吉林大学学报(医学版)  2018, Vol. 44 Issue (03): 493-498

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孙成博, 孙波, 刘春禹, 李星儒, 王志琴, 张璟祎, 张雪绵, 王泽红, 于晓艳
SUN Chengbo, SUN Bo, LIU Chunyu, LI Xingru, WANG Zhiqin, ZHANG Jingyi, ZHANG Xuemian, WANG Zehong, YU Xiaoyan
茵陈提取物对糖尿病大鼠肾组织中miRNAs表达谱的影响及其肾脏保护作用
Effect of herba artemisiae capillaris extracts on expression profile of miRNAs in kidney tissue of diabetic rats and its protective effect on kidney
吉林大学学报(医学版), 2018, 44(03): 493-498
Journal of Jilin University (Medicine Edition), 2018, 44(03): 493-498
10.13481/j.1671-587x.20180307

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收稿日期: 2017-08-13
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孙成博, 孙波, 刘春禹, 李星儒, 王志琴, 张璟祎, 张雪绵, 王泽红, 于晓艳. 茵陈提取物对糖尿病大鼠肾组织中miRNAs表达谱的影响及其肾脏保护作用[J]. 吉林大学学报(医学版), 2018, 44(03): 493-498.
SUN Chengbo, SUN Bo, LIU Chunyu, LI Xingru, WANG Zhiqin, ZHANG Jingyi, ZHANG Xuemian, WANG Zehong, YU Xiaoyan. Effect of herba artemisiae capillaris extracts on expression profile of miRNAs in kidney tissue of diabetic rats and its protective effect on kidney[J]. Journal of Jilin University (Medicine Edition), 2018, 44(03): 493-498.
茵陈提取物对糖尿病大鼠肾组织中miRNAs表达谱的影响及其肾脏保护作用
孙成博1 , 孙波1 , 刘春禹2 , 李星儒1 , 王志琴1 , 张璟祎1 , 张雪绵1 , 王泽红1 , 于晓艳1     
1. 吉林大学药学院实验药理与毒理学教研室, 吉林 长春 130021;
2. 吉林省中医院针灸科, 吉林 长春 130021
收稿日期: 2017-08-13
基金项目: 吉林省科技厅科技发展计划项目资助课题（20160101206JC，20160414026GH）；吉林省教育厅"十三五"科技项目资助课题（JJKH20180243KJ）；吉林大学大学生创新创业训练计划资助课题（2017A73347）
作者简介: 孙成博(1991-), 男, 山东省潍坊市人, 医学硕士, 主要从事中药药理学方面的研究。
通信作者: 于晓艳, 副教授, 硕士研究生导师(Tel:0431-85619702, E-mail:yuxy@jlu.edu.cn)
[摘要]: 目的: 观察茵陈提取物（HACE）对糖尿病大鼠肾组织中微小核糖核酸（miRNAs）表达谱的影响，从miRNA角度探讨HACE对糖尿病大鼠的肾脏保护作用及其机制。方法: 采用链脲佐菌素（STZ）复制糖尿病大鼠模型，将60只雄性Wistar大鼠分为对照组（12只）、模型组（24只）和HACE组（24只）。分别于给药8和16周后检测各组大鼠尿白蛋白排泄率和尿蛋白排泄率；HE染色检测大鼠肾组织形态表现；miRNA芯片初步筛查各组大鼠肾组织中miRNAs差异表达谱，对于差异表达在1.74倍以上高丰度的miRNAs筛选阳性miRNAs，采用RT-qPCR验证筛选的miRNAs的相对表达量。结果: 与模型组比较，给药8和16周后HACE组大鼠肾小球系膜聚集等现象明显减轻，尿白蛋白排泄率明显降低（P < 0.05）。miRNA芯片初筛，对照组和模型组大鼠肾组织中有35个差异表达的miRNAs，模型组和HACE组大鼠肾组织中有17个差异表达的miRNAs。RT-qPCR法检测，给药8周后，与对照组比较，模型组大鼠肾组织中miR-1306-3p（P < 0.05）、miR-672-5p（P < 0.05）和miR-3550（P < 0.01）相对表达量明显降低；与模型组比较，HACE组大鼠肾组织中miR-672-5p相对表达量升高（P < 0.05）。给药16周后，与对照组比较，模型组大鼠肾组织中miR-21-5p相对表达量升高（P < 0.01），miR-1306-3p（P < 0.05）、miR-672-5p（P < 0.01）和miR-466d（P < 0.05）相对表达量降低；与模型组比较，HACE组大鼠肾组织中miR-21-5p（P < 0.05）和miR-1306-3p（P < 0.05）相对表达量降低，miR-672-5p相对表达量升高（P < 0.05）。结论: HACE作用后糖尿病大鼠肾组织中miRNAs表达谱出现变化。HACE对糖尿病大鼠的肾脏具有保护作用，其机制可能与miRNAs有关。
关键词: 茵陈提取物    糖尿病肾病    微小核糖核酸    表达谱    
Effect of herba artemisiae capillaris extracts on expression profile of miRNAs in kidney tissue of diabetic rats and its protective effect on kidney
SUN Chengbo1, SUN Bo1, LIU Chunyu2, LI Xingru1, WANG Zhiqin1, ZHANG Jingyi1, ZHANG Xuemian1, WANG Zehong1, YU Xiaoyan1     
1. Department of Experimental Pharmacology and Toxicology, School of Pharmacy, Jilin University, Changchun 130021, China;
