临床上由肿瘤、外伤、先天畸形和感染等造成的骨缺损不仅会影响外部的美观和功能，而且会给患者带来生活上的不便，甚至威胁生命。目前临床上对于骨缺损治疗的黄金标准是自体骨移植，但是自身可提供移植骨的部位有限，并且给原来健康的部位造成了损伤，给患者造成二次伤害^[1]。异体骨移植由于免疫反应，使其应用受到了限制^[2]。组织工程旨在结合细胞、生物材料及适当的生物化学因子，来引导新组织的形成。在理想的状态下，支架作为载体，是组织工程中最基础也是不可或缺的一部分^[3]。前期研究^[4]显示：羟基磷灰石(hydroxyapatite，HA)与β-磷酸三钙(Beta - tricalcium phosphate，β-TCP)组成的生物活性材料双相磷酸钙(biphasic calcium phosphate，BCP)，其化学组成与骨组织的无机成分相似，并解决了HA难以降解以及β-TCP降解过快的问题，且其具有HA和β-TCP具备的骨诱导性、骨传导性和生物相容性，在骨组织工程支架研究中广泛应用。Macchetta等^[5]采用冷冻干燥技术制作出多孔BCP/CS支架，其抗压强度可与松质骨相媲美。Petit等^[6]通过X射线断层技术发现：单纯BCP支架随着降解会使其脆性完全表现出来，导致断裂。壳聚糖(chitosan，CS)是自然界唯一带正电荷的天然碱性多糖，其具备可降解性、抗菌性、可塑性高并且支持细胞黏附、增殖和分化等特点，但其机械性能差，故不能单独作为组织工程支架^[7]。CS在医学领域应用广泛，其作为创口愈合的敷料具有良好的效果，作为药物缓释控释载体表现出了良好的功能，对于牙周组织再生有一定疗效，最近CS在骨组织工程领域也受到了广泛的关注，具备骨组织工程支架材料的潜力^[8]。本文作者拟采用3D打印技术，制备出精确孔隙大小的多孔隙相互连通的立体结构BCP支架，再使用化学方法制备CS溶液，覆盖于BCP支架上，构建出BCP/CS复合骨组织工程支架，观察材料的表征、理化性质、毒性测试及与小鼠前成骨细胞(MC3T3-E1)共培养的增殖情况，探索CS膜覆盖于材料上对于原本材料的影响，探讨其成为骨组织工程支架材料的潜力。

HA、β-TCP和聚乙烯(PVA)(中科院上海市硅酸盐研究所)，CS和CCK-8试剂盒(美国Sigma公司)，乙酸和H-DMEM培养基(美国Hyclone公司)，FBS(美国Gibco公司)。三维打印机(德国弗劳恩霍夫研究所)，CO₂恒温培养箱(日本Sanyo公司)，酶标仪(美国Bio-RAD公司)，扫描电子显微镜(SEM，SSX-550，日本SHIMADZU公司)，原子力显微镜(AFM，德国Bruker公司)，恒温烘干箱(上海精宏实验设备有限公司)

选择纳米级HA和β-TCP粉末，质量比为3:7的比例混合，以可溶于水且易于脱粘的PVA为粘结剂。将上述粉末与PVA水溶液(质量比6%)均匀混合配成可注射的膏状物。注射针头压力控制在200~400kPa，移动速度为6 mm·s^-1。根据预设的模型数据控制针头在三维方向定向移动分层打印，直至整个支架打印完成。模型在室温下干燥24 h，1 100℃烧结3 h，去除支架材料中的PVA，BCP支架最终成型^[9]。制备的支架为长方体，高3 mm，边长10 mm，孔隙率为400 μm。将制备完成的BCP支架用乙醇浸泡超声消毒去除杂质，烘干备用。配置1%乙酸溶液和5%氢氧化钠溶液备用。称取CS粉末放入烧杯中，使其溶于1%乙酸，磁力搅拌至CS粉末完全溶解，真空干燥箱抽空气泡后，放入BCP支架，超声震荡10 min使支架孔隙中的气泡基本析出，放入真空干燥箱2h使CS溶液中的气泡完全消失，CS溶液附于支架上。取出后，迅速用干净的镊子夹取CS溶液覆盖的BCP支架于48孔板中，放入真空干燥箱，55℃真空干燥24 h。完全干燥后取出放入烧杯，用5%氢氧化钠溶液浸泡30 min，完全去除乙酸，蒸馏水冲洗材料至中性，完全烘干，最终制备成BCP/CS复合支架。

采用原子力显微镜观察干燥后支架表面的粗糙度。然后支架表面喷金，采用扫描电子显微镜观察支架表面的微观形态。

支架完全烘干后质量为W1，将干燥后的支架浸于室温双蒸水中24h，取出后用滤纸吸去材料表面的水分，称质量为W2。吸水率(X)=(W2－W1)/W1×100%。每组5个样本，取平均值。

