吉林大学学报(医学版)  2018, Vol. 44 Issue (04): 718-723

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李鑫, 马云飞, 唐庚, 韦麒, 纪红池, 田嘉安, 申延男, 王志成
LI Xin, MA Yunfei, TANG Geng, WEI Qi, JI Hongchi, TIAN Jiaan, SHEN Yannan, WANG Zhicheng
线粒体靶向KillerRed诱导的ROS增强辐射对HeLa细胞的增殖抑制作用
Enhancement of ROS induced by mitochondria-targeted KillerRed in proliferation inhibition of radiation on HeLa cells
吉林大学学报(医学版), 2018, 44(04): 718-723
Journal of Jilin University (Medicine Edition), 2018, 44(04): 718-723
10.13481/j.1671-587x.20180405

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收稿日期: 2017-12-04
线粒体靶向KillerRed诱导的ROS增强辐射对HeLa细胞的增殖抑制作用
李鑫 , 马云飞 , 唐庚 , 韦麒 , 纪红池 , 田嘉安 , 申延男 , 王志成     
吉林大学公共卫生学院 国家卫生健康委员会放射生物学重点实验室, 吉林 长春 130021
[摘要]: 目的: 构建线粒体靶向KillerRed(KR)重组表达载体,探讨可见光照射诱导活性氧(ROS)生成规律及其增强电离辐射对HeLa细胞的增殖抑制作用。方法: 利用基因重组技术构建线粒体靶向重组载体plxsp-flag-Sarm1-KR和plxsp-flag-Sarm1-mCherry。将宫颈癌HeLa细胞分为对照组、plxsp-flag组、plxsp-flag-Sarm1-KR组、4 Gy组、plxsp-flag+4 Gy组和plxsp-flag-Sarm1-KR+4 Gy组。细胞转染24 h后,利用荧光显微镜检测mCherry蛋白和细胞色素C氧化酶Ⅳ(COXⅣ)蛋白表达水平;可见光照射后利用DCFH-DA探针检测平均荧光强度(MFI),表示ROS生成水平;4 Gy X射线照射后,利用CCK-8试剂盒检测细胞增殖活性。结果: 构建载体经测序鉴定并与GenBank序列比对,表明线粒体靶向融合表达载体plxsp-flag-Sarm1-KR(mCherry)构建成功。转染HeLa细胞后,荧光显微镜下可见mCherry蛋白与线粒体示踪COXⅣ蛋白具有相同的定位。ROS生成水平,对照组和plxsp-flag组在可见光照射10、30和60 min后掺入探针,掺入探针10、30和60 min后MFI无明显变化(P > 0.05);plxsp-flag-Sarm1-KR组MFI呈时间依赖性增加,与对照组比较,plxsp-flag-Sarm1-KR组可见光照射10和30 min后掺入探针,掺入探针60 min后MFI明显增加(P < 0.05);可见光照射60 min后掺入探针,掺入探针30和60 min后plxsp-flag-Sarm1-KR组MFI明显降低(P < 0.05)。与对照组比较,plxsp-flag组细胞增殖活性无明显变化(P > 0.05),10和24 h时plxsp-flag-Sarm1-KR组细胞增殖活性明显降低(P < 0.05),10 h时4 Gy组和plxsp-flag+4 Gy组细胞增殖活性明显降低(P < 0.01),10、24和48 h时plxsp-flag-Sarm1-KR+4 Gy组细胞增殖活性明显降低(P < 0.05或P < 0.01);与plxsp-flag-Sarm1-KR组和4 Gy组比较,plxsp-flag-Sarm1-KR+4 Gy组细胞增殖活性明显降低(P < 0.05)。结论: 成功构建线粒体靶向融合表达载体,所介导的KR蛋白可以诱导ROS产生,并且增强电离辐射对HeLa细胞的增殖抑制作用。
关键词: 线粒体    活性氧    KillerRed    电离辐射    细胞增殖    
Enhancement of ROS induced by mitochondria-targeted KillerRed in proliferation inhibition of radiation on HeLa cells
LI Xin, MA Yunfei, TANG Geng, WEI Qi, JI Hongchi, TIAN Jiaan, SHEN Yannan, WANG Zhicheng     
NIH Key Laboratory of Radiobiology, School of Public Health, Jilin University, Changchun 130021, China
[Abstract]: Objective: To construct the recombinant expression vector of mitochondria-targeted KillerRed (KR), and to explore the producing regularity of reactive oxygen species (ROS) induced by visible light exposure, and its enhancement in the proliferation inhibition of radiation on the HeLa cells. Methods: Gene recombination technique was used to build the recombinant vectors plxsp-flag-Sarm1-KR and plxsp-flag-Sarm1-mCherry targeting mitochondria. The cervical cancer HeLa cells were divided into control, plxsp-flag, plxsp-flag-Sarm1-KR, 4 Gy, plxsp-flag + 4 Gy and plxsp-flag-Sarm1-KR + 4 Gy groups. After the vectors