2018, Vol. 44扩展功能
文章信息
- 陈冰, 刘昊川, 李龙云, 赵国庆, 王震, 杨永广, 李凯, 胡正
- 人源化小鼠模型构建和应用的研究进展
- Research progress in establishment and application of humanized mouse models
- 吉林大学学报(医学版), 2018, 44(03): 667-674
- Journal of Jilin University (Medicine Edition), 2018, 44(03): 667-674
- 10.13481/j.1671-587x.20180340
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文章历史
- 收稿日期: 2017-08-27
2. 吉林大学中日联谊医院麻醉科, 吉林 长春 130033;
3. 吉林大学中日联谊医院骨科, 吉林 长春 130033;
4. 吉林大学中日联谊医院皮肤科, 吉林 长春 130033
免疫学是研究机体的免疫系统和免疫应答的规律及调节、以及免疫应答的各种产物和各种免疫现象的一门生物科学，与医学与医学微生物学同时诞生。随着免疫学的发展，活体动物模型的建立和优化也逐渐进步。近交系小鼠背景一致，繁殖周期短并有配套的转基因技术，使其成为免疫学研究的重要动物模型。但是啮齿动物和人类存在巨大的种属差异，某些重要的研究对象如导致艾滋病的人类免疫缺陷(human immunodeficiency virus, HIV)病毒不能感染小鼠细胞，关系我国民生健康的乙型肝炎病毒(HBV)同样不能在普通小鼠中复制，困扰非洲国家的疟疾病原体疟原虫与啮齿类动物疟疾的病原虫不同。因此迫切需要一种具有人类免疫系统、能够模仿人体免疫机能和病理表现的小鼠模型，人源化小鼠模型就是在这样的背景下产生的。经过30余年的研究和发展，人源化小鼠模型已经日趋成熟，但仍有部分人类细胞不能很好地重建，如红细胞和血小板。近几年，人源化小鼠模型已经被证明在解码人类疾病奥秘中具有巨大的优势和广泛的应用前景。
1 人源化小鼠模型演变过程和分类概述人源化小鼠是指将人的细胞、组织和器官移植给小鼠，或是表达人类基因的小鼠。进化上的差异导致小鼠免疫系统对于异种细胞和组织一般具有很强的排斥作用。为解决这一障碍需破坏受体小鼠的自身免疫系统，再通过移植入人的组织或细胞以构建人源化小鼠。因此，早期新型免疫缺陷小鼠的产生常常是人源化小鼠模型进步的重要推动力。
最早的免疫缺陷小鼠是裸鼠(nude mouse)，其foxn1基因缺陷使得胸腺不能发育，故其缺乏成熟的T细胞和依赖T细胞的免疫排斥反应，但由于其仍具有小鼠的B细胞和NK细胞，因此不能够接受人的细胞重构。随后重症联合免疫缺陷(severe combined immunodeficiency，SCID)小鼠出现，该小鼠T细胞和B细胞均存在严重缺陷，胸腺和外周淋巴组织严重萎缩，这些特点使得人的细胞可以在该小鼠上重建，目前常使用的2种重要的人源化小鼠模型PBL-SCID和SCID-hu是通过SCID小鼠构建的。随着免疫缺陷小鼠的优化，非肥胖型糖尿病/重症联合免疫缺陷(nonobese diabetic severe combined immunodeficiency，NOD/SCID)小鼠的出现具有划时代的意义。NOD/SCID小鼠具有如下特点：① NK细胞水平很低，其杀伤功能明显降低；②补体C5缺乏，使得补体活化受到抑制；③在LPS诱导下巨噬细胞分泌IL-1存在缺陷。这些特点使得在NOD/SCID小鼠中更高水平的人细胞和移植组织中能够产生和存活，但是该模型并不十分理想，因为NOD/SCID小鼠仍然有一定缺陷，比如该小鼠因对放射线敏感只能接受较小的辐照剂量，而且较大鼠龄的小鼠会发生T细胞和B细胞渗漏，其平均寿命仅有8个月。另一种基因缺陷小鼠(RAG基因缺陷小鼠)的出现克服了SCID小鼠的一些缺点。RAG基因包括RAG1和RAG2，这2种基因在抗体生成和TCR重排中起重要作用，两者缺陷会使小鼠不产生成熟的T和B细胞，使其能够作为人细胞的转输受体，而且RAG缺陷小鼠对放射线不敏感，无渗漏现象，但是这些小鼠的NK细胞活性较高，从而限制了人的造血干细胞重构。为了进一步降低NK细胞的杀伤功能，研究者又通过改造小鼠基因进行进一步优化，B2m是主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex, MHC)Ⅰ类分子的重要部分，MHCⅠ类分子对NK细胞的发育至关重要。因此NOD/SCID B2m-/-小鼠缺乏具有功能的NK细胞，比NOD/SCID小鼠具有更高水平的人源细胞重建。为了优化模型小鼠，研究者进一步探索可能性，主要的研究方向是通过干扰白细胞介素2 (interleukin2, IL-2)受体的普通伽马链(IL-2Rγc)，该链是形成高亲和力受体的重要组成部分，能编码重要的信号通路组成因子(如细胞因子IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21)[1]。IL-7和IL-15信号的缺陷使小鼠自身NK细胞的发育被阻断，因此可以增强人细胞的移植效果。这一突变又可以和SCID、NOD、RAG1或者RAG2基因突变等通过不同组合的方式进行选择性繁育，生成一批新的重症免疫耐受受体类型小鼠，更适合人细胞的移植[2]。这些小鼠品系包括Rag2-/-γc-/-、Rag1-/-γc-/-(RG)、NOD/shi-scid/γc-/- null (NOG)和NOD/SCID/γc-/- (NSG)。未来的努力方向是将人类白细胞抗原(human lymphocyte antigen, HLA) Ⅰ类和Ⅱ类免疫系统和细胞因子基因导入小鼠，产生更多人抗体和细胞免疫反应的新型转基因小鼠。将不同的人源组织和细胞移植入不同品系的免疫缺陷小鼠中进行人源化小鼠模型的构建，目前比较经典的人源化小鼠模型共有4种。
1.1 Hu-PBL-SCID小鼠模型将人的成熟外周血淋巴细胞(perihperal blood lymphocyte, PBL)注入成年免疫缺陷小鼠(SCID小鼠)体内构建模型，这种人源化小鼠模型称为Hu-PBL-SCID小鼠模型[3]。在该系统中，PBL细胞通过腹腔注射或者静脉注射的方式注入非照射或者是亚致死量照射后的小鼠，接受体内移植后细胞产生的初始细胞群是T细胞。1周后所有引入的T细胞均会获得一种活化的表型，还可以检测到少量的B细胞、髓系细胞或其他免疫细胞。移植入的人源免疫细胞会存在几个星期，并表达相应的效应作用。这些小鼠可以有效地感染人造血系统细胞的HIV-1等病毒。人源记忆性B细胞持续产生针对初始暴露抗原的抗体，而且未产生多向、人类造血干细胞的分化和初次免疫应答。C.B17-SCID小鼠建立Hu-PBL-SCID小鼠模型，该模型不会出现强烈的移植物抗宿主反应，具有以下特点：①可检测到T细胞、B细胞和单个核细胞；②分泌特异性抗体；③会出现由于人类疱疹病毒(epstein-barr virus，EBV)感染导致的B细胞淋巴瘤。现在常用的建模小鼠为NSG或RG小鼠。Hu-PBL-SCID小鼠模型常被用来研究效应T细胞的活性，适用于介导人类皮肤和胰岛异种免疫排斥。该模型的优势是构建所需的材料——人PBL容易获得，构建简便，但其也存在明显不足：人类淋巴细胞重建水平较低且不稳定；人细胞重建后小鼠缺乏正常淋巴组织结构，脾脏中亦无囊泡状生发结构；大量注射人源细胞后导致多数小鼠产生EBV相关淋巴细胞增生性疾病；存在异种移植排斥反应，这些移植后的小鼠在几周内均会产生致死性的移植物抗宿主病(graft-versus-host disease, GVHD)，实验观察窗较短，使得该模型的应用受到限制，但该模型是研究异种GVHD的理想模型。
