吉林大学学报(医学版)  2018, Vol. 44 Issue (04): 704-708

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杨万霞, 苏强, 邢爱华, 张晓延
YANG Wanxia, SU Qiang, XING Aihua, ZHANG Xiaoyan
饥饿对Beclin-1依赖的Ana-1细胞自噬和凋亡的影响
Effects of starvation on autophagy and apoptosis of Beclin-1-dependent Ana-1 cells
吉林大学学报(医学版), 2018, 44(04): 704-708
Journal of Jilin University (Medicine Edition), 2018, 44(04): 704-708
10.13481/j.1671-587x.20180403

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收稿日期: 2017-10-31
饥饿对Beclin-1依赖的Ana-1细胞自噬和凋亡的影响
杨万霞1,2 , 苏强3 , 邢爱华5 , 张晓延2,4     
1. 兰州大学第二医院检验科, 甘肃 兰州 730000;
2. 山西医科大学汾阳学院医学检验系, 山西 汾阳 032200;
3. 山西医科大学第一医院神经内科, 山西 太原 030001;
4. 山西医科大学药学院, 山西 太原 030001;
5. 山西省汾阳医院心内科
[摘要]: 目的: 研究饥饿对Ana-1细胞自噬和凋亡的影响,并探讨其作用机制。方法: 体外培养Ana-1细胞,将细胞分为对照组(饥饿0h)和饥饿3、6、9、12、24h组(饥饿组),观察饥饿对细胞自噬与凋亡的影响;将Ana-1细胞分为空白对照组、饥饿组、3-甲基腺嘌呤(3-MA)组、3-MA联合饥饿组,孵育24 h,采用Western blotting法检测各组细胞中自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值及Beclin-1蛋白表达水平和凋亡相关蛋白Caspase-3蛋白水平,采用倒置显微镜观察饥饿6、12和24 h组细胞形态表现。结果: 与对照组比较,饥饿6、12和24h组Ana-1细胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值,饥饿3、6、9、12和24 h组Ana-1细胞中Beclin-1蛋白表达水平均明显升高(P < 0.05或P < 0.01),饥饿3、6、9、12和24 h组Ana-1细胞中Caspase-3水平明显降低(P < 0.01),呈时间依赖性;倒置显微镜下观察,与对照组比较,不同时间饥饿组细胞形态发生改变,细胞皱缩、出现碎片,随着时间的延长,细胞变化更加明显。与饥饿组比较,3-MA联合饥饿组Ana-1细胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值和Beclin-1蛋白表达水平及Caspase-3蛋白水平均明显降低(P < 0.05或P < 0.01)。结论: 饥饿可诱导Beclin-1依赖的Ana-1细胞自噬并引起细胞凋亡。
关键词: Ana-1细胞    饥饿    Beclin-1    细胞自噬    细胞凋亡    
Effects of starvation on autophagy and apoptosis of Beclin-1-dependent Ana-1 cells
YANG Wanxia1,2, SU Qiang3, XING Aihua5, ZHANG Xiaoyan2,4     
1. Clinical Laboratory, Second Hospital, Lanzhou University, Lanzhou 730000, China;
2. Department of Medical Laboratory, Fenyang College, Shanxi Medical University, Fenyang 032200, China;
3. Department of Neurology, First Hospital, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China;
4. College of Pharmacy, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China;
[Abstract]: Objective: To study the effects of starvation on the autophagy and apoptosis of Ana-1 cells, and to explore their mechanisms. Methods: The Ana-1 cells were cultured in vitro and starved for 0 h(control group), 3, 6, 9, 12 and 24 h(starvation group)to study the effects of starvation on the autophagy and apoptosis.The Ana-1 cells were divided into blank control group, starvation group, 3-methyladenine group(3-MA) and 3-MAcombined with starvation group, and they were incubated for 24 h to explore their mechanisms.The ratio of autophagy associated protein LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ, the expression levels of Beclin-1 and apoptosis-related protein Caspase-3 in the cells in various groups were detected by Western blotting method.Cell morphology 6, 12, and 24 h after starvation was observed by inverted microscope. Results: Compared with control group, the ratio of LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ in the Ana-1 cells in starvation group(6, 12, and 24 h)and the expression levels of Beclin-1 in starvation group(3, 6, 9, 12, and 24 h) were significantly increased(P < 0.05 or P < 0.01), and the Caspase-3 levels in starvation group(3, 6, 9, 12, and 24 h) were decreased significantly(P < 0.05 or P < 0.01) in a time-dependent manner.Compared with control group, the cells in starvation group at different time were changed in shape:the cells shrank, the fragments appeared, and the changes of cells became more obvious with the prolongation of time.Compared with starvation group, the ratio of LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ and the expression levels of Beclin-1 and Caspase-3 in the Ana-1 cells in 3-MA combined with starvation group were decreased significantly(P < 0.05 or P < 0.01). Conclusion: Starvation could induce the autophagy and apoptosis of the Beclin-1-dependent Ana-1 cells.
Key words: Ana-1 cells     starvation     Beclin-1     cell autophagy     apoptosis    