were transfected into the cells for 24 h, the expression levels of mCherry and mitochondrial track COXⅣ proteins were determined by fluorescence microscope; DCFH-DA probe was used to detect the mean fluorescence intensity(MFI) to indicate the ROS producing level. After 4 Gy X-ray irradiation, the cell proliferation activity was measured by CCK8 kits. Results: After the vectors were sequenced and identified, the sequence was consistent with that in GenBank, and the results showed the fusion expression vector plxsp-flag-Sarm1-KR(mCherry) was successfully constructed. After the plasmids were transfected into the HeLa cells, under fluorescence microscope, mCherry protein and COXⅣ protein had the same expression location. From ROS producing level, in control and plxsp-flag groups, after the cells were exposed to visble light for 10, 30 and 60 min, the MFI had no obvious changes after the probe was incorporated for 10, 30 and 60 min; but in plxsp-flag-Sarm1-KR group, the MFIs were increased with the time prolongation; compared with control group, the cells were exposed to visble light for 10 and 30 min, and the MFIs were significantly increased after the probe was incorporated for 60 min (P < 0.05); when the cells were exposed to visble light for 60 min, the MFIs were significantly decreased after the probe was incorporated for 30 and 60 min (P < 0.05). Compared with control group, the A(450) in plxsp-flag group had no obvious change(P > 0.05); the proliferation activities were significantly decreased at 10 and 24 h in plxsp-flag-Sarm1-KR group (P < 0.05); the proliferation activities were significantly decreased at 10 h in 4 Gy and plxsp-flag + 4 Gy groups (P < 0.01); the proliferation activities were significantly decreased at 10, 24 and 48 h in plxsp-flag-Sarm1-KR + 4 Gy group (P < 0.05 or P < 0.01). The proliferation activity in plxsp-flag-Sarm1-KR + 4 Gy group was lower than those in plxsp-flag-Sarm1-KR and 4 Gy groups (P < 0.05). Conclusion: The mitochondria-targeted fusion expression vectors are successfully constructed, and the KR proteins can induce the ROS producing and enhance the inhibitory effect of proliferation of ionizing radiation on the HeLa cells.
Key words: mitochondria     reactive oxygen species     KillerRed     radiation     cell proliferation    

宫颈癌是严重威胁健康与生命的最常见的妇科恶性肿瘤,发展中国家宫颈癌病例数约占全球宫颈癌的85% [1-2]。放射治疗(简称放疗)是宫颈癌常用的治疗手段之一,通过诱导宫颈癌细胞凋亡可以增强其放疗效果。活性氧(reative oxygen species,ROS)是一组高活性的氧分子及其衍生物,在生理条件下,低水平ROS的生成被认为是信号分子,但过量ROS则会诱导氧化损伤,导致肿瘤细胞凋亡或坏死[3-5]。线粒体既是ROS的产生部位,也是ROS的作用靶点。ROS作用线粒体后,可以诱导线粒体损伤,进而导致细胞凋亡。KillerRed(KR)蛋白是一种能够产生红色荧光以二聚体形式存在的蛋白,在540 ~ 580 nm光照时可以产生致细胞损伤的ROS,同时使蛋白失去活性[6-7]。本文作者利用线粒体靶向蛋白选择性雄激素受体调节剂1(selective androgen receptor modulator 1,Sarm1)的线粒体定位序列与KR形成融合蛋白序列,实现线粒体的靶向性,进而诱导ROS大量产生,探讨其联合电离辐射后对HeLa细胞的增殖抑制作用,为宫颈癌的放疗增敏提供新思路。

