吉林大学学报(医学版)  2018, Vol. 44 Issue (03): 532-536

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杨文延, 刘强, 孙志娟, 杜利清, 徐畅, 王彦, 柳杨, 王芹
YANG Wenyan, LIU Qiang, SUN Zhijuan, DU Liqing, XU Chang, WANG Yan, LIU Yang, WANG Qin
褪黑素对人非小细胞肺癌H1299细胞辐射敏感性的影响
Effect of melatonin on radiosensitivity of non-small cell lung cancer H1299 cells
吉林大学学报(医学版), 2018, 44(03): 532-536
Journal of Jilin University (Medicine Edition), 2018, 44(03): 532-536
10.13481/j.1671-587x.20180314

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收稿日期: 2017-12-29
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杨文延, 刘强, 孙志娟, 杜利清, 徐畅, 王彦, 柳杨, 王芹. 褪黑素对人非小细胞肺癌H1299细胞辐射敏感性的影响[J]. 吉林大学学报(医学版), 2018, 44(03): 532-536.
YANG Wenyan, LIU Qiang, SUN Zhijuan, DU Liqing, XU Chang, WANG Yan, LIU Yang, WANG Qin. Effect of melatonin on radiosensitivity of non-small cell lung cancer H1299 cells[J]. Journal of Jilin University (Medicine Edition), 2018, 44(03): 532-536.
褪黑素对人非小细胞肺癌H1299细胞辐射敏感性的影响
杨文延 , 刘强 , 孙志娟 , 杜利清 , 徐畅 , 王彦 , 柳杨 , 王芹     
中国医学科学院北京协和医学院放射医学研究所天津市放射医学与分子核医学重点实验室, 天津 300192
收稿日期: 2017-12-29
基金项目: 天津市科委自然科学基金资助课题（09JCYBJC09300）；北京协和医学院教学改革项目资助课题（院1444）
作者简介: 杨文延(1992-), 女, 河北省邢台市人, 在读医学硕士, 从事放射生物学方面的研究。
通信作者: 王芹, 副研究员, 硕士研究生导师(Tel:022-85683047, E-mail:wangqin@irm-cams.ac.cn)
[摘要]: 目的: 检测褪黑素（MLT）联合放疗对人非小细胞肺癌（NSCLC）H1299细胞增殖和凋亡的影响，阐明MLT在调节H1299细胞辐射敏感性中的作用。方法: 将H1299细胞分为对照组、MLT组、照射组及照射+MLT组，对照组H1299细胞不作任何处理，MLT组H1299细胞给予不同浓度（100和500 μmol·L-1）MLT，照射组H1299细胞采用137Cs γ射线进行一次性6 Gy照射，照射+MLT组H1299细胞给予100和500μmol·L-1 MLT加6 Gy137Cs γ射线。克隆形成实验检测各组细胞克隆形成数，流式细胞术检测照射后24和48 h各组细胞凋亡率，蛋白免疫印迹法检测各组细胞中核转录因子κB（NF-κB）蛋白的磷酸化水平。结果: 克隆形成实验，与照射组比较，照射+MLT组H1299细胞克隆形成数明显减少（t=7.234，P < 0.01）。流式细胞术，照射后24 h，与对照组比较，照射组和MLT组H1299细胞凋亡率明显升高（t=5.020，t=13.525，P < 0.01），与对照组比较，照射+MLT组H1299细胞凋亡率升高（t=12.884，P < 0.01）；照射后48 h，照射+MLT组H1299细胞凋亡率与照射组比较差异无统计学意义（t=0.394，P>0.05）。蛋白免疫印迹法，照射+MLT组H1299细胞中NF-κB蛋白磷酸化水平低于照射组。结论: MLT联合放疗对人NSCLC H1299细胞有明显的抑瘤效应，提高了NSCLCH1299细胞的辐射敏感性。
关键词: 癌, 非小细胞肺    褪黑素    细胞增殖    细胞凋亡    辐射敏感性    核转录因子κB    
Effect of melatonin on radiosensitivity of non-small cell lung cancer H1299 cells
YANG Wenyan, LIU Qiang, SUN Zhijuan, DU Liqing, XU Chang, WANG Yan, LIU Yang, WANG Qin     
Tianjin Key Laboratory of Radiation Medicine and Molecular Nuclear Medicine, Institute of Radiation Medicine, Chinese Academy of Medical Science & Peking Union Medical College, Tianjin 300192, China
[Abstract]: Objective: To detect the effects of melatonin (MLT) combined with radiotherapy on the proliferation and apoptosis of non-small cell lung cancer (NSCLC) H1299 cells, and to explore the role of MLT in regulating the radiosensitivity of H1299 cells. Methods: The H1299 cells were divided into control group, MLT group, irradiation(IR) group and IR+MLT group. The H1299 cells in control group didn't receive any treatment, the H1299 cells in MLT group were treated with different concentrations of MLT (100 and 500 μmol·L-1), the H1299 cells in IR group were exposed to 6 Gy 137Cs γ-ray, and the H1299 cells in IR+MLT group were treated with different concentrations of MLT (100 and 500 μmol·L-1) and exposed to 6 Gy 137Cs γ-ray. Colony formation assay was used to detect the clone numbers of H1299 cells in various groups; Flow cytometry was applied to detect the apoptotic rates of H1299 cells at 24 and 48 h after irradiation; Western blotting method was performed to detect the phosphorylation levels of nuclear factor kappa B (NF-κB) protein in the H1299 cells in various groups. Results: The colony formation assay results showed that compared with IR group, the clone number of H1299 cells in IR+MLT group was significantly decreased(t=7.234, P < 0.01).The flow cytometry results showed that the apoptotic rates of H1299 cells in IR group and MLT group at 24 h after irradiation were higher than that in control group (t=5.020, t=13.525, P < 0.01); the apoptotic rate of H1299 cells in IR+MLT group at 24 h after irradiation was higher than that in IR group (t=12.884, P < 0.01).There was no significant difference in the apoptotic rate of the H1299 cells between IR+MLT group and IR group at 48 h after irradiation(t=0.394, P>0.05).The Western blotting results showed that the phosphorylation level of NF-κB protein in the H1299 cells in IR+MLT group was lower than that in IR group. Conclusion: MLT combined with radiotherapy has obviously inhibitory effect on the human H1299 cells and can increase the radiosensitivity of H1299 cells.
Key words: cancer, non-small cell lung     melatonin     proliferation     apoptosis     radiosensitivity     nuclear factor kappa B    