自噬是真核细胞特有的保守性细胞应激信号通路,主要将细胞内受损细胞器或蛋白等运输至溶酶体进行降解和循环利用,以此维持细胞内环境稳态[1-2]。Beclin-1是自噬启动的关键蛋白之一,参与早期自噬体膜的形成,并可通过与Bcl-2结合调控自噬和凋亡的发生[3-4]。自噬的失调与多种疾病的发生发展有关[5]。机体在饥饿、氧化应激等条件下可通过诱导自噬来维持正常免疫功能[6-7]。国内外研究大多聚焦于自噬参与肿瘤、病毒感染的发生发展,而有关自噬与免疫细胞的研究鲜有报道。本研究探讨饥饿对小鼠巨噬细胞Ana-1自噬和凋亡的影响,以及自噬相关蛋白Beclin-1在此过程中发挥的作用,为进一步了解免疫细胞发生自噬、凋亡及其相互调控机制提供参考。

1 材料与方法 1.1 细胞、材料和仪器

Ana-1细胞购于中科院上海细胞生物研究所。RPMI1640培养基、HRP标记的羊抗鼠和羊抗兔二抗及通用蛋白裂解液购自武汉博士德生物工程有限公司,胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司,3-甲基腺嘌呤(3-MA)购自美国Selleck公司,β-actin抗体、Beclin-1抗体、LC3抗体和Caspase-3抗体购自美国Cell Signaling Technology公司,ECL化学发光剂购自美国Millipore公司。电泳仪、垂直电泳槽和转印模块购自美国Bio-Rad公司,酶标仪(Eon)购自美国BioTek公司,荧光显微镜(DM4000)购自德国Leica公司。

1.2 细胞培养和传代

小鼠巨噬细胞Ana-1接种于含10%胎牛血清、1%青链霉素的RPMI1640培养基中,在37℃、含5% CO2的培养箱中培养,每隔12~24h更换新鲜培养液,待细胞长至80%~90%融合时,进行传代。

1.3 Ana-1细胞分组和干预方法

为观察饥饿对Ana-1细胞自噬和凋亡的影响,将生长至对数生长期的细胞接种于不含血清、含1%青链霉素的RPMI1640培养基中培养,分别饥饿0h(对照组)和3、6、9、12、24h(饥饿组),采用Western blotting法检测Ana-1细胞中LC3-Ⅱ/ LC3-Ⅰ比值(饥饿6、12和24 h组)和Beclin-1、Caspase-3蛋白表达水平(饥饿3、6、9、12和24 h组),倒置显微镜下观察各组细胞形态表现。为研究饥饿诱导自噬和凋亡的机制,将细胞分为空白对照组、饥饿组、3-MA(10 μmol·L-1)组和3-MA(10 μmol·L-1)联合饥饿组,各组细胞共同培养24h,采用Western blotting法检测各组Ana-1细胞中LC3-Ⅱ/ LC3-Ⅰ比值和Beclin-1蛋白表达水平及Caspase-3蛋白水平。

1.4 Western blotting法检测各组Ana-1细胞中LC3-Ⅱ/ LC3-Ⅰ比值和Beclin-1蛋白表达水平及Caspase-3蛋白水平

离心收集各组细胞,加入通用细胞裂解液,裂解提取蛋白,BCA法定量并调齐蛋白浓度,加入5×上样缓冲液经煮沸5min,使蛋白变性。细胞总蛋白质经12% SDS-PAGE电泳分离,并用湿法转移到NC膜上;5%脱脂牛奶室温封闭2h后,分别在对应位置孵育LC3抗体(1:1500)、Caspase-3抗体(1:3000)和β-actin抗体(1:1500),4℃过夜;TBST洗涤3次,每次10 min;HRP标记的羊抗兔和羊抗鼠的二抗(1:5000)室温孵育2.5 h,TBST洗涤3次;ECL底物显色、曝光、显影、定影后分析蛋白条带的显色结果。采用Image J软件进行灰度值分析。Beclin-1蛋白表达水平和Caspase-3蛋白水平=每个样本条带灰度值/β-actin灰度值。