1 材料与方法 1.1 细胞、主要试剂和仪器

人宫颈癌HeLa细胞(本实验室保存),MEM完全培养基(Gibico公司,美国),Hieff TransTM脂质体核酸转染试剂(上海翊圣生物科技有限公司),青霉素和链霉素(ThermoFisher Scientific公司,美国),ROS测试盒(南京建成生物工程研究所);CCK-8检测试剂盒(MedChemExpress公司,美国),Q5 PCR扩增试剂盒(NEB公司,美国),引物和DNA连接酶(TaKaRa公司,大连),细胞色素C氧化酶Ⅳ(COX Ⅳ)兔多克隆一抗和抗兔二抗(绿色荧光)(Santa Cruz公司,美国),其他试剂均为国产分析纯。细胞成像微孔板检测仪Cytation3(Biotek公司,美国),X射线辐照仪X-RAD 320iX(Precision X-ray Inc公司,美国)。

1.2 质粒构建

在GenBank中查阅小鼠Sarm1基因的线粒体定位序列并设计引物,同时设计KR和mCherry引物(下划线部分为酶切位点),因KR蛋白光照后失去活性,不适用于荧光观察,因此以mCherry红色荧光代替KR进行线粒体靶向鉴定。Sarm1引物:F (Not Ⅰ) 5′-AAGGAAAAAAGCGGCCGCAATGGTCCTGACGCTG-3′,R (EcoR Ⅰ) 5′-CGGAATTCCCGATCGGCGCCCGGCCGTG-3′;mCherry引物:F (EcoRⅠ) 5′-GGAATTCGCCACCATGGTGAGCAAGGG,R(BamHⅠ)5′-CGGGATCCTTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3′;KR引物:F(EcoRⅠ) 5′-GGAATTCATGGGTTCAGAGGGC-3′,R (BamHⅠ) 5′-CGGGATCCCTAGATCTCGTCG-3′。分别以pGw1-myc-Sarm1质粒、plxsp-TetA-mCherry和plxsp-TetA-KR质粒为模板PCR扩增Sarm1、mCherry和KR片段,plxsp-flag空载体行EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切,将mCherry插入后构建plxsp-flag-mCherry载体, 测序鉴定正确后,再进行NotⅠ和EcoRⅠ双酶切,将Sarm1序列插入后构建plxsp-flag-sarm1-mCherry,测序鉴定正确后进行EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切,将KR序列插入后构建plxsp-flag-Sarm1-KR载体,测序进行鉴定。

1.3 实验分组

HeLa细胞分为对照组、plxsp-flag组、plxsp-flag-Sarm1-KR组、4 Gy组、plxsp-flag+4 Gy组和plxsp-flag-Sarm1-KR+4 Gy组。无菌条件下避光采用可见光源照射细胞,时间为10、30和60 min;X射线照射条件:电压180 kV,电流12.0 mA,靶皮距70 cm,剂量率1.0 Gy·min-1,单次照射剂量为4 Gy。

1.4 融合蛋白线粒体靶向性鉴定

因KR蛋白光照后即丧失活性,产生ROS,不适于进行荧光显微镜观察,以与其氨基酸序列基本一致的红色荧光蛋白mCherry进行线粒体靶向性鉴定。将HeLa细胞按照每孔2×105个细胞接种于铺有盖玻片的6孔板中,待细胞80%融合后将plxsp-flag-Sarm1-mCherry质粒转染HeLa细胞,36 h后取出载玻片进行免疫荧光染色,以COX Ⅳ一抗作为线粒体定位标记(mito-track),荧光显微镜照相并进行分析。