非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是临床上最为常见的肺癌类型，其构成比占肺癌80%。NSCLC的主要治疗方式是放射治疗，但其较强的辐射抗性限制了放疗的疗效[1-2]。因此，增加NSCLC细胞的辐射敏感性，提高放疗效果显得尤为重要[3]。利用药物提高放射线对肿瘤细胞的杀伤率以增强放疗效果在临床上应用越来越普遍。褪黑素(melatonin, MLT)是松果体主要在夜间合成与分泌的一种具有多种生物活性的吲哚类物质。MLT可通过外界的光变化向机体传达昼夜节律的信息，进而调节并控制生物节律。此外，MLT还具有抗氧化、抗增殖、免疫调节以及调节内分泌的功能[4-6]。MLT与肿瘤的发生发展及治疗有密切的关系。研究[7-11]显示：在胃癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌以及肝癌中，MLT可以通过抑制肿瘤细胞的增殖诱导肿瘤细胞的凋亡，从而达到抗肿瘤的效果。研究[12]显示：MLT可导致NSCLC细胞凋亡。但MLT联合放疗对NSCLC细胞的影响目前尚未清楚。本研究旨在通过观察MLT联合放疗对NSCLC H1299细胞增殖和凋亡的影响以及细胞中核转录因子κB(nuclear factor kappa B, NF-κB)蛋白的磷酸化水平，探讨MLT在调节NSCLC细胞放射敏感性中的作用。

1 材料与方法 1.1 细胞培养

人肺癌H1299细胞(本实验室保存)采用含10%胎牛血清的DMEM培养液在5% CO2、37℃恒温培养箱中培养，待细胞生长密度约为80%时进行传代培养。选择处于对数生长期的H1299细胞用于后续实验。

1.2 细胞分组和给药方式

将细胞分为对照组、MLT组、照射组和照射+MLT组。其中，照射组和照射+ MLT组的照射条件：采用137Cs γ射线照射源(Autocell40，加拿大原子能有限公司)进行一次性照射，照射剂量为6 Gy，剂量率为1 Gy·min-1。MLT组和照射+ MLT组细胞给予MLT，在细胞克隆形成实验和细胞凋亡率检测实验中给予100 μmol·L-1MLT。

