Jilin 132013, China;
2. Department of Pharmaceutical Analysis, School of Pharmacy, Beihua University, Jilin 132013, China;
3. Jilin Leining Food and Drug Testing Services Co. Ltd, Jilin 132013, China
[Abstract]: Objective: To analyze the gene specificities of mitochondrial cytochrome b (Cytb) of velvet antler and cytochrome C oxidase subunit Ⅰ (COⅠ), and to establish the duplex polymerase chain reaction(PCR)technique for identifying the molecular fingerprint characteristics of velvet antler. Methods: A modified alkaline method was used to extract the genomic DNA from the pilose antler of Cervus Nippon Temminck, Cervus elaphus Linnaeus, Rangifer tarandus and New Zealand deer.Based on Cyt b and COⅠ genes, the specific primers were designed with Premier 5.0 software(Cytb1, 2 and CO Ⅰ 1, 2, 3);PCR amplification was carried out by the single and duplex primers, and the best PCR conditions and highly specific primers were determined. Results: The length of genomic DNA fragment extracted by the modified alkaline method was 23 000bp, and the DNA purity was 1.80±0.02;PCR amplification by the single primer did not identify the authenticity of velvet antler; when Cytb1 and COⅠ1 were applied to PCR, the annealing temperature was 58℃, the fragments of 395 bp and 525 bp were specifically amplified from both Cervus Nippon Temminck and Cervus elaphus Linnaeus antler(Jilin, Anhui), but no fragment appeared for the Rangifer tarandus and New Zealand pilose antler. By using the determined extraction method and the optimal PCR condition, the commercial velvet antlers were carried out and the test results were identical with the reality. Conclusion: The duplex PCR technique can distinguish the authenticity of velvet antler from the molecular level.The method is good in specificity, practicability, and simplicity, and has high application value in the identification of velvet antler.
Key words: velvet antler     cytochrome b gene     cytochrome C oxidase subunit Ⅰ     duplex polymerase chain reaction     DNA fingerprint    

鹿茸是我国名贵中药，《本草纲目》中记载：鹿茸具有生精补髓、养血益阳和强健筋骨等功效。我国2015年版《中华人民共和国药典》中指出：鹿茸为鹿科动物梅花鹿(Cervus Nippon Temminck)或马鹿(Cervus elaphus Linnaeus)的雄鹿未骨化密生茸毛的幼角，前者习称“花鹿茸”，后者习称“马鹿茸”[1]。目前，鹿茸药材品种繁多、成分复杂，市场上易混品和伪品较多，再加之我国中药现行质量标准中检验方法的局限性，很难对同属的鹿茸真伪做出准确判断。目前，国内外多采用红外线、紫外线、化学和液相色谱等方法鉴别中药，这些方法虽为鹿茸药材的鉴定提供了一定的参考依据，但均存在一定的不足，例如对同科、同属、不同种的易混药材鉴别的专属性差，尤其对化学结构相似物质鉴别的特异性不强，而且操作繁琐、费用高，很难满足对中药材、尤其对中药易混品种的鉴定[2]。

分子遗传学标记技术为中药及其伪品的鉴别提供了一条新的途径[3]。线粒体DNA(mitochrondrial DNA，mtDNA)作为遗传信息的载体，是研究动物起源进化及对群体进行遗传分析的理想对象。鹿科动物mtDNA呈共价闭合环状，是细胞核外具有自主复制、转录和翻译能力的遗传物质，与核DNA比较，因其具有分子结构简单、碱基突变率高、不同区域进化速度存在差异等特点，使mtDNA成为一种有效的遗传标志[4]。线粒体细胞色素b(cytochromeb, Cytb)基因进化速度适中，是分析种内及种间遗传多样性和进化关系的适当的DNA片段，可应用于生物的分类、系统发育和遗传多样性的研究[5-6]。细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(cytochrome C oxidase subunit 1，COⅠ)是线粒体中约650bp的一段序列，其基因进化速度比Cytb基因更快，因此可以用来区分进化非常紧密的物种[7-8]。

本课题组建立了基于鹿科动物mtDNA的Cytb和COⅠ具有特异性鉴别意义的基因序列[9-10]。在此基础上，利用Cytb及COⅠ的特性，设计了用于鉴定鹿茸的双重特异性引物，即在同一PCR反应体系中同时检测梅花鹿、马鹿、新西兰鹿和驯鹿鹿茸，达到快速、准确鉴定鹿茸真伪的目的，以期为中药真伪的鉴别提供又一新的方法。

