吉林大学学报(医学版)  2018, Vol. 44 Issue (04): 776-779

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安乐, 杨建征, 胡春梅, 于琼, 肖晗, 郝书弘, 唐艳
AN Le, YANG Jianzheng, HU Chunmei, YU Qiong, XIAO Han, HAO Shuhong, TANG Yan
多囊蛋白1基因对人宫颈癌HeLa细胞的抗凋亡作用
Anti-apoptosis effect of polycystin-1 gene on human cervical cancer HeLa cells
吉林大学学报(医学版), 2018, 44(04): 776-779
Journal of Jilin University (Medicine Edition), 2018, 44(04): 776-779
10.13481/j.1671-587x.20180415

文章历史

收稿日期: 2018-02-12
多囊蛋白1基因对人宫颈癌HeLa细胞的抗凋亡作用
安乐 , 杨建征 , 胡春梅 , 于琼 , 肖晗 , 郝书弘 , 唐艳     
吉林大学第二医院肿瘤血液科, 吉林 长春 130041
[摘要]: 目的: 研究多囊蛋白1(PC1)对人宫颈癌HeLa细胞凋亡的影响,为进一步阐明PC1对凋亡的作用提供依据。方法: 采用PC1基因重组质粒pEGPF-PC1-5TMC和空白对照质粒pEGFP分别转染HeLa细胞,Western blotting法进行验证。采用MTT法分别检测转染组(转染PC1重组质粒)、空白对照组(转染空白对照质粒pEGFP)和正常对照组(正常HeLa细胞)转染后48和72 h时细胞增殖活性,采用TUNEL法检测转染组和空白对照组细胞凋亡率。结果: 转染后48和72 h,与正常对照组比较,转染组细胞增殖活性差异无统计学意义(P>0.05);与空白对照组比较,转染组细胞增殖活性明显升高(P < 0.05)。转染组细胞凋亡率明显低于空白对照组(P < 0.01)。结论: PC1基因对人宫颈癌HeLa细胞有抗凋亡作用。
关键词: 多囊蛋白1    宫颈肿瘤    HeLa细胞    细胞凋亡    
Anti-apoptosis effect of polycystin-1 gene on human cervical cancer HeLa cells
AN Le, YANG Jianzheng, HU Chunmei, YU Qiong, XIAO Han, HAO Shuhong, TANG Yan     
Department of Oncology and Hematology, Second Hospital, Jilin University, Changchun 130041, China
[Abstract]: Objective: To investigate the effect of polycystin-1(PC1)on the apoptosis of human cervical cancer HeLa cells, and to provide the basis for further clarifying the effect of PC1 on apoptosis. Methods: The recombinant plasmid pEGPF-PC1-5TMC of PC1 gene and blank control plasmid pEGFP were respectively used to transfect the HeLa cells, which was verified by Western blotting method.The proliferation activities of cells in transfection group (transfected with recombinant PC1 plasmid), blank control group(transfected with blank control plasmid pEGFP) and normal control group(normal HeLa cells)were respectively detected by MTT at 48 and 72 h after transfection.The apoptotic rates of the cells in transfection group and blank control group were detected by TUNEL method. Results: Compared with normal control group, the proliferation ability of HeLa cells in transfection group had no significant difference at 48 and 72 h after transfection(P>0.05);compared with blank control group, the proliferation ability of HeLa cells in transfection group was increased significantly (P < 0.05) at 48 and 72 h after transfection.The apoptotic rate of HeLa cells in transfection group was obviously lower than that in blank control group (P < 0.01). Conclusion: PC1 gene has anti-apoptosis effect on the human cervical cancer HeLa cells.
Key words: polycystin-1     cervical neoplasms     HeLa cells     apoptosis    

常染色体显性遗传性多囊肾病(autosomal dominant polycystic kidney disease, ADPKD)是一种常见的单基因遗传病[1-2]。ADPKD主要由PKDl和PKD2基因突变引起, PKD1和PKD2分别编码多囊蛋白1 (polycystin-1,PC1)和多囊蛋白2 (polycystin-1,PC2)。目前研究[3-6]显示:85%~90%的ADPKD与PKD1基因突变有关。