1.3 细胞克隆形成实验检测各组细胞克隆形成数

将H1299细胞以毎皿800个细胞的浓度铺至60 mm培养皿中，待细胞贴壁后，按实验分组(对照组、MLT组、照射组和照射+MLT组)给予相应处理，继续培养10 d，出现肉眼可见的克隆。弃掉培养基，采用吉姆萨染液染色。计数肉眼可见的克隆，采用Image J软件统计各组细胞克隆形成数。

1.4 流式细胞术检测各组细胞凋亡率

分别于照射后24和48 h弃掉培养液，采用不含EDTA的胰酶消化细胞，1 000 r·min-1离心5 min后收集悬浮细胞，采用预冷的PBS缓冲液洗涤细胞，调整每管细胞浓度为1×106mL-1，依次加入Annexin Ⅴ-FITC和PI试剂，室温避光15 min，流式细胞仪(BD Accuri C6型，美国BD公司)检测细胞凋亡率。Annexin-Ⅴ和PI双染色流式检测图分为4个象限：左下象限为活细胞，左上象限为坏死细胞，而右象限均为凋亡细胞，其中右上象限为晚期凋亡细胞，右下象限为早期凋亡细胞，计算细胞总凋亡率。细胞总凋亡率=(早期凋亡细胞数+晚期凋亡细胞数)/总细胞数×100%。

1.5 蛋白免疫印迹法检测H1299细胞中NF-κB蛋白磷酸化水平

于照射后6 h收集对照组、MLT组、照射组和照射+MLT组(MLT给药浓度分别为100和500 μmol·L-1)的H1299细胞，采用RIPA裂解液(康为世纪生物科技有限公司)裂解细胞, 提取总蛋白，采用BCA蛋白浓度测定试剂盒(上海碧云天生物技术公司)测定其总蛋白浓度。取10 μg总蛋白上样，经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)后，采用半干转移法将蛋白转移到聚偏二氟乙烯膜上，用含5%脱脂奶粉的封闭液室温封闭1 h, 采用兔抗小鼠NF-κB抗体(美国Abcam公司，抗体稀释浓度1:500)4℃孵育过夜，洗膜，室温孵育兔免疫原性辣根过氧化物酶标记的小鼠抗兔二抗(美国Proteintech公司，抗体稀释浓度1:5 000)1 h，洗膜后采用增强化学发光法检测NF-κB蛋白磷酸化水平。肉眼观察NF-κB蛋白条带的深浅程度，比较各组H1299细胞中NF-κB蛋白磷酸化水平。

1.6 统计学分析

采用GraphPad Prism 5.0统计软件对数据进行统计学分析。各组细胞克隆形成数和细胞凋亡率均以x±s表示，组间比较采用t检验。以P < 0.05表示差异有统计学意义。

2 结果 2.1 各组H1299细胞克隆形成数

与对照组(336.00±10.58)比较，MLT组H1299细胞克隆形成数(316.67±35.12)差异无统计学意义(t=0.913，P>0.05)，照射组克隆形成数(260.00±10.00)明显减少(t=9.041，P < 0.01)；与照射组比较，照射+ MLT组H1299细胞克隆形成数(184.67±15.01)明显减少(t=7.234，P < 0.01)。见图 1。

A: Control group; B: MLT group; C: IR group; D: IR+ MLT group. 图 1 各组H1299细胞克隆形成数 Figure 1 Clone numbers of H1299 cells in various groups
图选项
2.2 各组H1299细胞凋亡率

照射后24 h，与对照组(5.09%±0.34%)比较，照射组(10.15%± 1.71%)和MLT组(18.13%±1.64%)细胞凋亡率均升高，差异有统计学意义(t=5.020，t=13.525，P < 0.01)；照射+ MLT组细胞凋亡率(25.71%±1.20%)明显高于照射组，差异有统计学意义(t=12.884，P < 0.01)。照射后48 h，与对照组(5.05%±0.37%)比较，照射组(16.54%±0.97%)和MLT组(11.59%±0.74%)细胞凋亡率均升高，差异有统计学意义(t=19.182，t=13.704，P < 0.01)；照射+ MLT组细胞凋亡率(16.27%±0.69%)与照射组比较差异无统计学意义(t=0.394，P>0.05)。见图 2。