2. Department of Acupunture, Jilin Provincial Traditional Chinese Medicine Hospital, Changchun 130021, China
[Abstract]: Objective: To observe the effect of herba artemisiae capillaris extracts (HACE) on the expression profile of microRNA (miRNAs) in the kidney tissue of the diabetic rats, and to explore the protective effect of HACE on the kidney tissue of diabetic rats from the miRNA angle. Methods: A total of 60 male Wistar rats were divided into control group (n=12), model group (n=24) and HACE group (n=24).The urinary albumin excretion rate and urinary protein excretion rate of the rats in various groups were detected. HE staining was used to detect the morphology of the kidney tissue of the rats in various groups after treated for 8 and 16 weeks; miRNAs chips were used to screen the expressions of miRNAs in the kidney tissue of the rats.The positive miRNAs were screened out from those with differentially expression amounts higher than 1.74 times as well as high abundance, and RT-qPCR was used to verify the relative expression amounts of miRNAs. Results: Compared with model group, the glomeruli matrix accumulation of the rats in HACE group(after treated for 8 and 16 weeks) was significantly improved and the urinary albumin excretion rates were decreased(P < 0.05).The miRNAs chips results showed that there were 35 differentially expressed miRNAs in control and model groups and there were 17 differentially expressed miRNAs in model and HACE groups. The RT-qPCR results showed that after treated for 8 weeks, compared with control group, the relative expression amounts of miR-1306-3p(P < 0.05), miR-672-5p(P < 0.05) and miR-3550(P < 0.01) in the kidney tissue of the rats in model group were decreased; compared with model group, the relative expression amount of miR-672-5p in the kidney tissue of the rats in HACE group was increased (P < 0.05).After treated for 16 weeks, compared with control group, the relative expression amount of miR-21-5p in the kidney tissue of the rats in model group was increased(P < 0.01), the relative expression amounts of miR-1306-3p(P < 0.05), miR-672-5p(P < 0.01) and miR-466d(P < 0.05) were decreased; compared with model group, the relative expression amounts of miR-21-5p(P < 0.05) and miR-1306-3p(P < 0.05) in the kidney tissue of the rats in HACE group were decreased, and the relative expression amount of miR-672-5p was increased(P < 0.05). Conclusion: The miRNAs expression profile in kidney tissue of diabetic rats were changed after HACE treatment.HACE has the protectively effect on the kidney tissue of diabetic rats and the mechanism may be associated with miRNAs.
Key words: herba artemisiae capillaris extracts     diabetic nephropathy     microRNAs     expression profile    