1.2 SCID-Hu小鼠模型McCune等[4]在1988年通过移植人的胚胎胸腺、注射人胚胎肝脏细胞和移植人淋巴结的方式首次实现了不通过照射破坏宿主免疫系统的情况下实现人到小鼠的异种移植。该模型中人源胚胎胸腺提供人T细胞发育场所，胚胎肝脏细胞提供前体造血细胞，淋巴结提供T细胞和B细胞相互作用场所，该模型被称为SCID-Hu模型。植入小鼠肾被膜下的人胚胎胸腺体积明显增大，在一段时间内外周血出现人T细胞，并存在一定水平的人IgG抗体，说明该模型中存在人T细胞和B细胞的相互作用，进而产生T细胞依赖的抗体，即将含有人造血干细胞的胚胎胸腺植入到SCID小鼠的肾被膜下可产生具有功能性人类胸腺的小鼠模型[5]。小鼠首先产生人胸腺细胞和初始T细胞，T细胞主要定植于胸腺/肝脏类器官，这些部位缺乏外周T细胞循环。由于不能完全产生一整套免疫细胞，所以这些小鼠缺少产生人免疫反应的能力。作为第1个人源化小鼠模型，SCID-Hu小鼠模型有明显的缺陷，如人源细胞重建水平低，人T细胞发育不稳定且存活时间短等。但该模型仍然是研究某些病毒如HIV和人类T淋巴细胞白血病病毒(human T-cell leukemia virus，HTLV)等病原学的有效工具，并为后期新型人源化小鼠模型的构建打下基础[6]。
1.3 Hu-HSC(Hu-SRC-SCID)小鼠模型Hu-HSC小鼠模型的产生主要是为了满足研究造血干细胞的需求，早期研究干细胞的动物模型包括胚胎绵羊和裸鼠等，但这些模型中人干细胞的重组水平非常低。C.B17 SCID小鼠在成功应用于Hu-PBL-SCID和SCID-Hu2种模型的构建后，也被应用于造血干细胞的研究。但在无细胞因子存在的情况下，人骨髓细胞重建水平依然很低。随着NOD/SCID小鼠的出现，这一问题得到有效的解决。该模型首先将人CD34+造血干细胞(hematopoietic stem cells，HSCs)通过静脉注射或者骨髓腔注射的方式注入新生或者成年免疫缺陷受体小鼠中。HSCs获得途径包括骨髓、脐带血和粒细胞集落刺激因子(G-CSF)动员后的外周血或胚胎肝脏。胚胎肝脏和脐带血最常用，因为其较成年人HSCs更易定植于免疫缺陷小鼠。在该小鼠模型中，人T细胞在小鼠胸腺中发育并经过阳性和阴性选择，具有小鼠MHC(H2)限制性。构建该模型主要有2个版本，且版本间有明显的差异。版本一是将人造血干细胞注入成年经过亚致死剂量照射过的NOD/SCID、NSG或NOG小鼠，在这种小鼠中产生多种造血系细胞，但是T细胞产生量很少，虽然该模型能满足干细胞的相关研究，但不具备功能性免疫系统，使得其在免疫学和病理学上应用价值不大。应用新生的IL-2γc-/-小鼠(包括RG、NOG或者是NSG小鼠)可以得到更好的移植效果；版本二是将人造血干细胞经肝内注射入亚致死量照射后的新生RG、NSG或者NOG小鼠中，得到良好的人细胞移植，并且产生T细胞、B细胞、巨噬细胞、NK细胞和DC细胞[2, 7]。Hu-HSC(Hu-SRC-SCID)小鼠模型已经被广泛应用到研究人类造血发育、细胞介导的免疫反应以及HIV和EBV等病毒感染性疾病中。
1.4 FLC(BLT)小鼠模型该模型是对之前的SCID-Hu模型和Hu-HSC-SCID模型进行稍许改进得到的。由于SCID-Hu移植入人胚胎胸腺，其胸腺中有人T细胞发育，但人源化发育水平低且不稳定；Hu-HSC-SCID模型因为采用了亚致死剂量照射，人HSCs转输后会产生大量B细胞和髓系细胞，但是其中完全缺乏人T细胞发育。这2个模型可以互补，Lan等[8]将SCID-Hu和Hu-HSC-SCID两者的优势结合，提出了在亚致死剂量照射下的NOD/SCID小鼠于肾被膜下移植人的胚胎胸腺和胚胎肝脏组织块，并且通过尾静脉注射转输入同源胚胎肝脏分离CD34+HSCs的手段构建新的人源化小鼠模型，结果显示：当仅移植胚胎胸腺和胚胎肝脏组织块时，小鼠体内只产生人T细胞发育(12周后约为5%)，几乎不产生B细胞和髓系细胞发育，而且小鼠整体的人源化水平非常低(12周后约为5%)；如果同时移植人HSCs，则人T细胞重建水平提高(12周后约为20%)，整体的人源化细胞水平也明显提高(12周后约为40%)，并含有大量B细胞和单个核细胞等髓系细胞。同时该人源化小鼠脾脏中出现明显增大的脾脏和淋巴结，脾脏中人T细胞分布于中央动脉的周围，B细胞成团散布在临近T细胞旁边。该模型中除了有IgM的产生，也有大量IgG产生(16周时约为150mg·L-1)，说明T细胞和B细胞能在次级免疫组织中发生相互作用。且该模型能够排斥异种皮肤，这也是首次有研究报道具有免疫功能的人源化小鼠能够排斥组织，从另一角度说明了人免疫系统具有较强功能。另外，该模型能产生针对T细胞依赖抗原DNP23-KLH的抗体，并发生从IgG1到IgG2、IgG3和IgG4的抗体类型转换，且该类型转换的频率和时间跨度也与人免疫系统自然状态相似。这也是首次报道人源化小鼠模型产生T细胞以来的体液免疫反应。既往Chicha等[9]通过将人HSCs转输入新生IL-2Rγc-/-小鼠的方法构建的模型中并未发现该现象。
FLC(BLT)小鼠模型被认为是人源化小鼠发展中的一个里程碑，在2009年于阿姆斯特丹举行的关于人源化小鼠国际会议简报将该模型称为NOD/SCID-fetal liver cell(FLC) MIC。
Chicha等[9]在随后的工作中也重现了该结果，并将该模型命名为BLT，命名的由来是通过移植骨髓、肝脏和胸腺(bone marrow-liver-thymus)。早期的BLT模型采用的是NOD/SCID小鼠，改良后的模型更多采用NSG、NOG或者RG小鼠[8, 10]。这样会有更多T细胞、B细胞、巨噬细胞、NK细胞和树突状细胞通过人源移植组织产生。人自体胸腺的存在使得T细胞能够更好发育并有相应的限制性。