1.5 ROS生成水平检测

HeLa细胞达到80%融合后,0.25%胰酶消化,加入含有10% FBS无抗生素的MEM稀释,按照每孔0.8×104个细胞接种到96孔板中,每孔加入质粒0.2 μg、转染试剂0.2 μL,转染结束后用锡纸包裹96孔板,避光在37℃、5% CO2条件下培养24 h,转染结束后加入完全培养基100 μL,进行可见光照射,分别于照射后10、30和60 min加入DCFH-DA探针标记,并上机检测,以平均荧光强度(mean fluoresencence intensity,MFI)表示ROS生成水平,实验设6复孔。

1.6 酶标仪检测细胞增殖活性

按照每孔0.8×104个细胞接种于96孔板,避光培养于培养箱内,质粒转染后24 h进行可见光照射,12 h后进行4 Gy X射线照射,计为0 h,分别于4、10、24和48 h后,每孔加入10 μL CCK-8试剂,继续培养1.5 h,轻轻震荡后采用酶标仪在450 nm处检测各孔吸光度[A(450)]值,以A值表示各组细胞增殖活性,实验设6复孔。

1.7 统计学分析

采用SPSS24.0统计软件进行统计学分析。各组细胞MFI和增殖活性以x±s表示,符合正态分布,两两比较采用Student’ s t检验。以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果 2.1 plxsp-flag-KR载体构建

PCR扩增获得mCherry、KR和Sarm1产物,长度分别为729、735和108 bp(图 1),经过酶切、DNA连接、产物转化、单克隆挑取、质粒小提和测序(美国Macrogen公司)后,将测序结果与GenBank中序列进行比对,序列完全一致,表明成功构建plxsp-flag-Sarm1-mCherry和plxsp-flag-Sarm1-KR质粒。构建过程见图 2

Lane 1, 6: 100 bp DNA marker; Lane 2, 3: mCherry PCR products; Lane4, 5: KR PCR product; Lane 7, 8: Sarm1 PCR product. 图 1 mCherry、KR和Sarm1 PCR扩增产物电泳图 Figure 1 Electrophoregram of PCR products of mCherry, KR and Sarm1
图 2 plxsp-flag-Sarm1-mCherry和plxsp-flag-Sarm1-KR质粒构建示意图 Figure 2 Diagram of construction plxsp-flag-Sarm1-mCherry and plxsp-flag-Sarm1-KR
2.2 融合载体线粒体靶向性鉴定

构建的plxsp-flag-Sarm1-mCherry载体转染HeLa细胞后,在细胞核(DAPI染蓝色)外线粒体部位可见COX Ⅳ蛋白表达(绿色荧光),而在相同位置可见mCherry蛋白表达(红色荧光),说明构建的载体能够成功定位于线粒体。见图 3(插页一)。

A : DAPI; B : COX Ⅳ; C : mCherry; D : Merge. 图 3 荧光显微镜观察mCherry蛋白和线粒体示踪蛋白COX Ⅳ的表达(×400) Figure 3 Expressions of mCherry and mito-track COX Ⅳ proteins detected with fluorescent microscope (×400)
2.3 可见光照射后各组细胞MFIs

质粒转染后避光培养24 h,对照组和plxsp-flag组可见光照射10、30和60 min后掺入探针,探针掺入10、30和60 min后细胞MFI无明显变化(P>0.05)。可见光照射10和30 min后掺入探针,plxsp-flag-Sarm1-KR组细胞MFI呈时间依赖性增加;与对照组比较,掺入探针60 min后plxsp-flag-Sarm1-KR组细胞MFI明显增加(P<0.05);可见光照射60 min后掺入探针,与对照组比较,掺入探针30和60 min后plxsp-flag-Sarm1-KR组细胞MFI明显降低(P<0.05)。见表 1

