吉林大学学报(医学版)  2018, Vol. 44 Issue (04): 759-763

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王海彬, 董志军, 郭立涛, 石晶, 董微丽
WANG Haibin, DONG Zhijun, GUO Litao, SHI Jing, DONG Weili
菩人丹超微粉对STZ诱导糖尿病大鼠视网膜病变的保护作用及其对NF-κB信号通路的影响
Protective effect of Purendan Superfine Powder on retinopathy of rats with diabetes mellitus induced by streptozotocin and its influence in NF-κB signaling pathway
吉林大学学报(医学版), 2018, 44(04): 759-763
Journal of Jilin University (Medicine Edition), 2018, 44(04): 759-763
10.13481/j.1671-587x.20180412

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收稿日期: 2017-12-07
菩人丹超微粉对STZ诱导糖尿病大鼠视网膜病变的保护作用及其对NF-κB信号通路的影响
王海彬 , 董志军 , 郭立涛 , 石晶 , 董微丽     
承德医学院附属医院眼科, 河北 承德 067000
[摘要]: 目的: 探讨菩人丹超微粉(PRD)对糖尿病大鼠视网膜的保护作用及其对核因子κB(NF-κB)信号通路的影响,并阐明其作用机制。方法: 40只Wistar大鼠随机分为正常对照组、模型组、低剂量PRD组和高剂量PRD组。给药3个月后,测定各组大鼠血糖水平,RT-PCR法检测大鼠视网膜组织中血管内皮生长因子(VEGF)和血管生成素2(Ang-2)mRNA表达水平,Western blotting法检测大鼠视网膜组织中晚期糖基化终末产物(AGEs)、晚期糖基化终末产物受体(RAGE)、NF-κB、VEGF和Ang-2蛋白表达水平。结果: 与正常对照组比较,模型组大鼠血糖水平及视网膜组织中VEGF、Ang-2 mRNA表达水平和AGEs、RAGE、NF-κB、VEGF、Ang-2蛋白表达水平明显升高(P < 0.05);与模型组比较,低和高剂量PRD组大鼠血糖水平及视网膜组织中VEGF、Ang-2 mRNA表达水平和AGEs、RAGE、NF-κB、VEGF、Ang-2蛋白表达水平明显降低(P < 0.05)。结论: PRD可能通过特异性阻断AGEs/RAGE/NF-κB信号通路对糖尿病大鼠视网膜起保护作用。
关键词: 菩人丹超微粉    糖尿病, 实验性    视网膜病变    核因子κB信号通路    
Protective effect of Purendan Superfine Powder on retinopathy of rats with diabetes mellitus induced by streptozotocin and its influence in NF-κB signaling pathway
WANG Haibin, DONG Zhijun, GUO Litao, SHI Jing, DONG Weili     
Department of Ophthalmology, Affiliated Hospital, Chengde Medical College, Chengde 067000, China
[Abstract]: Objective: To investigate the protective effect of Purendan superfine powder (PRD) on the retinopathy of the diabetic rats and its influence in the nuclear factor kappa B (NF-κB) signaling pathway, and to elucidate its mechanism of action. Methods: Forty Wistar rats were randomly divided into normal control group, model group, low dose of PRD group and high dose of PRD group.After 3 months of administration, the blood sugar levels of the rats in various groups were detected.The expression levels of vascular endothelial growth factor(VEGF) and angiogenin-2(Ang-2) mRNA in retina tissue of the rats were determined by RT-PCR.The expression levels of advanced glycation end products(AGEs), receptor for advanced glycation end products (RAGE), NF-κB, VEGF, Ang-2 proteins in retina tissue of the rats were determined by Western blotting method. Results: Compared with normal control group, the blood sugar level, the expression levels of VEGF, Ang-2 mRNA in retina tissue and the expression levels of AGEs, RAGE, NF-κB, VEGF, Ang-2 proteins in retina of the rats in model group were significantly increased(P < 0.05).Compared with model group, the blood sugar levels, the expression levels of VEGF and Ang-2 mRNA in retina tissue, and the expression levels of AGEs, RAGE, NF-κB, VEGF, Ang-2 proteins in retina tissue of the rats in low and high doses of PRD group were significantly decreased(P < 0.05). Conclusion: PRD may protect the retina of diabetic rats by specifically blocking the AGEs/RAGE/NF-κB signaling pathway.
Key words: Purendan Superfine Powder     diabetes mellitus, experimental     retinopathy     nuclear factor kappa B signaling pathway    