与其他模型比较，BLT模型能够使人源造血系统和免疫系统得到完全发育，人T细胞在人胸腺中发育，并具有HLA限制性，产生更好的移植效果。同时，该模型中有人黏膜免疫系统的发育，使得黏膜相关的免疫学研究得以实现，如经口腔、阴道或直肠途径感染的HIV。小鼠树突状细胞会进入人胚胎胸腺参与人T细胞发育的阴性选择过程，因而由胚胎胸腺组织中发育出的人T细胞大部分可对小鼠抗原产生耐受，因此该模型亦有缺陷，部分实验室报道该模型最终会产生一种类似于GVHD的浪费综合征，但其GVHD症状明显轻于Hu-PBL-SCID小鼠，且并非所有模型小鼠均会产生该症状。这种GVHD的变化性是由于不同研究的细胞集落中成熟T细胞水平或培养液不同造成的，比如微生物菌落不同或抗生素应用量不同。
2 人源化小鼠模型的应用人源化小鼠的建立是为了在疾病发生之前建设能够概括人类特异的生理和病理情况，进而对疾病发展有充分的认识，并能够对新的预防性和治疗性措施进行检测的平台。在许多不同的研究领域基因被修饰人源化小鼠模型已成为有价值工具。人源化小鼠模型的应用很广泛，比如在艾滋病、癌症、传染病和血液病研究领域等均有广泛应用。
2.1 早期人类造血的生理发展随着耐受人HSCs移植的小鼠品系的不断发展，人类早期造血的细节研究飞速发展。人的造血与小鼠的造血过程相似，通过异种移植的方式将人细胞移植入受体小鼠，根据已知候选细胞种群来分离定义相应人造血细胞系。通过这种方法，研究者[11-13]已经定义了人自我更新干细胞和血系定向前体细胞，表明人类造血发育过程与小鼠有少许差别。近年来2个研究小组[12-13]的研究结果显示：限量或者已知含有HSCs的人细胞群中的单个细胞能成功移植入NOG或者NSG小鼠体内，并且经过持续的移入能够维持长期的造血。与小鼠老龄干细胞相似，人类老年人的骨髓表现出明显的表型HSCs数目增加，将这些骨髓移植入小鼠体内后更倾向于分化成髓系细胞而非淋巴系细胞[14]。及时有效地获得患者具有限制性MHC的人HSCs是临床HSCs移植面临的问题，因此人HSCs和造血干细胞祖细胞(hematopoietic stem and progenitor cell，HSPC)的扩展可以代表这些治疗方法应用的主要成就[15]，而人源化小鼠模型将是检验这一成就最好的工具。StemRegenin1是一种能够植入NSG小鼠体内扩增HSCs数目的小分子化合物[16]。虽然HSCs的维持仍然有一定的限制性，但可以将人HSCs移植入小鼠体内数月观察其反馈生存情况，故人源化小鼠目前是评估人HSCs在体内长期存活的最佳标准。
2.2 前体造血系统肿瘤与其他系统或器官肿瘤比较，造血系统肿瘤的样本相对更易获得。自第1个人源化小鼠模型建立以来，SCID和后期的NOD/SCID受体就已经被成功应用于从其他不具有体内肿瘤再生能力的白血病细胞中分离急性髓细胞性白血病(acute myeloid leukemia，AML)启动细胞[17]。研究[18]显示：这些细胞拥有正常HSCs的分子特征，但具有重构异种白血病表型的能力。这些细胞被定义为肿瘤干细胞(cancer stem cells，CSCs)，这些发现促进了旨在定义肿瘤异质性和每个具有启动肿瘤能力细胞的肿瘤生理学新研究[19-20]。CSCs与正常的HSCs相似，可能处于一种休眠状态，因此对于传统的化学治疗有更高的抵抗能力，常常导致根治的失败并能使疾病复发。对于许多分级器官肿瘤而言，CSCs普遍适用，CSCs的基因突变持续进行，是一个移动性靶点。有研究[21]强调环境的选择影响结果，即随着宿主免疫缺陷程度的提高，可以观察到更多更高水平的CSCs。
人造血系统肿瘤细胞在小鼠移植和增殖过程中似乎依赖于疾病的侵犯程度，而不依赖于环境或是自体细胞不规则增殖。因此在小鼠体内人造血系统肿瘤的侵略性增殖并不能反映疾病的临床结果[22]。与侵袭性急性髓系和淋巴系白血病比较，一些侵袭性小的白血病和早期造血系统肿瘤并不能在现存的小鼠体内进行移植。事实上，在体外也很难维持的慢性造血系统肿瘤如骨髓增生异常综合征、骨髓及外骨髓增殖肿瘤或是多发性骨髓瘤的体内异种模型的建立进展缓慢。这些肿瘤的移植模型之所以难以建立的一个重要原因是其所需要的环境因子在现存的受体小鼠中不能提供或是不具有交叉反应。事实上，研究[23]已经证明：骨髓HSCs在某些情况下对于骨髓增生异常综合征的发生发展有重要作用。因此通过基因修饰表达人的因子或者通过移植具有患者来源的龛细胞的生物材料，使小鼠骨髓微环境人源化，可以提供某些肿瘤生存的生长需要的因子。除了有助于了解疾病的病理特征，人源化小鼠模型还可以作为新型分子靶向治疗和临床前评估的重要平台。研究[24-28]显示：在AML细胞中一些细胞外受体表达水平较正常HSCs升高，针对这些分子的抗体或细胞因子的注入会在体内有效地清除AML-CSCs。
2.3 传染性疾病某些对人类更具倾向性的病毒和细菌，如HIV、丙型肝炎病毒(HCV)、EBV和结核杆菌，在全球影响着数亿人的生命并且引起严重的社会经济问题。对于这些感染性病原体病原学和免疫反应的进一步理解对于指导新型疫苗的开发和治疗方法的发展至关重要。与其他非人类灵长类动物模型的高成本和伦理学限制比较，人源化小鼠的出现使这些病原体的体内研究更加简便。
2.3.1 HIV第一批用于研究HIV感染的人源化小鼠模型是Hu-PBL-SCID模型和SCID-Hu模型，在这2个模型中，HIV介导的CD4+T细胞清除可以被演示出来[29-31]。这些模型可以对实验性药物进行体内验证，但是在Hu-PBL-SCID模型中由于缺乏明显的适应性免疫应答反应，输入的人外周血白细胞(PBLs)不能很好地活化且其数量下降，在Hu-SCID模型的外周循环中人细胞缺失，这些均使早期人源化小鼠模型应用受到限制。BRG、NOG和NSG小鼠克服了这些限制。HIV感染后，可以观察到持续的病毒血症和CD4+T细胞的清除，但是针对病毒的特异性适应性免疫应答反应很微弱，只能在一小部分小鼠中检测到，因此需整合这些模型的临床前疫苗研究的应用[32-34]。与此相反，BLT模型中可以在多数感染的小鼠中检测到明显的适应性免疫应答、体液免疫和T细胞免疫[35]。另外BLT人源化小鼠中可以在黏膜上皮中再生出CD4+T细胞，HIV病毒可以通过与人类类似的途径感染小鼠，比如直肠内和阴道内感染[36-37]。BLT小鼠模型是现今研究HIV的首选模型，这个模型已经通过体内应用杀菌剂抑制黏膜HIV感染使概念验证的研究得以实现[38]。
2.3.2 疟疾疟疾是由疟原虫引起的通过蚊虫叮咬传播的传染性疾病，在人体中疟原虫在肝脏中增殖，进而感染红细胞。人体内的疟疾通常由5种疟原虫引起，分别是三日疟原虫、诺氏疟原虫、卵形疟原虫、间日疟原虫和恶性疟原虫。研究重点为后2种，因其传播更广泛、致死性更高。每年数亿人受到疟疾的死亡威胁，尤其是非洲等不发达国家。研究人类疟疾的主要挑战是宿主的选择，因为引起人类疟疾的寄生虫有宿主限制性，但应用黑猩猩等非人类灵长类动物则会引发伦理问题[39]。迄今为止，针对疟疾的有效疫苗并未被研制出来，因此需要一种既有人类免疫系统又能表达人红细胞的动物模型来研究疟疾，从而开发新型药物和疫苗。人源化小鼠是一个良好的选择。现在主要是通过2种方法构建红系嵌合人源化小鼠：持续性人红细胞转输或者是人HSCs移植，通常将2种方法同时使用。研究者[40]应用抗体清除巨噬细胞并持续每天转输人红细胞来研究疟疾，但是当不再注入人红细胞后，也不再有人红细胞存在。对于某些疟原虫，如间日疟，其主要目标是不成熟的红细胞(如网织红细胞)[41]，因此需要一种具有人免疫系统，同时能够不断产生各个阶段人红细胞稳定表达的人源化小鼠模型，这是研究者未来努力的方向。