表 1 可见光照射10、30和60 min后各组HeLa细胞MFI Table 1 MFIs of HeLa cells 10, 30 and 60 min after visible light irradiation in various groups
(n=6, x±s)
Groups Probe incorporation
(t/min)
MFI
Visble right
exposure(t/min) 10
30 60
Control
10 862.9±153.8 841.8±131.7 1 062.5±99.6
30 810.3±184.2 985.5±10.2 1 031.9±143.5
60 892.2±87.7 983.7±31.8 685.8±148.9
Plxsp-flag
10 891.8±146.1 874.0±164.9 1 001.8±179.9
30 804.5±430.3 1 020.3±13.3 1 068.0±56.0
60 807.2±58.4 985.9±23.1 703.2±170.6
Plxsp-flag-Sarm1-KR
10 496.3±235.0 975.4±33.5* 785.8±156.4
30 1 007.9±197.8 1 383.8±197.8 971.2±107.7*
60 1 354.3±276.2* 1 058.3±27.5 574.4±36.1*
*P<0.05 vs control group.
2.4 各组细胞增殖活性

可见光照射30 min,12 h后行4 Gy X射线照射,与对照组比较,plxsp-flag组细胞增殖活性无明显变化(P>0.05);plxsp-flag-Sarm1-KR组细胞增殖活性在10和24 h时明显降低(P<0.05),4 Gy和plxsp-flag+4 Gy组细胞增殖活性在10 h时明显降低(P<0.01),plxsp-flag-Sarm1-KR+4 Gy组细胞增殖活性在10、24和48 h时明显降低(P<0.05或P<0.01)。与plxsp-flag-Sarm1-KR组和4 Gy组比较,plxsp-flag-Sarm1-KR +4 Gy组细胞增殖活性均明显降低(P<0.05)。见表 2

表 2 4 Gy X射线照射后4、10、24和48 h各组细胞增殖活性 Table 2 Proliferation activities of HeLa cells 4, 10, 24 and 48 h after irradiation with 4 Gy X-ray
(n=6, x±s)
Group Proliferation activity
(t/h) 4 10 24 48
Control 1.000±0.140 1.158±0.201 1.468±0.038 1.550±0.086
Plxsp-flag 1.027±0.064 1.014±0.090 1.461±0.192 1.560±0.247
Plxsp-flag-Sarm1-KR 0.706±0.111 0.982±0.053* 1.341±0.147* 1.491±0.269
4 Gy 0.989±0.057 0.926±0.201** 1.263±0.141 1.257±0.060
Plxsp-flag+4 Gy 0.843±0.095 0.818±0.093** 1.143±0.130 1.235±0.146
Plxsp-flag-Sarm1-KR+4 Gy 0.867±0.135 0.879±0.013*# 0.942±0.054**△# 1.118±0.039**△#
*P < 0.05, * *P < 0.01 vs control group;P < 0.05 vs plxsp-flag-Sarm1-KR group;#P < 0.05 vs 4 Gy group.
3 讨论

目前,肿瘤常规的治疗手段包含手术、放疗和化疗。放疗是中晚期宫颈癌患者主要治疗方法,但由于肿瘤对放疗的抵抗和耐受的存在,其效果并不尽如人意。为缓解放疗抵抗,提高放疗效果,放疗增敏剂应运而生,临床医生为增强放射线对肿瘤细胞的杀伤效应,常在放疗时合并使用一些化学药物或采用一些物理方法等,包括化学药物、靶向基因或者传统中药等。基于ROS作用线粒体后可以诱导细胞发生凋亡、自噬和线粒体DNA损伤,外源性ROS也可以作为放疗增敏剂,通过一定的策略增加其产量,诱导肿瘤细胞凋亡,更有效地提高放疗的疗效[8-12]。诱导ROS产生也是肿瘤光动力治疗(photodymamic therapy,PDT)的基本原理,即利用光敏剂在可见光的照射下,导致ROS的产生,继而作用于细胞,产生细胞杀伤。因此,肿瘤的PDT与放疗联合应用将具有良好的前景。