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy, DR)是糖尿病引致视网膜微血管病变和神经组织病变的常见并发症,是导致视力损害的重要原因,近年来DR的发病率呈上升趋势,严重影响患者的生活质量[1]。研究[2-3]表明:血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和血管生成素2(angiopoietin-2,Ang-2)作为防治DR的重要标志,可反映视网膜组织的损伤程度。另有研究[4-5]表明:晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products,AGEs)/晚期糖基化终末产物受体(receptor of advanced glycation end products,RAGE)/核因子κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)信号通路在DR过程中起重要作用。

菩人丹超微粉(Purendan Superfine Powder, 简称PRD)是以苦瓜为君药,以人参和丹参为臣药,加以制首乌、水蛭和葛根配伍组成的中药复方,具有益气养阴清热、活血化瘀通络之功效。研究[6]表明:PRD对病机为“热、虚、瘀”的糖尿病患者有明显疗效。但目前尚无有关PRD对DR影响的相关机制的研究。为进一步探讨PRD对DR的保护作用,本研究主要观察PRD对糖尿病模型大鼠视网膜组织中VEGF和Ang-2蛋白表达的影响,并从AGEs/RAGE/NF-κB信号通路探讨PRD对糖尿病大鼠视网膜微血管损伤的保护作用。

1 材料与方法 1.1 药物、主要试剂和仪器

PRD(河北以岭药业集团有限公司),链脲佐菌素(STZ,美国Sigma公司),VEGF和Ang-2引物序列(上海生工生物工程有限公司),兔抗VEGF抗体(美国Cell Signalling公司),Ang-2、AGEs和RAGE抗体(英国Abcam公司),NF-κB P65(美国CST公司),抗兔辣根过氧化物酶(HRP,上海长岛生物技术有限公司)。OneTouch® UltraVue血糖仪(上海强生医疗器材有限公司),电泳仪(西安东澳生物科技有限公司),图像分析软件Quantity One 4.3.1(美国Bio-rad公司)。

1.2 实验动物、分组和给药

雄性Wistar大鼠40只,SPF级,体质量200~250 g,购自河北省实验动物中心,动物许可证号: SCXK(冀) 2016-0002。适应性喂养1周,实验室温度22℃~28℃,相对湿度60%~78%。40只大鼠随机分为正常对照组、模型组、低剂量PRD组和高剂量PRD组,每组10只。模型组、低剂量PRD组和高剂量PRD组大鼠禁食12h后,腹腔注射2% STZ(60 mg·kg-1),每天1次,制备糖尿病动物模型。连续注射3d后空腹后取鼠尾血,采用血糖仪测定血糖,以血糖水平≥16.7 mmol·L-1为糖尿病大鼠模型建立成功的标准[7-8]。待模型成功建立后,低剂量和高剂量PRD组大鼠分别灌胃给予1.2和2.4 g·kg-1 PRD,大鼠给药剂量根据成人给药剂量按体表面积换算,大鼠每日等效剂量(g·kg-1)=6.3×成人每日剂量(g·kg-1),自造模成功起连续给药3个月。正常对照组、模型组大鼠分别灌胃给予等体积生理盐水。实验期间大鼠自由进水和进食,不使用胰岛素及其他降糖药物。

1.3 标本收集

大鼠禁食12 h后,腹腔注射1%戊巴比妥钠(40 mg·kg-1)麻醉,打开腹腔,腹主动脉置管,取血测定血糖,用生理盐水灌洗至眼球苍白,迅速摘除双眼眼球,去除眼前节及玻璃体,于显微镜下钝性分离视网膜组织,置于-80℃下储存,用于实时定量逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)和Western blotting法检测。

1.4 RT-PCR法检测大鼠视网膜组织中VEGF和Ang-2 mRNA表达水平

提取视网膜组织总RNA,按照Thermo公司逆转录试剂盒的方法转录成cDNA,以此为模板进行半定量PCR检测,以β-actin基因的表达作为内参照。目的基因VEGF和Ang-2引物序列见表 1。反应条件:95℃预变性5 min,95℃变性30 s,58℃退火30 s,72℃延伸45 s,循环35次;72℃延伸10 min。PCR结束后以1.5%琼脂糖凝胶电泳检测扩增目的基因cDNA片段的质量,凝胶成像系统分析,以PCR产物的DNA扩增条带的灰度值和内参物扩增条带灰度值的比值作为VEGF和Ang-2 mRNA表达水平。

表 1 VEGF和Ang-2引物序列 Table 1 Primer sequences of VEGF and Ang-2
Target gene Primer sequence(5′-3′) Length of amplification (bp)
VEGF 5′-GCGGGCTGCTGCAATG-3′
5′-TGCAACGCGAGTCTGTGTTT-3′
237
Ang-2 5′-TGCAGCTACACTTTCCTC-3′
5′-TCTATCATCAGCCGTC-3′
166
β-actin 5′-GCACCGCAAATGCTTCTA-3′
5′-GGTCTTTACGGATGTCAACG-3′
225
1.5 Western blotting法检测视网膜组织中AGEs、RAGE、NF-кB、VEGF和Ang-2蛋白表达水平