2.3.3 EBVEBV是一种限制性感染人类和HSCs的γ-疱疹病毒。研究[42-43]表明：通过非自然的途径如腹腔或静脉内感染的方式，人源化小鼠可以被EBV病毒感染。在NSG/NOG小鼠中，人T细胞能够通过CD4和CD8依赖的途径，产生对抗病毒诱导肿瘤进展的反应，从而起到细胞保护作用[43-44]。涉及到新型抗EBV病毒的免疫策略，研究[45]表明：一种实验性备选疫苗能够诱导低水平T细胞应答，但是这些应答是否具有保护作用尚未被验证。
2.3.4 其他感染性疾病人源化小鼠模型还可应用于很多病毒和寄生虫的研究中，如单纯性疱疹病毒2(HSV-2)和人T淋巴细胞病毒1(HTLV-1)。HSV-2病毒感染BRG小鼠可以诱导特异性IgG反应，这一现象较其他病毒少见[46]。而在类似HCV这样的亲肝性疾病中，HCV只感染人的肝脏细胞，人源化小鼠模型中单纯的人造血系统并不能充分模拟出疾病的病理特征和免疫反应。将人的胚胎肝脏细胞和HSPC共同移植，能够模拟HCV感染后体内系统产生的一系列变化，但是针对HCV的特异性免疫应答却未能检测到[47-48]。构建一种同时具有人肝脏细胞和HSCs的小鼠模型可以使亲肝病原体如HBV或者间日疟、恶性疟原虫感染，进而研究乙型肝炎和疟疾[47]。这些体内发现与体外对于初始乳腺癌样本的研究结果一致，表明将固体肿瘤体内体外免疫反应研究相结合非常重要。
2.4 自身免疫性疾病研究自身免疫性疾病需要一个有功能的人免疫系统和相应的靶向器官。这个靶向器官可以是小鼠来源的拥有HLA组分或者具有人类来源HLA的人免疫系统细胞。理论上，所有人类自身免疫性疾病均能建模。这个领域的第一步是建立NOD-Rag1-/-Il2rg-/-Ins2Akita (NRGAkita)小鼠，这个小鼠由于Akita突变而自发产生糖尿病[49]。由于移植人胰岛和不匹配的HSCs，在某些情况下这些胰岛被浸润和排斥。因此，这个模型已经更多地被用于衡量同种异体移植的适应性免疫排斥。另一项关于关节炎模型的研究[50]显示：CXCR3激动剂处理后人外周淋巴细胞不具有趋药性，说明通过在人源化小鼠中暂时性移植来检验治疗效果并不能反映人类疾病的复杂性。
人源化小鼠模型中的靶向组织应该具有对T细胞选择的人MHC分子内源性表达，其部分局限性已经在BLT小鼠模型和改造后的BLT小鼠模型中得到改进[51]。在这个模型中，靶向组织是免疫系统本身，可以产生全套的抗原特异性免疫反应。而在免疫系统以外的自身免疫器官，靶向细胞应该表达合适的人MHC分子。不同人的MHC等位基因与自身免疫相关基因紧密关联，拥有合适的MHC分子对于理解该类疾病至关重要。
2.5 实体肿瘤的研究大多数实体肿瘤的研究均依赖于小鼠肿瘤模型的应用，从而揭示其基本的发生发展规律[52]。与小鼠模型实验比较，初始人类肿瘤更加复杂、进展更加缓慢，并且人免疫系统应答有别于小鼠中所观察到的现象，因此需要采用具有人类抗肿瘤免疫应答的体内模型，尤其对于现今免疫调节治疗的发展至关重要，其中部分模型已经在临床进行应用[53]。建立实体肿瘤的人源化小鼠模型需要移植同一患者的初始人类肿瘤和HSPC，且这两者最好在相同环境背景下表达全部或部分HLA相同，但由于实际原因和伦理问题这很难实现。基于这个方向，有学者[54]将HSPC、相同供体的外周T细胞和乳腺癌细胞系转入NOD-SCID B2m-/-小鼠中。结果显示：CD4+T细胞通过DC-依赖性模式促进早期肿瘤的发展，这一过程可以被IL-13的拮抗剂部分抑制；另外，研究[55]发现TSLP-OX40L在体内可促进肿瘤细胞的增殖。
2.6 人红细胞相关疾病人源化小鼠模型也被应用于人红细胞相关疾病和如疟疾、镰状细胞疾病和再生障碍性贫血等研究[56-57]。以疟疾为例，疟疾是由疟原虫引起通过感染蚊虫叮咬传播的，在人体内，疟原虫通常在肝脏繁殖，进而感染红细胞，故需要构建一种合适的人源化小鼠模型使得2个阶段皆得到模拟[58]。现存的构建人红细胞嵌合体小鼠的方法主要有2种：持续人红细胞输注或人HSCs移植。多数情况下，需将2种方法同时应用。研究者[59]采用抗体将巨噬细胞清除后，每日持续输入足量的人红细胞使得人免疫细胞重建来研究疟疾。但当不再输入人红细胞后，就不会再有人红细胞存在。研究[60]证明：巨噬细胞是导致人红细胞排斥的主要原因，所以应用clodronate-脂质体清除巨噬细胞可以促进人红细胞在人源化小鼠中的重建。同样，这种构建方法存在一定改进的空间，因为clodronate-脂质体对于人源化小鼠是有毒性的，持续大量输入会引起小鼠短时间内死亡，而且在骨髓中小鼠巨噬细胞可促进人红细胞发育，因此构建一个持续表达各个阶段人红细胞的人源化小鼠模型迫在眉睫。
2.7 人源化小鼠模型的局限性由于小鼠和人类之间交叉反应不充分，异种基因环境下人HSCs的发育、存活、活化和迁移分子不充分导致人源化小鼠模型有一定的局限性。
在过去的数十年中，应用新型基因工程技术使人源化小鼠的研究进展突飞猛进，使得其更易操作，更具有经济价值，成为人类健康和疾病临床前期研究的重要模型系统。未来希望人源化小鼠模型能够应用于针对特异性疾病的治疗，比如人初始淋巴系恶性肿瘤的研究需要更好的HSCs髓系细胞的发育，HIV的研究需要一种表达各种生长因子和HLA并产生可靠免疫反应、长期移植的小鼠，而疟疾的研究则需要一种表达人红细胞和肝脏细胞的小鼠模型。人源化小鼠模型的应用前景广阔，可以应用新的技术使其发展，例如疾病特异性胚胎干细胞的产生、诱导多能干细胞以及其后代组织特异性躯体干细胞。未来人源化小鼠模型的研究将会更多应用于高特异性有效的临床前期实验，这在人HSCs发展中已经得到体现。
| [1] | Akkina R. Human immune responses and potential for vaccine assessment in humanized mice[J]. Curr Opin Immunol, 2013, 25(3): 403–409. DOI:10.1016/j.coi.2013.03.009 |
| [2] | Shultz LD, Brehm MA, Bavari S, et al. Humanized mice as a preclinical tool for infectious disease and biomedical research[J]. Ann N Y Acad Sci, 2011, 1245: 50–54. DOI:10.1111/j.1749-6632.2011.06310.x |