ROS是一类化学性质活泼,具有较高氧化活性的分子或离子,过量的ROS会对蛋白质、核酸和脂质等生物大分子造成损伤,从而影响其正常生理生化功能。ROS作用于线粒体后,损害线粒体的完整性,诱使蛋白修饰,引起脂质过氧化和线粒体DNA(mtDNA)的损伤,可能导致膜去极化,电位耗散,引起细胞线粒体内细胞色素c(Cyt c)、凋亡诱导因子(AIF)和Smac等促凋亡蛋白释放,诱导细胞凋亡[13]。同时,线粒体激酶Pink(PTEN-induced putative kinase)将帕金蛋白(parkin)募集到线粒体外膜上,启动线粒体自噬,引发选择性自噬途径[14-15]。这是ROS诱导细胞死亡的重要机制。

红色荧光蛋白KR以二聚体形式存在,最大激发/发射波长为585/610 nm,既可以直接在靶细胞内单独表达,也可以与靶蛋白融合表达,其蛋白中存在一个长的水通道结构,在540 ~ 580 nm的光照时可以产生致细胞损伤的ROS,一般为超氧阴离子和过氧化氢(H2O2),同时蛋白失去活性[7, 16]。利用红色荧光蛋白KR进行相关ROS诱导的研究中,主要利用其在激光照射下可以产生1 000倍于GFP照射产生的ROS,具有“爆发式”特点,使其发挥足量的作用。Sun等[17]用KR成功地靶向定标制造基因损伤(DART系统),这种在特定基因位点引入损伤的系统,近年来为相关领域发展起到了助推作用。基于此理论,本文作者设想将线粒体靶向蛋白Sarm1序列克隆到KR蛋白序列的前面,构建融合蛋白表达载体,结果显示:构建的融合表达载体具有线粒体靶向特性。本研究同时显示:利用可见光照射可以诱导HeLa细胞内ROS产生,在可见光照射30 min后为ROS产生提供比较理想的条件。

本研究在上述诱导ROS产生的基础上,进一步给予4 Gy X射线照射,观察其对细胞增殖的影响,结果显示:转染了plxsp-flag-Sarm1-KR质粒的HeLa细胞在可见光照射后细胞增殖活性较对照组明显降低,各组细胞经4 Gy X射线照射后增殖活性也明显降低,且plxsp-flag-Sarm1-KR + 4 Gy组较plxsp-flag-Sarm1-KR组和4 Gy组细胞增殖活性进一步降低,说明可见光诱导ROS导致了细胞死亡,细胞增殖活性降低,且增强辐射诱导的细胞增殖抑制作用。本研究基于Sarm1线粒体靶向信号序列能够实现线粒体基质靶向,而KR蛋白在光照下能够失活,且诱导ROS“爆发式”产生,ROS的质和量都得到了保障[18]。因此,将融合表达质粒转染肿瘤细胞,使线粒体靶向的融合蛋白既能实现线粒体靶向,又能光照后产生大量ROS,使得肿瘤细胞在进行放疗前部分细胞死亡,再进行放射治疗,增进放疗对肿瘤细胞的杀伤效果。