1.5 统计学分析

采用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析。各组细胞中LC3-Ⅱ/ LC3-Ⅰ比值和Beclin-1蛋白表达水平及Caspase-3蛋白水平均以x±s表示,多组间样本均数比较采用单因素方差分析。以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果 2.1 各组Ana-1细胞中LC3-Ⅱ/ LC3-Ⅰ比值

与对照组比较,饥饿6、12和24h组Ana-1细胞中LC3-Ⅱ/ LC3-Ⅰ比值明显升高(P<0.05或P<0.01),且呈时间依赖性。见图 1表 1

Lane 1:Control group; Lane 2-4:6, 12, and 24h starvation groups. 图 1 Western blotting法检测各组Ana-1细胞中LC3蛋白电泳图 Figure 1 Electrophoregram of LC3 proteins in Ana-1 cells in various groups measured by Western blotting method
表 1 各组Ana-1细胞中LC3-Ⅱ/ LC3-Ⅰ比值 Table 1 Ratios of LC3-Ⅱ/ LC3-Ⅰ in Ana-1 cells in various groups
(n=3, x±s)
Group LC3-Ⅱ/ LC3-Ⅰ
Control 9.816±0.552
Starvation(t/h)
  6 11.199±0.375*
  12 12.329±0.452**
  24 13.479±0.937**
*P < 0.05,**P < 0.01 compared with control group.
2.2 各组Ana-1细胞中Beclin-1蛋白表达水平和Caspase-3蛋白水平

与对照组比较,饥饿6、9、12和24 h组Ana-1细胞中Beclin-1蛋白表达水平明显升高(P<0.01),饥饿12和24 h组Ana-1细胞中Caspase-3蛋白水平明显降低(P<0.01),且呈时间依赖性。见图 2表 2

Lane 1:Control group; Lane 2-6:3, 6, 9, 12, and 24 h starvation groups. 图 2 各组Ana-1细胞中Beclin-1和Caspase-3蛋白电泳图 Figure 2 Electrophoregram of Beclin-1 and Caspase-3 proteins in Ana-1 cells in various groups
表 2 各组Ana-1细胞中Beclin-1蛋白表达水平和Caspase-3蛋白水平 Table 2 Expression levels of Beclin-1 protein and levels of Caspase-3 protein in Ana-1 cells in various groups
(n=3, x±s)
Group Beclin-1 Caspase-3
Control 0.523±0.027 0.916±0.058
Starvation(t/h)
  3 0.574±0.010 0.876±0.073
  6 0.631±0.040* 0.814±0.063
  9 0.653±0.022* 0.791±0.027
  12 0.686±0.025* 0.729±0.033*
  24 0.772±0.035* 0.704±0.016*
*P < 0.01 compared with control group.
2.3 各组Ana-1细胞的形态表现

饥饿处理Ana-1细胞不同时间后,与对照组比较,饥饿组细胞形态发生改变,出现细胞皱缩和碎片,随着时间的延长,细胞形态变化明显。见图 3

A-C:Control group; D-F:Starvation group; A, D:6 h; B, E:12 h; C, F:24 h. 图 3 各组Ana-1细胞形态表现(×40) Figure 3 Morphology of Ana-1 cells in various groups(×40)
2.4 饥饿诱导自噬和凋亡的机制实验中各组Ana-1细胞LC3-Ⅱ/ LC3-Ⅰ比值和Beclin-1蛋白表达水平及Caspase-3蛋白水平

与空白对照组比较,饥饿组Ana-1细胞中LC3-Ⅱ/ LC3-Ⅰ比值和Beclin-1蛋白表达水平明显升高(P<0.05或P<0.01),Caspase-3蛋白水平明显降低(P<0.05);与饥饿组比较,3-MA联合饥饿组Ana-1细胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值和Beclin-1蛋白表达水平明显降低(P<0.01),Caspase-3蛋白水平也明显降低(P<0.05)。见图 4表 3