| [3] | Mosier DE. Human xenograft models for virus infection[J]. Virology, 2000, 271(2): 215–219. DOI:10.1006/viro.2000.0336 |
| [4] | McCune JM, Namikawa R, Kaneshima H, et al. The SCID-hu mouse:murine model for the analysis of human hematolymphoid differentiation and function[J]. Science, 1988, 241(4873): 1632–1639. DOI:10.1126/science.2971269 |
| [5] | McCune JM. Development and applications of the SCID-hu mouse model[J]. Semin Immunol, 1996, 8(4): 187–196. DOI:10.1006/smim.1996.0024 |
| [6] | Jamieson BD, Zack JA. Murine models for HIV disease[J]. AIDS, 1999, 13(Suppl A): S5–11. |
| [7] | Akkina R. New generation humanized mice for virus research:comparative aspects and future prospects[J]. Virology, 2013, 435(1): 14–28. DOI:10.1016/j.virol.2012.10.007 |
| [8] | Lan P, Tonomura N, Shimizu A, et al. Reconstitution of a functional human immune system in immunodeficient mice through combined human fetal thymus/liver and CD34+ cell transplantation[J]. Blood, 2006, 108(2): 487–492. DOI:10.1182/blood-2005-11-4388 |
| [9] | Chicha L, Tussiwand R, Traggiai E, et al. Human adaptive immune system Rag2-/- gamma(c)-/- mice[J]. Ann N Y Acad Sci, 2005, 1044(1): 236–243. DOI:10.1196/annals.1349.029 |
| [10] | Stoddart CA, Maidji E, Galkina SA, et al. Superior human leukocyte reconstitution and susceptibility to vaginal HIV transmission in humanized NOD-scid IL-2Rr(-/-) (NSG) BLT mice[J]. Virology, 2011, 417(1): 154–160. DOI:10.1016/j.virol.2011.05.013 |
| [11] | Doulatov S, Notta F, Eppert K, et al. Revised map of the human progenitor hierarchy shows the origin of macrophages and dendritic cells in early lymphoid development[J]. Nat Immunol, 2010, 11(7): 585–593. DOI:10.1038/ni.1889 |
| [12] | Baum CM, Weissman IL, Tsukamoto AS, et al. Isolation of a candidate human hematopoietic stem-cell population[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 1992, 89(7): 2804–2808. DOI:10.1073/pnas.89.7.2804 |
| [13] | Notta F, Doulatov S, Laurenti E, et al. Isolation of single human hematopoietic stem cells capable of long-term multilineage engraftment[J]. Science, 2011, 333(6039): 218–221. DOI:10.1126/science.1201219 |
| [14] | Pang WW, Price EA, Sahoo D, et al. Human bone marrow hematopoietic stem cells are increased in frequency and myeloid-biased with age[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2011, 108(50): 20012–20017. DOI:10.1073/pnas.1116110108 |
| [15] | Takizawa H, Schanz U, Manz MG. Ex vivo expansion of hematopoietic stem cells:mission accomplished?[J]. Swiss Med Wkly, 2011, 141: w13316. |
| [16] | Boitano AE, Wang J, Romeo R, et al. Aryl hydrocarbon receptor antagonists promote the expansion of human hematopoietic stem cells[J]. Science, 2010, 329(5997): 1345–1348. DOI:10.1126/science.1191536 |
| [17] | Lapidot T, Sirard C, Vormoor J, et al. A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice[J]. Nature, 1994, 367(6464): 645–648. DOI:10.1038/367645a0 |