图 2 流式细胞术检测各组H1299细胞凋亡率 Figure 2 Apoptotic rates of H1299 cells in various groups detected by FCM
图选项
2.3 各组H1299细胞中NF-κB蛋白磷酸化水平

与对照组比较，照射组H1299细胞中NF-κB蛋白磷酸化水平升高，MLT组H1299细胞中NF-κB蛋白磷酸化水平无明显差异；与照射组比较，照射+ MLT组(100和500 μmol·L-1)H1299细胞中NF-κB蛋白磷酸化水平降低。见图 3。

Lane 1: Control group; Lane 2: IR group; Lane 3: MLT group (500 μmol·L-1MLT); Lane 4: MLT group (100 μmol·L-1MLT); Lane 5: IR+ MLT group (500 μmol·L-1MLT); Lane 6: IR+ MLT group (100 μmol·L-1MLT). 图 3 各组H1299细胞中NF-κB蛋白磷酸化水平电泳图 Figure 3 Electrophoregram of phosphorylation levels of NF-κB protein in H1299 cells in various groups
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3 讨论

肿瘤辐射耐受是肿瘤在接受放疗过程中逐渐适应理化环境的变化、产生放疗抵抗的现象。了解肿瘤细胞产生辐射耐受的机制和寻找具有辐射增敏作用的药物，对肿瘤的放射治疗具有重要意义[13]。NSCLC具有较强的辐射耐受性，这是临床放疗的一大障碍，因此如何利用药物增加NSCLC细胞的辐射敏感性非常重要。

近年来，MLT具有抗肿瘤的作用已被证实[7, 14]。研究[14]显示：在MLT作用下胰腺癌细胞凋亡率随着药物作用时间(72 h内)的延长逐渐升高，肿瘤细胞克隆形成数随着MLT给药浓度的增加而逐渐减少。为评价MLT联合放疗对NSCLC H1299细胞的抑瘤效应，本研究观察MLT联合放疗后H1299细胞增殖和凋亡变化的结果显示：MLT或放疗均能抑制肺癌H1299细胞的增殖，促进其凋亡，与上述文献[14]结论一致；而MLT联合放疗具有更好的抑瘤效应，提示MLT可增强H1299细胞的辐射敏感性，进而提高肿瘤放疗的疗效。

NF-κB是1986年由Sen和Baltimore 2位科学家从B淋巴细胞核提取物中检测到的核蛋白因子，能与免疫球蛋白κ轻链基因增强子κB序列特异性结合。NF-κB广泛存在于细胞中，当细胞受到外源性刺激时，NF-κB活化(即磷酸化)，随后与基因启动子区域的核苷酸序列结合，启动基因转录，参与多种调节反应[15]。NF-κB参与细胞增殖、凋亡、生长分化、细胞周期以及免疫应答等生理过程，还参与肿瘤的发生发展。NF-κB在肿瘤细胞中持续性高表达，并调控其抗凋亡、促存活的靶基因及促进肿瘤细胞的生长增殖[16]。电离辐射可诱导肿瘤细胞中NF-κB进一步高表达，这可能是NSCLC具有辐射抵抗性的原因之一[17-18]。研究[19-20]显示：MLT对肿瘤细胞增殖的抑制作用可能与NF-κB的负调控有关。本研究结果显示：照射组H1299细胞中NF-κB蛋白磷酸化水平升高，这与文献报道的电离辐射可激活NF-κB的表达一致，而单纯MLT处理或MLT联合放疗均能降低H1299细胞中NF-κB蛋白磷酸化水平，提示MLT可能是通过负调控H1299细胞中NF-κB磷酸化水平进而提高H1299细胞的辐射敏感性。

本研究初步揭示了MLT提高H1299细胞辐射敏感性的机制。肿瘤产生辐射耐受的原因错综复杂，细胞周期阻滞、肿瘤微环境、自噬调节及肿瘤干细胞等均有助于增强肿瘤的辐射抵抗性[21]。未来期待从以上4个方面入手进行深入研究，阐明MLT增强H1299细胞辐射敏感性的分子机制，为解决NSCLC辐射抵抗性的难题奠定基础。

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