取液氮中保存的视网膜组织,加入PBS(0.01 mmol·L-1,pH7.4)1 mL于匀浆器中冰浴下匀浆,4℃、6 000 r·min-1离心30 min,弃上清,向沉淀物中加入200 μL全细胞裂解液冰浴裂解40 min,4℃、12 000 r·min-1高速离心15 min,收集上清液,按照试剂盒方法对蛋白浓度进行定量,蛋白上样量为50 μg,12% SDS-PAGE凝胶电泳,80~120 V、2 h,电泳完毕后转移至PVDF膜(孔径0.45 μm,美国Pall公司)上;5%脱脂奶粉TBST封闭2 h;加入AGEs(1:1000)、RAGE(1:1000)、NF-κB (1:1000)、VEGF(1:200)和Ang-2(1:200)抗体,PVDF膜用0.5% TBS-T溶液洗膜3次,每次5 min,用二抗辣根过氧化物酶(HRP, 1:5000)交联物室温摇床孵育1 h,0.5% TBS-T溶液洗膜3次后,显影,对显影条带进行灰度分析,以GAPDH作为内参,计算AGEs、RAGE、NF-κB、VEGF和Ang-2条带与GAPDH条带的灰度值比值,代表目的蛋白的表达水平。

1.6 统计学分析

采用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析。各组大鼠体质量、血糖水平及大鼠视网膜组织中VEGF、Ang-2 mRNA表达水平和AGEs、RAGE、NF-κB、VEGF、Ang-2蛋白表达水平均以x±s表示,组间比较采用单因素方差分析。以P < 0.05表示差异有统计学意义。

2 结果 2.1 各组大鼠血糖水平

各组大鼠注射STZ造模24 h后出现多食、多饮和多尿表现,48 h后出现体质量下降和行动迟缓。与正常对照组比较,模型组大鼠体质量明显降低(P < 0.05),血糖水平明显升高(P < 0.05);与模型组比较,低和高剂量PRD组大鼠体质量明显升高(P < 0.05),血糖水平明显降低(P < 0.05);与治疗前比较,治疗后低和高剂量PRD组大鼠血糖水平明显降低(P < 0.05),高剂量PRD组较低剂量PRD组降糖效果更佳。见表 2

表 2 各组大鼠体质量和血糖水平 Table 2 Weights and levels of blood glucose of rats in various groups
(n=10, x±s)
Group Body weight(m/mg) Blood glucose[cB/(mmol·L-1)]
Before treatment After treatment Before treatment After treatment
Normal control 224.05±11.55 285.94±12.34 6.10±4.56 6.67±2.83
Model 201.41±9.36* 206.31±24.61* 21.74±1.93* 23.74±5.30*
PRD
    Low dose 204.31±8.04* 253.83±11.29 20.88±2.37* 15.03±2.73△#
    High dose 203.53±10.34* 275.55±15.36 21.56±2.53* 14.64±2.69△#
* P < 0.05 compared with normal control group; P < 0.05 compared with model group; # P < 0.05 compared with before treatment.
2.2 各组大鼠视网膜组织中VEGF和Ang-2 mRNA表达水平

与正常对照组比较,模型组大鼠视网膜组织中VEGF和Ang-2 mRNA表达水平明显升高(P < 0.05);与模型组比较,低和高剂量PRD组大鼠视网膜组织中VEGF和Ang-2 mRNA表达水平明显降低(P < 0.05),高剂量PRD组较低剂量组降低更明显。见图 1表 3

Lane 1: Normal control group; Lane 2: Model group; Lane 3:Low dose of PRD group; Lane 4:High dose of PRD group. 图 1 RT-PCR法检测各组大鼠视网膜组织中VEGF和Ang-2 mRNA表达电泳图 Figure 1 Electrophoregram of expressions of VEGF and Ang-2 mRNA in retinal tissue of rats in various groups detected by Western blotting method
表 3 各组大鼠视网膜组织中VEGF和Ang-2 mRNA表达水平 Table 3 Expression levels of VEGF and Ang-2 mRNA in retina tissue of rats in various groups
(n=10, x±s)
Group VEGF mRNA Ang-2 mRNA
Normal control 0.73±0.02 0.68±0.04
Model 1.18±0.03* 1.14±0.07*
PRD
    Low dose 1.08±0.01 0.95±0.05
    High dose 0.90±0.02 0.75±0.04
* P < 0.05 compared with normal control group; P < 0.05 compared with model group.
2.3 各组大鼠视网膜组织中AGEs、RAGE、NF-κB、VEGF和Ang-2蛋白表达水平