在ADPKD的发病过程中,凋亡信号通路被激活[7-8],细胞凋亡的增加可引起囊泡的发生[9],国内外许多研究把干预囊肿上皮细胞凋亡作为重点,从而达到抑制多囊肾囊肿形成的治疗目的。PC1是一个具有长的细胞外氨基末端、11个跨膜区和短的细胞内羧基末端的跨膜蛋白[10-11]。PC1在MDCK肾细胞中的表达可引起微管的构建并抑制细胞凋亡[12];PC1抗凋亡的机制目前尚不清楚,参与PC1抑制凋亡的信号途径目前已较明确的是磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)等[13-15]。PC1调节蛋白激酶R(PKR)/真核细胞翻译起始因子2α(eIF2α)信号通路及对凋亡影响的研究[15]显示:PC1重组蛋白pEGPF-PC1-5TMC对HEK293T细胞凋亡具有抑制作用。PC1对宫颈癌HeLa细胞是否具有抗凋亡作用目前尚未见报道。本研究选取宫颈癌HeLa细胞作为研究对象,采用MTT法和TUNE法检测PC1对HeLa细胞凋亡的影响, 进一步明确PC1的抗凋亡作用, 为研究PC1在恶性肿瘤细胞中的作用机制提供依据。

1 材料与方法 1.1 细胞、质粒和试剂

人宫颈癌HeLa细胞为本实验室保存。在含有10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素及100 mg·L-1链霉素的DMEM高糖培养液中,置于5%CO2、37℃的培养箱中培养。每隔2 ~3 d更换1次培养液,细胞贴壁率达到70% ~80%进行细胞传代。空白对照质粒pEGFP和PC1基因重组质粒pEGFP-PC1-5TMC[15]由陈兴珍博士惠赠。脂质体LipofectamineTM2000购自美国Invitrogen公司,MTT和DMSO购自华美公司,DMEM完全培养基和胎牛血清购自美国HyClone公司,绿色荧光蛋白(GFP)单抗和辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG购自鼎国生物公司,化学发光试剂盒购自美国Bio-Rad公司,TUNEL测试剂盒购自美国Promega公司,硝酸纤维膜购自美国Bio-Rad公司。

1.2 转染

HeLa细胞以2.0×104 /孔密度接种6孔板, 置于37℃、5% CO2培养箱中培养, 48 h后更换新鲜培养液, 采用脂质体法转染细胞。用无血清DMEM培养液分别稀释质粒pEGFP、pEGFP-PC1-5TMC和LipofectamineTM2000, 室温静置5 min。将2种稀释液轻轻混合, 室温放置20 min。将混合液加至对应的孔板中, 置于37℃、5% CO2条件下培养。6 h后更换成新鲜含10%胎牛血清的DMEM完全培养基继续培养。转染空白对照质粒pEGFP组为空白对照组,转染PC1基因重组质粒pEGFP-PC1-5TMC组为转染组。

1.3 Western blotting法鉴定转染细胞

转染后24 h,提取细胞的蛋白, 蛋白浓度按Bradford法选择BSA作为测定标准,并根据标准曲线计算样品中蛋白浓度。80μg蛋白用10%SDS-PAGE分离,转移到硝酸纤维膜上,抗体按照GFP单抗1:2000、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG 1:500使用。按照化学发光试剂盒说明书进行杂交。

1.4 MTT法检测细胞增殖活性

细胞增殖实验分为3组。转染组:转染pEGFP-PC1-5TMC质粒组; 空白对照组:转染pEGFP空白对照质粒组; 正常对照组:未转染的HeLa细胞。转染后24 h,将细胞小心收集并接种到96孔培养板中, 每小孔加入200 μL(相当于1×104个细胞)细胞悬液。每板设培养基对照和正常对照,每组设定6复孔。分别在24和48 h(转染后48和72 h)采用MTT法检测细胞吸光度(A)值。将5 g ·L-1 MTT用Dilution Buffer稀释成1 g·L-1,每小孔加入50 μL MTT,在37℃培养箱中孵育4 h; 吸出上清液,每孔加入150 μL DMSO,在平板摇床上摇匀。在酶标仪490 nm波长处检测每孔A值, 细胞增殖活性=测量孔A值-培养基对照孔A值。