| [18] | Bonnet D, Dick JE. Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell[J]. Nat Med, 1997, 3(7): 730–737. DOI:10.1038/nm0797-730 |
| [19] | Dick JE. Stem cell concepts renew cancer research[J]. Blood, 2008, 112(13): 4793–4807. DOI:10.1182/blood-2008-08-077941 |
| [20] | Reya T, Morrison SJ, Clarke MF, et al. Stem cells, cancer, and cancer stem cells[J]. Nature, 2001, 414(6859): 105–111. DOI:10.1038/35102167 |
| [21] | Magee JA, Piskounova E, Morrison SJ. Cancer stem cells:impact, heterogeneity, and uncertainty[J]. Cancer Cell, 2012, 21(3): 283–296. DOI:10.1016/j.ccr.2012.03.003 |
| [22] | Meyer LH, Eckhoff SM, Queudeville M, et al. Early relapse in ALL is identified by time to leukemia in NOD/SCID mice and is characterized by a gene signature involving survival pathways[J]. Cancer Cell, 2011, 19(2): 206–217. DOI:10.1016/j.ccr.2010.11.014 |
| [23] | Raaijmakers MH, Mukherjee S, Guo S, et al. Bone progenitor dysfunction induces myelodysplasia and secondary leukaemia[J]. Nature, 2010, 464(7290): 852–857. DOI:10.1038/nature08851 |
| [24] | Jin L, Hope KJ, Zhai Q, et al. Targeting of CD44 eradicates human acute myeloid leukemic stem cells[J]. Nat Med, 2006, 12(10): 1167–1174. DOI:10.1038/nm1483 |
| [25] | Jin L, Lee EM, Ramshaw HS, et al. Monoclonal antibody-mediated targeting of CD123, IL-3 receptor alpha chain, eliminates human acute myeloid leukemic stem cells[J]. Cell Stem Cell, 2009, 5(1): 31–42. |
| [26] | Kikushige Y, Shima T, Takayanagi S, et al. TIM-3 is a promising target to selectively kill acute myeloid leukemia stem cells[J]. Cell Stem Cell, 2010, 7(6): 708–717. DOI:10.1016/j.stem.2010.11.014 |
| [27] | Majeti R, Chao MP, Alizadeh AA, et al. CD47 is an adverse prognostic factor and therapeutic antibody target on human acute myeloid leukemia stem cells[J]. Cell, 2009, 138(2): 286–299. DOI:10.1016/j.cell.2009.05.045 |
| [28] | Saito Y, Uchida N, Tanaka S, et al. Induction of cell cycle entry eliminates human leukemia stem cells in a mouse model of AML[J]. Nat Biotechnol, 2010, 28(3): 275–280. DOI:10.1038/nbt.1607 |
| [29] | McCune J, Kaneshima H, Krowka J, et al. The SCID-hu mouse:a small animal model for HIV infection and pathogenesis[J]. Annu Rev Immunol, 1991, 9: 399–429. DOI:10.1146/annurev.iy.09.040191.002151 |
| [30] | Namikawa R, Kaneshima H, Lieberman M, et al. Infection of the SCID-hu mouse by HIV-1[J]. Science, 1988, 242(4886): 1684–1686. DOI:10.1126/science.3201256 |
| [31] | Mosier DE, Gulizia RJ, Baird SM, et al. Human immunodeficiency virus infection of human-PBL-SCID mice[J]. Science, 1991, 251(4995): 791–794. DOI:10.1126/science.1990441 |
| [32] | Baenziger S, Tussiwand R, Schlaepfer E, et al. Disseminated and sustained HIV infection in CD34+ cord blood cell-transplanted Rag2-/- gamma c-/- mice[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2006, 103(43): 15951–15956. DOI:10.1073/pnas.0604493103 |