参考文献
[1] Chen W, Zheng R, Baade PD, et al. Cancer statistics in China, 2015[J]. CA Cancer J Clin, 2016, 66(2): 115–132. DOI:10.3322/caac.21338
[2] Jemal A, Bray F, Center MM, et al. Global cancer statistics[J]. CA Cancer J Clin, 2011, 61(2): 69–90. DOI:10.3322/caac.v61:2
[3] Finkel T. Oxidant signals and oxidative stress[J]. Curr Opin Cell Biol, 2003, 15(2): 247–254. DOI:10.1016/S0955-0674(03)00002-4
[4] Hekimi S, Wang Y, Noë A. Mitochondrial ROS and the effectors of the intrinsic apoptotic pathway in aging cells:the discerning killers![J]. Front Genet, 2016, 7: 161.
[5] Chio ⅡC, Tuveson DA. ROS in cancer:the burning question[J]. Trends Mol Med, 2017, 23(5): 411–429. DOI:10.1016/j.molmed.2017.03.004
[6] Liao ZX, Li YC, Lu HM, et al. A genetically-encoded KillerRed protein as an intrinsically generated photosensitizer for photodynamic therapy[J]. Biomaterials, 2014, 35(1): 500–508. DOI:10.1016/j.biomaterials.2013.09.075
[7] Williams DC, Bejjani RE, Ramirez PM, et al. Rapid and permanent neuronal inactivation in vivo via subcellular generation of reactive oxygen with the use of KillerRed[J]. Cell Rep, 2013, 5(2): 553–563. DOI:10.1016/j.celrep.2013.09.023
[8] Yang N, Weinfeld M, Lemieux H, et al. Photo-activation of the delocalized lipophilic cation D112 potentiates cancer selective ROS production and apoptosis[J]. Cell Death Dis, 2017, 8(2): e2587. DOI:10.1038/cddis.2017.19
[9] Esmaeili MA, Abagheri-Mahabadi N, Hashempour H, et al. Viola plant cyclotide vigno 5 induces mitochondria-mediated apoptosis via cytochrome C release and caspases activation in cervical cancer cells[J]. Fitoterapia, 2016, 109: 162–168. DOI:10.1016/j.fitote.2015.12.021
[10] Wu T, Geng J, Guo W, et al. Asiatic acid inhibits lung cancer cell growth in vitro and in vivo by destroying mitochondria[J]. Acta Pharm Sin B, 2017, 7(1): 65–72. DOI:10.1016/j.apsb.2016.04.003
[11] Yang C, Yang QO, Kong QJ, et al. Parthenolide induces reactive oxygen species-mediated autophagic cell death in human osteosarcoma cells[J]. Cell Physiol Biochem, 2016, 40(1/2): 146–154.
[12] Pokrzywinski KL, Biel TG, Kryndushkin D, et al. Therapeutic targeting of the mitochondria initiates excessive superoxide production and mitochondrial depolarization causing decreased mtDNA integrity[J]. PLoS One, 2016, 11(12): e0168283. DOI:10.1371/journal.pone.0168283
[13] Gyulkhandanyan AV, Mutlu A, Freedman J, et al. Mitochondrial permeability transition pore (MPTP)-dependent and-independent pathways of mitochondrial membrane depolarization, cell shrinkage and microparticle formation during platelet apoptosis[J]. Br J Haematol, 2015, 169(1): 142–145. DOI:10.1111/bjh.2015.169.issue-1
[14] Coto-Montes A, Boga JA, Rosales-Corral S, et al. Role of melatonin in the regulation of autophagy and mitophagy:a review[J]. Mol Cell Endocrinol, 2012, 361(1/2): 12–23.
[15] Heo JM, Ordureau A, Paulo JA, et al. The PINK1-PARKIN mitochondrial ubiquitylation pathway drives a program of OPTN/NDP52 recruitment and TBK1 activation to promote mitophagy[J]. Mol Cell, 2015, 60(1): 7–20. DOI:10.1016/j.molcel.2015.08.016
[16] Liao ZX, Li YC, Lu HM, et al. A genetically-encoded KillerRed protein as an intrinsically generated photosensitizer for photodynamic therapy[J]. Biomaterials, 2014, 35(1): 500–508. DOI:10.1016/j.biomaterials.2013.09.075
[17] Sun L, Tan R, Xu J, et al. Targeted DNA damage at individual telomeres disrupts their integrity and triggers cell death[J]. Nucleic Acids Res, 2015, 43(13): 6334–6347. DOI:10.1093/nar/gkv598
[18] 张威, 郭文涛, 曾宪旭, 等. RUNX2在宫颈鳞癌组织中的表达及其siRNA对HeLa229细胞RUNX2表达及细胞增殖与凋亡的影响[J]. 郑州大学学报:医学版, 2017, 52(6): 718–721.