1.5 TUNEL法检测细胞凋亡率

细胞分别转染pEGFP-PC1-5TMC质粒(转染组)和pEGFP质粒(空白对照组),转染后48 h,将细胞晾干并经2%多聚甲醛室温固定10 min, PBS洗涤2次,室温置于穿透液(含0.05%Triton X-100的PBS)中3 min, 然后按照TUNEL检测试剂盒进行操作,倒置显微镜观察。凋亡细胞计数:每实验组切片数28个,每个切片取8个阳性视野,每个视野计数200个细胞,细胞凋亡率=凋亡细胞数/总细胞数×100%,取平均值。

1.6 统计学分析

采用SPSS 16.0统计软件进行统计学分析。细胞增殖活性和细胞凋亡率以x±s表示,2组间比较采用t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 PC1基因重组质粒转染HeLa细胞株的鉴定

Western blotting法鉴定PC1基因重组质粒转染HeLa细胞株,采用GFP单抗检测,在相对分子质量约68 000处显示pEGFP-PC1-5TMC蛋白条带。见图 1

Lane 1: Blank control group; Lane 2: Transfection group. 图 1 Western blotting法鉴定HeLa细胞中pEGFP-PC1-5TMC表达电泳图 Figure 1 Electrophoregram of pEGFP-PC1-5TMC expressions in HeLa cells identified by Western blotting method
2.2 各组细胞增殖活性

在转染后48和72h,与正常对照组比较, 转染组细胞增殖活性有所降低,但差异无统计学意义(P>0.05);与空白对照组比较,转染组细胞增殖活性明显升高, 差异有统计学意义(P < 0.05)。见表 1

表 1 转染后48和72h各组HeLa细胞增殖活性 Table 1 Proliferation activities of HeLa cells in various groups at 48 and 72 h after transfection
(n=6, x±s)
Group A value
(t/h) 48 72
Normal control 0.762±0.054 1.182±0.083
Blank control 0.629±0.037 1.053±0.031
Transfection 0.727±0.076* 1.154±0.079*
* P < 0.05 compared with blank control group.
2.3 各组细胞凋亡率

TUNEL法结果显示:转染后48 h,转染组和空白对照组均有TUNEL染色阳性细胞,阳性细胞多数皱缩变圆,颗粒感增强,但转染组TUNEL染色阳性细胞数明显少于空白对照组(图 2)。转染组细胞凋亡率(4.2%±1.6%)明显低于空白对照组(7.6%±1.7%)(P < 0.01)。

A:Blank control group; B:Transfection group. 图 2 TUNEL法检测各组HeLa细胞凋亡情况(×200) Figure 2 Apoptosis of HeLa cells in various groups detected by TUNEL assay(×200)
3 讨论

既往有关PC1抗凋亡作用的研究较少,但已在犬肾上皮MDCK细胞、人肝癌HepG2细胞及人胚肾HEK293T细胞中证实PC1具有抗凋亡作用[13-15]

MTT法可以灵敏地检测活细胞数,在生物实验中通常用来测定细胞增殖活性。本研究通过检测细胞转染后48和72h时细胞增殖情况,了解PC1对细胞凋亡的作用。本研究结果显示:PC1基因过表达有助于维持细胞增殖,提示PC1对HeLa细胞凋亡具有抑制作用。TUNEL法是目前用来检测细胞凋亡的常用方法之一,其优点是灵敏、可靠,目前有关PC1对细胞抑制凋亡作用的研究多采用TUNEL法[13, 15]。本研究结果显示: PC1明显抑制细胞凋亡率,表明PC1对HeLa细胞具有抗凋亡作用。

PC1和PC2除了在细胞感应信号转导中发挥重要作用外,还参与多种恶性肿瘤的发病[16-19],具有较广阔的研究前景。本研究结果不仅进一步证实了PC1具有抗凋亡作用,还为PC1在肿瘤细胞中的抗凋亡机制研究提供了依据。本研究结果符合既往研究已证实的PC1对MDCK、HepG2和HEK293T细胞有抑制凋亡作用的结论,尤其与PC1对人肝癌HepG2细胞的抗凋亡作用一致,但也有关于PC1能诱导肿瘤细胞HepG2、A549和SW480凋亡的报道[20], 因此,PC1在肿瘤细胞凋亡中的作用机制尚有待更多的研究进一步明确。

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