1 材料与方法 1.1 材料、主要试剂和仪器

本实验所用的鹿茸共11个批次。梅花鹿茸(吉林)由中国食品药品检定研究院提供，马鹿茸和驯鹿茸由吉林省双阳鹿养殖基地提供，新西兰鹿茸和梅花鹿茸(安徽)购自吉林省吉林市汇丰参茸行，市售鹿茸样品P1、P2、P3、P4、P5和P6购自吉林省吉林市参茸市场。样品真伪由吉林省吉林市食品药品检验所鉴定。DNA混合酶购于北京天根生物技术有限责任公司，批号：Lot#Q5328；琼脂糖购于北京康润诚业生物科技有限公司。GeneAmp R PCR System2700 Applied Biosystem(美国Perkin-Elmer公司)，UV WHITE2020D凝胶成像分析系统(美国Bio-rad公司)。

1.2 鹿茸样品基因组DNA的提取

采用碱变性方法提取基因组DNA[11]：①取鹿茸样品剪碎至1 mm×1 mm×1 mm左右，称取0.1g样品加入0.01mmol·L-1Tris-HCl 500 μL、10%SDS 30 μL和20 g·L-1 PK15 μL，混匀后置于56℃水浴振荡16~18h；②取出，加入饱和NaAC 500 μL，轻轻振荡10 min，4℃、11000 r·min-1离心10 min，取上清液加入等体积的异丙醇，-20℃放置1h；③ 4℃、11000 r·min-1离心10 min，弃上清液，向沉淀中加入70%乙醇500 μL充分冲洗，4℃、11000r·min-1离心10 min，留沉淀室温干燥(必要时可洗涤2次)；④加入80μL双蒸水溶解DNA，即为鹿茸基因组DNA。将所获得的基因组DNA样本经适当稀释，采用紫外分光光度仪测定吸光度(A)值，计算A(260)/A(280)比值。采用0.8%琼脂糖凝胶电泳，采用凝胶成像分析系统观察和分析结果。

1.3 PCR扩增

① 引物设计：查找GenBank中鹿茸线粒体Cytb及COⅠ的已知序列，采用Premier 5.0软件进行引物设计，采用Oligo 6.0引物设计软件进行验证。针对Cytb设计了2对引物(Cytb1和Cytb2)，COⅠ设计了3对引物(COⅠ1、COⅠ2和COⅠ3)。碱基序列及扩增的片段长度见表 1。②PCR反应体系：以提取的鹿茸基因组DNA为模板，灭菌双蒸水作为阴性对照进行PCR反应。反应体系25 μL，在150 μLPCR反应管中依次加入DNA混合酶12.5 μL，Cytb或COⅠ上、下游引物各1 μL，模板0.5 μL，双蒸水10 μL。③反应程序：单一PCR：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，退火温度30s，72℃延伸30s，30个循环后于72℃延伸10 min。PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳，90 V、40 min，100~600 bpDNA Marker作参照，凝胶成像分析系统观察和分析结果。④双重PCR扩增：在反应体系中加入Cytb及COⅠ2对引物，上、下游引物各1 μL，双蒸水8 μL，其余条件同单一PCR扩增的反应条件。检测方法与单一PCR扩增的检测方法相同。

表 1 引物碱基序列和扩增片段的长度 Table 1 Primer sequences and lengths of amplified fragments
Primer Sequence(5′-3′) Expected length(bp)
Cytb1 Upstream TTTTCCTCTGTCACCCAT 395
Downstream ATAGCGAGTGCTGCGATG
Cytb 2 Upstream ATACATACACGCAAACGG 342
Downstream ATAGCGAGTGCTGCGATG
COⅠ1 Upstream ACACCCTAATCAACTGGC 525
Downstream AAGAAAGAAGGAGGGAGG
COⅠ2 Upstream TGAGCAGGCATAGTAGGA 194
Downstream ATGGGCTCAGGTGATAGA
COⅠ3 Upstream AGACCCTAATCAACTGGC 257
Downstream TAGAATGGCTGAGTGAAG
表选项
1.4 PCR反应条件的优化