与正常对照组比较,模型组大鼠视网膜组织中AGEs、RAGE、NF-κB、VEGF和Ang-2蛋白表达水平明显升高(P < 0.05);与模型组比较,低剂量和高剂量PRD组大鼠视网膜AGEs、RAGE、NF-κB、VEGF和Ang-2蛋白表达水平明显降低(P < 0.05),高剂量PRD组较低剂量PRD组降低更明显。见图 2表 4

Lane 1: Normal control group; Lane 2: Model group; Lane 3:Low dose of PRD group; Lane 4:High dose of PRD group. 图 2 Western blotting法检测各组大鼠视网膜组织中AGEs、RAGE、NF-κB、VEGF和Ang-2蛋白表达电泳图 Figure 2 Electrophoregram of expressions of AGEs, RAGE, NF-κB, VEGF, and Ang-2 proteins in retina tissue of rats in various groups detected by Western blotting method
表 4 各组大鼠视网膜组织中AGEs、RAGE、NF-κB、VEGF和Ang-2蛋白表达水平 Table 4 Expressions of AGEs, RAGE, NF-κB, VEGF, and Ang-2 proteins in retina tissue of rats in various groups
(n=10, x±s)
Groups AGEs RAGE NF-кB VEGF Ang-2
Normal control 0.29±0.02 0.33±0.01 0.45±0.04 0.48±0.03 0.42±0.03
Model 0.46±0.04* 0.59±0.01* 0.91±0.04* 1.01±0.04* 0.95±0.04*
PRD
    Low dose 0.38±0.02 0.43±0.04 0.74±0.03 0.70±0.01 0.76±0.02
    High dose 0.33±0.01 0.36±0.01 0.64±0.01 0.58±0.02 0.63±0.02
* P < 0.05 compared with normal control group; P < 0.05 compared with model group.
3 讨论

糖尿病归属为中医“消渴”,病机特点为“阴虚为本,燥热为标;气阴两伤,阴阳俱虚;变证百出,常夹血瘀”,其中“热”“虚”“瘀”为发病的关键[9-10]。中药治疗主要遵循“清热”“补虚”“祛瘀”疗法。PRD由苦瓜、人参、丹参、首乌、水蛭和葛根配伍组成,方中人参、首乌补气养血,丹参、水蛭活血化瘀,苦瓜、葛根清热凉血兼明目,各中药配伍使用,达到清热和营、祛瘀通络的目的。

DR损伤的特征包括内皮细胞功能障碍、血视网膜屏障、视网膜血流量变化、局部缺血和新血管化[11-12]。研究[13]显示:DR的损伤程度与VEGF和Ang-2有密切关联。VEGF是一种血管生成因子和促炎症因子,对视网膜组织血管生成和水肿的发生有明显影响[14]。Ang-2作为一种促血管生成素,与VEGF具有协同作用,可增加视网膜血管通透性,导致视网膜血管内皮细胞功能障碍和慢性炎症的发生[15-16]。本研究结果显示:模型组大鼠视网膜组织中VEGF和Ang-2mRNA及蛋白表达水平均明显升高,说明模型建立成功;用药后PRD组大鼠血糖水平明显降低,同时VEGF和Ang-2mRNA及蛋白表达水平降低,且高剂量PRD组大鼠降低更明显,表明PRD对大鼠DR具有显著疗效。

DR过程中,视网膜组织可产生AGEs,AGEs通过增加血管内皮通透性,促进细胞因子释放和活化蛋白激酶,引起炎症反应,导致视网膜组织病变[17]。NF-κB是一种广泛存在于体内多种细胞的核转录因子,调节多种细胞因子的合成与释放,在机体的免疫和炎症反应、凋亡调控等方面发挥重要作用[18]。AGEs特异性受体RAGE属于免疫球蛋白超家族的细胞表面分子,可结合并降解AGEs。研究[19]证明:发生糖尿病和氧化应激时,RAGE表达可明显升高。AGEs通过与RAGE结合激活NF-κB,同时NF-κB作为RAGE的启动子促进AGEs与RAGE进一步结合,产生正反馈作用[20]。本研究结果显示:PRD可明显降低糖尿病大鼠视网膜组织中AGEs、RAGE和NF-κB蛋白表达水平,表明PRD可降低AGEs的产生,抑制AGEs与RAGE结合,减少NF-κB的分泌,特异性阻断AGEs/RAGE/NF-κB信号通路。

综上所述,PRD对糖尿病大鼠视网膜具有保护作用,下调糖尿病大鼠视网膜组织中VEGF和Ang-2 mRNA及蛋白表达水平,特异性阻断AGEs/RAGE/NF-κB信号通路,减少视网膜微血管渗漏及病理性新生血管生成,减少AGEs形成,减轻炎症反应,是其发挥保护作用的机制之一。

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