| [33] | Berges BK, Wheat WH, Palmer BE, et al. HIV-1 infection and CD4 T cell depletion in the humanized Rag2-/- gamma c-/- (RAG-hu) mouse model[J]. Retrovirology, 2006, 3: 76. DOI:10.1186/1742-4690-3-76 |
| [34] | Gorantla S, Sneller H, Walters L, et al. Human immunodeficiency virus type 1 pathobiology studied in humanized BALB/c-Rag2-/- gammac-/- mice[J]. J Virol, 2007, 81(6): 2700–2712. DOI:10.1128/JVI.02010-06 |
| [35] | Brainard DM, Seung E, Frahm N, et al. Induction of robust cellular and humoral virus-specific adaptive immune responses in human immunodeficiency virus-infected humanized BLT mice[J]. J Virol, 2009, 83(14): 7305–7321. DOI:10.1128/JVI.02207-08 |
| [36] | Denton PW, Estes JD, Sun Z, et al. Antiretroviral pre-exposure prophylaxis prevents vaginal transmission of HIV-1 in humanized BLT mice[J]. PLoS Med, 2008, 5(1): e16. DOI:10.1371/journal.pmed.0050016 |
| [37] | Sun Z, Denton PW, Estes JD, et al. Intrarectal transmission, systemic infection, and CD4+ T cell depletion in humanized mice infected with HIV-1[J]. J Exp Med, 2007, 204(4): 705–714. DOI:10.1084/jem.20062411 |
| [38] | Denton PW, García JV. Humanized mouse models of HIV infection[J]. AIDS Rev, 2011, 13(3): 135–148. |
| [39] | Siu E, Ploss A. Modeling malaria in humanized mice:opportunities and challenges[J]. Ann N Y Acad Sci, 2015, 1342: 29–36. DOI:10.1111/nyas.2015.1342.issue-1 |
| [40] | Chen Q, Amaladoss A, Ye W, et al. Human natural killer cells control Plasmodium falciparum infection by eliminating infected red blood cells[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2014, 111(4): 1479–1484. DOI:10.1073/pnas.1323318111 |
| [41] | Malleret B, Li A, Zhang R, et al. Plasmodium vivax:restricted tropism and rapid remodeling of CD71-positive reticulocytes[J]. Blood, 2015, 125(8): 1314–1324. DOI:10.1182/blood-2014-08-596015 |
| [42] | Traggiai E, Chicha L, Mazzucchelli L, et al. Development of a human adaptive immune system in cord blood cell-transplanted mice[J]. Science, 2004, 304(5667): 104–107. DOI:10.1126/science.1093933 |
| [43] | Strowig T, Gurer C, Ploss A, et al. Priming of protective T cell responses against virus-induced tumors in mice with human immune system components[J]. J Exp Med, 2009, 206(6): 1423–1434. DOI:10.1084/jem.20081720 |
| [44] | Yajima M, Imadome K, Nakagawa A, et al. T cell-mediated control of Epstein-Barr virus infection in humanized mice[J]. J Infect Dis, 2009, 200(10): 1611–1615. DOI:10.1086/599182 |
| [45] | Gurer C, Strowig T, Brilot F, et al. Targeting the nuclear antigen 1 of Epstein-Barr virus to the human endocytic receptor DEC-205 stimulates protective T-cell responses[J]. Blood, 2008, 112(4): 1231–1239. DOI:10.1182/blood-2008-03-148072 |
| [46] | Kwant-Mitchell A, Ashkar AA, Rosenthal KL. Mucosal innate and adaptive immune responses against herpes simplex virus type 2 in a humanized mouse model[J]. J Virol, 2009, 83(20): 10664–10676. DOI:10.1128/JVI.02584-08 |