① PCR反应中特异引物的确定：分别应用Cytb及COⅠ单一引物逐一实验，反应条件及程序同1.3中所述。②PCR反应中最适解链温度的确定：分别设置单独PCR扩增Cytb1及COⅠ1的最适解链温度分别为50℃和56℃；双重PCR扩增解链温度分别为57.5℃、58℃、58.5℃、59℃、60℃和61℃, 其他条件不变。

1.5 市售鹿茸样品的检测

按照1.2中的方法提取鹿茸DNA，采用优化的双重PCR反应体系和反应条件对市售鹿茸进行鉴定。

2 结果 2.1 鹿茸样品基因组DNA琼脂糖凝胶电泳特征

采用碱变性法从所有鹿茸及其伪品中提取DNA，梅花鹿茸(吉林、安徽)、马鹿茸、驯鹿茸和新西兰鹿茸经琼脂糖凝胶电泳均可见1条片段长度约为23 000bp的单一条带(图 1)。

M:546 bp DNA marker; Lane1:Cervus Nippon Temminck antler(Jilin); Lane 2:Cervus elaphus Linnaeus antler; Lane 3:Rangifer tarandus antler; Lane 4:Cervus Nippon Temminck antler(Anhui); Lane 5:New Zealand pilose antler. 图 1 鹿茸样品DNA琼脂糖凝胶电泳图 Figure 1 Electrophoregram of agarose gel of genomic DNA extracted from velvet antlers
图选项
2.2 鹿茸样品基因组DNA的紫外光谱分析

采用碱变性法提取鹿茸基因组DNA，测得样本A(260)/A(280)值为1.80±0.02(表 2)，说明此样本无RNA和蛋白质污染。

表 2 5种鹿茸的纯度和浓度检测结果 Table 2 Results of detection of purities and concentrations of five kinds of velvet antlers
Sample A(260) A(280) Purily [ρB /(μg·L-1)]
Cervus Nippon Temminck antler (Jilin) 0.382 0.211 1.809 1.80
Cervus elaphus Linnaeus antler 0.368 0.210 1.750 1.81
Rangifer tarandus antler 0.351 0.203 1.732 1.78
Cervus Nippon Temminck antler (Anhui) 0.386 0.215 1.743 1.82
New Zealand pilose antler 0.374 0.212 1.763 1.82
表选项
2.3 PCR反应中特异性引物的选择

分别应用Cytb和COⅠ单一引物进行多次实验，结果显示：应用单一引物无法鉴定鹿茸正品和伪品。将Cytb 1、Cytb 2和COⅠ1、COⅠ2、COⅠ3分别进行不同的组合，即将Cytb和COⅠ以不同的组合形式同时加入PCR反应体系，最后确定Cytb1和COⅠ1引物组合后特异性强，能区分鹿茸正品及伪品(图 2)。

M:100 bp DNA marker; Lane 1:Negative control; Lane 2:Cervus Nippon Temminck antler(Jilin); Lane 3:Cervus elaphus Linnaeus antler; Lane 4:Rangifer tarandus antler; Lane 5:Cervus Nippon Temminck antler(Anhui); Lane 6:New Zealand pilose antler. 图 2 特异性引物琼脂糖凝胶电泳图 Figure 2 Electrophoregram of agarose gel of specific primers
图选项
2.4 PCR反应中最适解链温度的选择

解链温度是影响PCR扩增的一个重要因素，对于双重PCR尤其如此。由于单独进行PCR扩增时，Cytb1及COⅠ1的最适解链温度分别为50℃和56℃，因此解链温度分别为57.5℃、58℃、58.5℃、59℃、60℃和61℃，其他条件不变，检测双重PCR扩增效果。当解链温度在57.5℃~61.0℃时，均可实现2种目的基因的双重PCR，但以58℃时效果最好。故确定双重PCR的最适解链温度为58℃(图 3)。

Lane 1-8:57.5℃; Lane 9-16:58.0℃; M:100 bp DNA marker; Lane 1, 9:Cervus Nippon Temminck antler(Jilin); Lane 2, 10:Cervus elaphus Linnaeus antler; Lane 3, 11:Rangifer tarandus antler; Lane 4, 12:Cervus Nippon Temminck antler(Anhui); Lane 5, 13:New Zealand pilose antler; Lane 6, 14:Counterfeits of velvet antler; Lane 7, 15: Genuine velvet antler; Lane 8, 16:Negative control. 图 3 选择最适解链温度的琼脂糖凝胶电泳图 Figure 3 Electrophoregram of agarose gel of determination of optimum annealing temperature
图选项
2.5 确定最优PCR反应体系和反应条件