选用小鼠颅骨来源的MC3T3-E1细胞系，在37℃、5%CO₂的细胞孵育箱中培养。培养基为含10%胎牛血清和1%双抗的H-DMEM。观察细胞状态，2d换液1次，细胞铺满培养瓶80%以上时，胰酶消化传代。

BCP/CS支架与BCP支架去离子水超声震荡，烘干，高压灭菌备用。遵循国家标准(GB/T16886.11-1997)中医疗器械浸提方法，按照表面积/浸提介质=3cm²·mL^-1加入H-DMEM培养基(10%FBS、1%双抗)，在CO₂恒温细胞培养箱中静置72h，得到BCP/CS和BCP支架的浸提液，4℃保存备用。

将处于对数生长期的细胞用胰酶消化，制备成细胞悬液后调整细胞浓度为2×10⁴mL^-1，吸取100 μL加入96孔板中。放入细胞孵育箱4h使细胞贴壁，然后取出更换培养液。实验分为3组：BCP/CS组(BCP/CS支架浸提液)、BCP组(BCP支架浸提液)和空白组(单纯培养基)，每组设6复孔。各组细胞在培养1、3和5 d后，于超净台中每孔加入10μL CCK-8溶液，放回细胞孵育箱，避光孵育2h后取出，用酶标仪在波长450 mm处检测吸光度(A)值。细胞相对增殖率(RGR)=(实验组A值/空白组A值)×100%。按照国家标准(GB/T16886.5-2003)对2个实验组的RGR进行评级：0级，RGR>100%；1级，80% < RGR < 99%；2级，79% < RGR < 50%；3级，49% < RGR < 30%；4级，RGR < 29%。0级和1级表示材料浸提液无明显细胞毒性，2、3和4级代表材料浸提液有细胞毒性且依次增加。

BCP/CS支架和BCP支架(分别为BCP/CS组和BCP组)经去离子水超声振荡清洗，烘干，高压蒸汽灭菌后放入48孔培养板中，每孔放置1件材料，空白组为单纯培养基，每组设3复孔。取对数生长期的MC3T3-E1细胞用胰酶消化后制成单细胞悬液，每孔接种细胞数量为2×10⁴个。分别培养1、3、5和7 d后终止培养，在超净台中每孔分别加入50μL CCK-8溶液，细胞孵育箱避光孵育2h后，每孔吸取100 μL液体至新的96孔板中，保证无气泡后用酶标仪在波长为450 nm处检测A值。各组细胞增殖活性以A值表示。

采用SPSS 20.0统计软件进行统计学分析。材料吸水率和细胞增殖活性均以x±s表示，各组间比较采用单因素方差分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。

BCP支架和BCP/CS复合支架均为长方体，支架孔隙大小均匀，孔隙间相互连通。与BCP支架比较，BCP/CS支架表面无明显变化，灯光下可见表面覆盖一层浅黄色膜。见图 1A和B(插页三)。

A, C:BCP/CS scaffold; D, B:BCP scaffold. 图 1 2组支架表面形态(A, B)和粗糙度(C，D) Figure 1 Surface morphology(A, B) and roughness(C, D) of scaffolds in two groups

图选项

原子力显微镜观察支架表面粗糙度：BCP支架和BCP/CS支架表面均凹凸不平，BCP支架的表面粗糙度为860nm，BCP/CS支架的表面粗糙度为710nm(轮廓算数平均差)。见图 1C和D(插页三)。

扫描电子显微镜观察支架表面超微结构：BCP/CS支架孔隙相互连通，孔隙为250~300 μm，支架表面粗糙不平，有许多微孔，CS膜不仅覆盖在支架的表面，并且渗入了微孔中，覆盖于孔壁上，并且未改变其表面微孔形态(图 2)；BCP支架表面光滑，孔隙相对于BCP/CS支架较大，为350~450μm(图 3)。

A:Bar=1 mm; B:Bar=500 μm; C:Bar=20 μm; D:Bar=5 μm. 图 2 扫描电子显微镜观察BCP/CS支架表面超微结构 Figure 2 Ultrastructures of BCP/CS scaffold surface observed by SEM

图选项

A:Bar=1 mm; B:Bar=500 μm; C:Bar=20 μm; D:Bar=5 μm. 图 3 扫描电子显微镜观察BCP支架表面超微结构 Figure 3 Ultrastructures of BCP scaffold surface observed by SEM

图选项

BCP支架吸水率为(32.00±2.43)%，BCP/CS支架吸水率为(37.75±2.21)%，2组支架吸水率比较差异有统计学意义(P < 0.05)。

在体外培养1、3和5 d时，BCP/CS支架和BCP支架毒性等级均分别为0级、1级和1级，表明BCP/CS和B CP支架均无细胞毒性。各组支架RGR值及对应的细胞毒性等级见表 1。