| [47] | Washburn ML, Bility MT, Zhang L, et al. A humanized mouse model to study hepatitis C virus infection, immune response, and liver disease[J]. Gastroenterology, 2011, 140(4): 1334–1344. DOI:10.1053/j.gastro.2011.01.001 |
| [48] | Robinet E, Baumert TF. A first step towards a mouse model for hepatitis C virus infection containing a human immune system[J]. J Hepatol, 2011, 55(3): 718–720. DOI:10.1016/j.jhep.2011.02.038 |
| [49] | Brehm MA, Bortell R, Diiorio P, et al. Human immune system development and rejection of human islet allografts in spontaneously diabetic NOD-Rag1null IL2rgammanull Ins2Akita mice[J]. Diabetes, 2010, 59(9): 2265–2270. DOI:10.2337/db10-0323 |
| [50] | O'Boyle G, Fox CR, Walden HR, et al. Chemokine receptor CXCR3 agonist prevents human T-cell migration in a humanized model of arthritic inflammation[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2012, 109(12): 4598–4603. DOI:10.1073/pnas.1118104109 |
| [51] | Kalscheuer H, Danzl N, Onoe T, et al. A model for personalized in vivo analysis of human immune responsiveness[J]. Sci Transl Med, 2012, 4(125): 3003481. |
| [52] | Vesely MD, Kershaw MH, Schreiber RD, et al. Natural innate and adaptive immunity to cancer[J]. Annu Rev Immunol, 2011, 29: 235–271. DOI:10.1146/annurev-immunol-031210-101324 |
| [53] | Sharma P, Wagner K, Wolchok JD, et al. Novel cancer immunotherapy agents with survival benefit:recent successes and next steps[J]. Nat Rev Cancer, 2011, 11(11): 805–812. DOI:10.1038/nrc3153 |
| [54] | Aspord C, Pedroza-Gonzalez A, Gallegos M, et al. Breast cancer instructs dendritic cells to prime interleukin 13-secreting CD4+ T cells that facilitate tumor development[J]. J Exp Med, 2007, 204(5): 1037–1047. DOI:10.1084/jem.20061120 |
| [55] | Pedroza-Gonzalez A, Xu K, Wu TC, et al. Thymic stromal lymphopoietin fosters human breast tumor growth by promoting type 2 inflammation[J]. J Exp Med, 2011, 208(3): 479–490. DOI:10.1084/jem.20102131 |
| [56] | White JC, Pawar A, Fu G, et al. TR2/TR4 overexpression in a humanized sickle cell disease mouse model decreases RBC adhesion to VCAM-1[J]. Blood Cells Mol Dis, 2015, 55(4): 316–317. DOI:10.1016/j.bcmd.2015.07.003 |
| [57] | Good MF, Hawkes MT, Yanow SK. Humanized mouse models to study cell-mediated immune responses to liver-stage malaria vaccines[J]. Trends Parasitol, 2015, 31(11): 583–594. DOI:10.1016/j.pt.2015.06.008 |
| [58] | Cui L, Lindner S, Miao J. Modeling malaria in humanized mice:opportunities and challenges[J]. Ann N Y Acad Sci, 2015, 1342(1): 29–36. DOI:10.1111/nyas.2015.1342.issue-1 |
| [59] | Chen Q, Amaladoss A, Ye W, et al. Human natural killer cells control Plasmodium falciparum infection by eliminating infected red blood cells[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2014, 111(4): 1479–1484. DOI:10.1073/pnas.1323318111 |
| [60] | Hu Z, Van Rooijen N, Yang YG. Macrophages prevent human red blood cell reconstitution in immunodeficient mice[J]. Blood, 2011, 118(22): 5938–5946. DOI:10.1182/blood-2010-11-321414 |