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是由糖尿病引起的一种常见的慢性并发症，中医药防治糖尿病有上千年的历史，中西医结合防治DN在我国已成为趋势。微小核糖核酸(miRNAs)是一类含有20~25个核苷酸、具有调控功能的内源性非编码RNAs，约占总基因的4%[1]。近年来，基因芯片和测序等技术的快速发展极大地加速了miRNAs的研究进程，其在DN发病机制中作用的研究也逐步深入，研究[2-13]显示：多种miRNA参与DN的发病过程，由于DN发病机制极其复杂，miRNA参与调控的机制更为复杂，miRNA在DN中的具体表达水平、参与DN发展进程的机制以及参与调控的miRNA的种类和数量仍需更多的科学研究来验证。茵陈为菊科植物茵陈蒿或滨蒿的地上干燥部分，我国大多地区皆有分布，在山西和安徽等地最为常见。潘竞锵等[14-15]研究发现:茵陈蒿可降低糖尿病动物空腹血糖水平，改善糖耐量减退。栾智杰[16]研究发现：茵陈蒿汤可在一定程度上改善肾衰大鼠肾功能，延缓肾脏衰竭。目前关于茵陈与DN的研究较少，且多见于复方，迄今为止尚未检索到基于miRNA水平探讨茵陈对于DN防治作用的研究报道。本课题组前期实验[17]已证实：茵陈提取物(herba artemisiae capillaris extracts，HACE)对DN大鼠肾脏有保护作用。本研究将在前期实验基础上进行深层次的研究，从miRNAs角度探讨HACE干预DN的相关机制。

1 材料与方法 1.1 实验动物、主要试剂和仪器

60只雄性Wistar大鼠，体质量190~220 g，购于吉林大学实验动物中心，动物合格证号：SCXK(辽)2015-0006。HACE购自湖南诺泽生物科技有限公司(批号131122，经高效液相色谱检测绿原酸百分率为1.32%, 对羟基苯乙酮百分率为0.18%)，链脲佐菌素(STZ，美国Sigma公司，批号15215)，All-in-OneTM miRNA qRT-PCR Detection Kit和大鼠miRNAs(广州复能基因有限公司)，其他试剂均为国产分析纯。ABI实时PCR仪(美国应用生物系统公司)，台式高速离心机(中国湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)，日立7150全自动生化分析仪(日本日立公司)。

1.2 DN模型的制备和分组

大鼠适应性饲养1周，禁食12 h后，腹腔注射2%STZ(55 mg·kg-1)复制DN模型；将注射等量0.1 mmol·L-1枸橼酸盐缓冲液的大鼠作为对照组(n=12)。1周后选择血糖水平≥16.67 mmol·L-1、尿糖≥的大鼠视为造模成功糖尿病大鼠。将48只造模成功的糖尿病大鼠随机分为模型组(DN)和HACE组，每组24只。HACE组大鼠每日灌胃HACE(5 g·kg-1)1次，对照组和模型组大鼠每日1次给予等量生理盐水。分别于给药8和16周处死大鼠。在饲养期间，监测各组大鼠血糖和尿糖水平，每周1次。

1.3 大鼠尿白蛋白和尿总蛋白排泄率检测

大鼠处死前代谢笼收集24 h尿量，采用日立7150全自动生化分析仪检测大鼠尿白蛋白和尿总蛋白浓度。尿白蛋白排泄率(mg·24 h-1)=尿白蛋白浓度(g·L-1)×24h尿量(mL)；尿总蛋白排泄率(mg·24 h-1)=尿总蛋白浓度(g·L-1)×24h尿量(mL)。

1.4 HE染色观察大鼠肾组织形态表现

石蜡标本切片后进行常规HE染色，观察大鼠肾组织结构。

1.5 miRNAs基因芯片初筛miRNAs差异表达谱

根据大鼠尿蛋白排泄率结果，在给药8周后各组大鼠中随机挑选2个肾脏，由华联生物科技采用MRmiOA5.0版本芯片测定肾组织中miRNAs表达谱的变化(服务号2r614052802)。miRNAs表达量采用荧光强度表示。