Lane 1:Blank control group; Lane 2:Starvation group; Lane 3:3-MA(10 μmol·L-1)group; Lane 4:3-MA(10 μmol·L-1)combined with starvation group. 图 4 各组Ana-1细胞中LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ、Beclin-1和Caspase-3蛋白电泳图 Figure 4 Electrophoregram of LC3-Ⅱ, LC3-Ⅰ, Beclin-1 and Caspase-3 proteins in Ana-1 cells in various groups
表 3 各组Ana-1细胞中LC3-Ⅱ/ LC3-Ⅰ比值和Beclin-1蛋白表达水平及Caspase-3蛋白水平 Table 3 Ratios of LC3-Ⅱ/ LC3-Ⅰ and expression levels of Beclin-1protein and levels of Caspase-3 protein in Ana-1 cells in various groups
(n=3, x±s)
Group LC3-Ⅱ/ LC3-Ⅰ Beclin-1 Caspase-3
Blank control 1.803±0.109 0.484±0.016 1.713±0.098
Starvation 2.328±0.132* 0.578±0.010** 1.484±0.054*
3-MA 2.342±0.273 0.624±0.011 1.553±0.052
3-MA combined with starvation 1.554±0.099△△ 0.411±0.018△△ 1.295±0.032
*P < 0.05,* *P < 0.01 compared with blank control group;P < 0.05,△△P < 0.01 compared with starvation group.
3 讨论

免疫系统的免疫防御、监视和自稳功能是维持机体内环境稳定及生理平衡的重要保障,自噬是生物进化过程中保留下来的高度保守的自我保护机制,Beclin-1基因是第一个被确认的哺乳动物自噬基因,对自噬体的形成至关重要[8]。目前关于免疫细胞自噬的研究较少,因此本研究致力探讨饥饿对小鼠巨噬细胞Ana-1自噬和凋亡的影响,分析自噬关键蛋白Beclin-1在此过程中发挥的作用。

1998年Liang等[9-10]在致死性Sinbis病毒性脑炎的大鼠体内发现了Beclin-1基因,Beclin-1是酵母自噬相关基因Atg6/Vps30的哺乳动物同源基因,位于人染色体17q21位点,主要通过参与组成Ⅲ型磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3KⅢ)复合体募集胞浆中其他自噬相关蛋白,形成蛋白复合体,促进自噬体膜的发生[11-12]。本研究结果显示:在体外,饥饿可以有效地促进Ana-1细胞自噬,随着饥饿时间的延长,LC3-Ⅱ/ LC3-Ⅰ比值升高,与饥饿促进成骨细胞MC3T3-E1自噬的研究[13]结果相似;Beclin-1的表达水平也随着饥饿时间的延长而增加,推测Beclin-1可能参与了饥饿诱导的Ana-1细胞自噬。为研究饥饿诱导的自噬与Beclin-1的关系,本研究采用细胞自噬抑制剂3-MA抑制自噬,结果显示:LC3-Ⅱ/ LC3-Ⅰ比值和Beclin-1蛋白表达水平明显降低,表明饥饿诱导的Ana-1细胞自噬是以Beclin-1依赖的方式进行的,这与3-MA抑制Beclin-1而抑制自噬体的形成[14]相一致。

本研究结果还显示:在体外,饥饿可以诱导Ana-1细胞发生凋亡,饥饿处理后,镜下可见细胞开始皱缩、出现碎片,这种变化随着饥饿时间的延长而加重,另外,Caspase-3水平也明显降低,推断饥饿诱导了Ana-1细胞凋亡的发生,与饥饿下调Bcl-2/Bax从而诱导舌鳞状细胞癌细胞Tca8113凋亡[15]的研究一致。大量研究[16-18]结果显示:Beclin-1与自噬和凋亡的调节均有关联,凋亡抑制因子Bcl-2通过与Beclin-1相互作用抑制蛋白复合物的形成,从而阻止饥饿介导的Beclin-1依赖的细胞自噬的发生。为研究饥饿诱导的Ana-1细胞凋亡与Beclin-1的关系,本研究采用3-MA处理细胞,结果显示:3-MA对饥饿诱导的Caspase-3蛋白降解无抑制作用,反而有促进作用,与Beclin-1的变化不一致,表明饥饿诱导的Ana-1细胞Caspase-3蛋白降解并不依赖于Beclin-1。本研究结果与饥饿状态下3-MA间接促进心肌细胞凋亡[19]和3-MA可增强CPT对HeLa细胞凋亡的敏感性[20]等研究一致。Wirawan等[21]发现:Beclin-1是Caspase的一种底物,Caspase蛋白酶可剪切Beclin-1,形成N端和C端2个主要片段,剪切后的Beclin-1失去自噬启动作用,同时C端片段可以促进线粒体释放促凋亡基因。自噬和凋亡之间存在着错综复杂的关系,如毛地黄黄酮可通过促进巨噬细胞自噬来减弱凋亡[22]

综上所述,饥饿可诱导Ana-1细胞发生Beclin-1依赖的自噬并引起细胞凋亡,本研究结果为外界压力刺激下免疫细胞通过对自噬和凋亡相互调控的研究提供了参考,但其具体机制还有待进一步实验证明。

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