取待检样品DNA溶液0.5μL、引物(Cytb1及COⅠ1)各1μL，分别置于25μL PCR反应体系中，混匀。PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃、30s，58℃、30s，72℃、30s，循环反应30次；72℃延伸10min。

2.6 市售样品的检测结果

采用确定的鹿茸DNA的提取方法及最优的PCR反应条件，对市售样品(P1、P2、P3、P4和P5)进行检测，检测结果与实际情况完全一致(图 4)。进一步证明本研究建立的双重PCR技术快速鉴定鹿茸及其伪品的方法可行。

M:100 bp DNA marker; Lane 1:Cervus Nippon Temminck antler(Jilin); Lane 2:Cervus elaphus Linnaeus antler; Lane 3:Rangifer tarandus antler; Lane 4:Cervus Nippon Temminck antler(Anhui); Lane 5:New Zealand pilose antler; Lane 6-11:Sold velvet antler; Lane 12:Negative control. 图 4 正品和市售鹿茸样品的琼脂糖凝胶电泳图 Figure 4 Electrophoregram of agarose gel of genuine and sold velvet antlers
图选项
3 讨论

鹿茸作为贵重药材，产源不足但需求量增加，使得不同渠道来源的伪品、混淆品和代用品在国内的药源市场屡见不鲜。伪品鹿茸的价格昂贵却完全失去药用效果，不仅延误患者的救治，而且降低人们对中药的信任，严重影响我国传统药学的发展，更制约着中国传统医药的规范化、标准化和国际化。该情况在其他名贵中草药中也常见，如龟甲、川贝母和貂心等[12-16]。为在世界范围内弘扬我国传统的中医中药学，急需建立一套准确、有效和标准的鹿茸真伪的鉴定方法，确保药材质量，保障临床用药的安全性和准确性。

DNA分子遗传标记技术在中药材鉴定中被广泛使用，该标记技术具有多态性强和准确性高等优点。利用DNA分子标记技术对鹿茸进行鉴别，直接从遗传物质DNA的核苷酸序列上检测遗传变异，可准确鉴别鹿茸的真伪。

动物线粒体在细胞中有较多的拷贝数，无论哪个生长期、哪种形态线粒体均能较好地保存下来，而且每个部位的DNA序列均完全一致，这种高保真性结构有利于物种种内、种间和进化的研究[17]。Cytb位于线粒体内膜脂质双分子层中，是线粒体本身编码的少数功能蛋白之一，进化速度合理，目前主要被用于动物的种类鉴别[18]。COⅠ比Cytb基因进化迅速，适合鉴别关系紧密的物种，尤其可鉴别动、植物亚种[19]。

本研究利用COⅠ和Cytb分别设计引物，采用双重PCR技术进行真伪鹿茸的鉴别。双重PCR是Chamberian等在1988年提出的，指在同一反应体系中同时加入2对引物，使2个PCR同时完成。双重PCR可同时扩增2个目的基因，具有特异性强、效率高和成本低的优势，已经被广泛应用[20]。双重PCR在同一体系中特异性地扩增2个位点，其技术难度大，需要反复实验、全面分析，才能确定特异的反应体系和反应条件等[21]。

本研究采用碱变性方法提取鹿茸及其伪品的基因组DNA，用引物设计软件分别设计出针对鹿茸的Cytb和COⅠ的特异性引物，并进行双重PCR扩增。经多次实验，确定了特异的PCR反应条件和反应体系。本研究结果显示：如果在395和525bp处同时出现特异性条带即为鹿茸正品，反之为伪品，正品与伪品有明显差别。因此，本研究实现了从分子水平鉴定鹿茸的真伪，该方法简单、快速，结果可靠，易于推广应用。

本研究利用已确定的方法检验市售鹿茸，检验结果与吉林省吉林市食品药品检验所的结果完全一致，进一步证明本研究确定的检验方法可从分子水平鉴别鹿茸的真伪。

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