将支架与细胞共培养1、3、5和7 d后，各组细胞增殖活性随时间的延长而增加。在共培养1 d后, BCP组和BCP/CS组的细胞增殖活性均低于空白组(P < 0.05)；培养3 d时，BCP组和BCP/CS组的细胞增殖活性明显低于空白组(P < 0.05)；培养5 d后，与空白组比较，BCP/CS组细胞增殖活性无明显变化(P>0.05)，但与BCP组比较差异有统计学意义(P < 0.05)；培养7 d后，BCP/CS组细胞增殖活性明显高于空白组和BCP组(P < 0.05)，BCP组与空白组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表 2。

本课题组的前期研究探索出了3D打印制备HA与β-TCP支架的方法以及质量比为3:7的比例，同时支架的表面形态和物理化学性能均符合骨组织工程支架的要求，通过原子力显微镜和扫描电子显微镜可见支架具有良好的形态^[10]。组织工程的出现使组织缺陷的治疗方法进入了一个新的时代，医学从治疗医学、预防医学过渡到了再生医学。在组织工程领域中，由于细胞与生长因子都必须负载于支架上，而其复合体又要植入人体中，所以合适的支架必须符合人体的物理化学性能，并具有良好的生物相容性^[11]。

3D打印技术是以计算机三维设计为基础，通过将材料逐层沉积并精准地控制其内部形态，形成预设的支架模型^[12]。传统的相分离法、粒子沥滤法和气体发泡法等方法具有许多优势。但是由于3D打印技术仍在发展之中，其对于材料的应用还有许多的限制。BCP是骨组织工程中最常用的生物陶瓷支架之一，其化学组成与骨组织的无机成分基本相同，作为HA和β-TCP的复合物，具备两者皆有的优点包括骨诱导性和骨传导性，可促进骨细胞的增殖分化，而且HA和β-TCP各自降解方面的缺点也可通过改变其比例来精确调整^[13]。CS具有良好的生物相容性、骨引导性和促进骨形成能力等优点^[14]，因此其在组织工程等多个领域广泛应用。Abueva等^[15]将预制的CS凝胶通过针孔注射与BCP粉末结合，该注射凝胶具有良好的蛋白吸附性与生物相容性，该研究结果为稳定性病理性骨折提供了一种微创骨充填材料。Mooyen等^[16]采用CS/胶原蛋白基质与BCP粘合后通过冷冻干燥法制备成复合多孔支架，在体外实验中取得了较好的效果。

本研究采用3D打印技术制备BCP支架，覆盖一层CS膜与其结合。BCP支架的孔径为350~ 450 μm，BCP/CS支架的孔径为250~300 μm，该结构均可促进组织工程中新生骨和新生血管的形成^[17]；肉眼观察2种材料孔隙之间均有良好的连通性，扫描电镜下也证实了支架孔径大小形态规则且连通性良好，有利于细胞在其内部的生长、营养物质的传递及组织的长入等^[18]；在吸水性方面，BCP/CS支架的吸水率高于BCP支架，表明其表面的CS膜发挥了良好的亲水性作用^[19]。

本研究中，将BCP/CS支架和BCP支架的浸提液与细胞联合培养后，CCK8法检测结果显示：联合培养后2组细胞增殖能力无明显差别，表明该材料具备了生物安全性；将2种支架直接与MC3T3-E1细胞共同培养后，在第1和3天时，BCP/CS和BCP组细胞增殖活性均明显小于空白组，可能由于材料为多孔三维结构，而细胞悬液接种时从孔隙中进入孔板底部，孔板底部经过处理有着亲水性较好的表面，所以进入底部的细胞黏附于孔板，导致了初始黏附在支架上的细胞数量较空白组少^[20]。本研究结果显示：与BCP组比较，从第1天开始BCP/CS组细胞增殖活性就处于较高水平，说明材料表面的CS膜较单纯BCP支架具有更好的亲水性；到第5天时，BCP/CS组细胞增殖活性组与空白组比较差异无统计学意义，说明该材料具有促进细胞增殖的能力；当培养到第7天时，BCP/CS组和BCP组的细胞增殖活性均高于空白组，而空白组细胞增殖活性与第5天比较几乎无增加，可能是由于孔板底部是二维结构，细胞长满之后由于接触抑制效应便逐渐停止增殖，而BCP/CS组和BCP组均为三维立体结构，细胞在其表面仍可增殖；第7天时，BCP/CS组细胞增殖活性已经明显高于BCP组，说明BCP/CS复合支架比单纯的BCP支架更能促进细胞的增殖。Castilho等^[13]同样使用3D打印技术制备孔径为300 μm的BCP支架，使用聚乳酸-乙醇酸溶液对材料处理后，增强了原材料的细胞增殖水平。

综上所述，采用3D打印制备的BCP支架具备良好的三维立体结构，可促进细胞增殖及营养输送。BCP支架表面覆盖CS后减小了孔径，增大了表面积，使其具有更好的理化性能并促进细胞的黏附增殖。CS本身具有多种可塑性，且已作为载药载体在临床应用，本研究初步验证BCP/CS支架在骨组织工程中的应用潜能，为进一步改进支架和体内实验提供了理论依据。