1.6 RT-qPCR法验证大鼠肾组织中miRNAs的相对表达量

分析miRNAs芯片初筛结果，对于差异表达在1.74倍(log2 |Fold change|>0.8)以上、高丰度(信号>800)的miRNAs结合miRNA相关生物信息数据库筛选高表达阳性miRNAs。采用RT-qPCR法分别针对8和16周大鼠肾脏验证筛选的miRNAs的相对表达量。采用△Ct值表示各个miRNAs的相对表达量(△Ct值＝目的基因的Ct值－内参U6的Ct值)。

1.7 统计学分析

采用SPSS 19.0统计软件进行统计学分析。各组大鼠尿白蛋白和尿总蛋白排泄率及各组大鼠肾组织中miRNAs的相对表达量以x±s表示，组间比较采用t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 各组大鼠一般状态、尿白蛋白和尿总蛋白排泄率

一般状态：与对照组比较，模型组大鼠体质量明显减轻，并出现明显的“三多一少”症状，即多饮、多尿、多食及消瘦；HACE组大鼠的状态明显改善。实验过程中大鼠有死亡情况，其中对照组无死亡，模型组死亡2只，HACE组死亡1只。给药8周后，与对照组(0.23 mg±0.05 mg)比较，模型组大鼠尿白蛋白排泄率(0.47 mg±0.11 mg)明显升高(P < 0.05)；与模型组比较，HACE组大鼠尿白蛋白排泄率(0.32 mg±0.13 mg)明显降低(P < 0.05)；尿总蛋白排泄率组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。给药16周后，与对照组(0.36 mg±0.22 mg)比较，模型组大鼠尿白蛋白排泄率(0.79 mg±0.45 mg)明显升高(P < 0.05)；与模型组比较，HACE组大鼠尿白蛋白排泄率(0.46mg±0.22 mg)明显降低(P < 0.05)；尿总蛋白排泄率组间比较差异无统计学意义，但与对照组(16.14 mg±4.75 mg)和HACE组(16.55 mg±13.07 mg)比较，模型组大鼠尿白蛋白排泄率(30.63 mg±29.72 mg)有升高趋势。

2.2 各组大鼠肾组织形态表现

对照组大鼠肾小球大小均匀。8周时模型组大鼠部分肾小球出现轻重程度不同的病变，表现为肾小球体积肿大、系膜区扩大、细胞数目增加；16周时大鼠病变肾小球数目明显增多，病变程度明显加重。8和16周时HACE组大鼠病变肾小球数目均少于模型组，且肾小球体积肿大和系膜区扩大等病变程度也有所减轻。见图 1(插页三)。

A-C:8 weeks; D-F:16 weeks; A, D:Control group; B, E:Model group; C, F:HACE group. 图 1 各组大鼠肾组织形态表现(HE, ×400) Figure 1 Morphology of kidney tissue of rats in various groups(HE, ×400)(seen on page 495in paragraph)
图选项
2.3 miRNA芯片初筛miRNAs差异表达谱

对照组和模型组大鼠肾组织中miRNAs的表达谱中共筛选出35个差异表达的miRNAs，筛选标准为差异表达在1.74倍(log2 |Fold change|>0.8)以上且表达信号>800，其中模型组miRNAs上调的基因23个，miRNAs下调的基因12个。HACE组和模型组大鼠肾组织中miRNAs表达谱中共筛选出差异表达的miRNA17个，其中HACE组miRNAs上调的基因1个，下调的基因16个。见图 2。

图 2 miRNAs芯片差异表达谱 Figure 2 Differential expression profiles of miRNAs chips
图选项
2.4 各组大鼠肾组织中miRNAs相对表达量

对于差异表达的miRNAs结合miRNA相关生物信息数据库筛选出7个与DN密切相关且变化较为明显的阳性miRNAs，即miR-21-5p、miR-1306-3p、miR-92b-5p、miR-672-5p、miR-466d、let-7b和miR-3550。采用RT-qPCR法对这7个miRNAs验证的结果显示：给药8周后，与对照组比较，模型组大鼠肾组织中miRNAs相对表达量明显降低的有miR-1306-3p(P < 0.05)、miR-672-5p(P < 0.05)和miR-3550(P < 0.01)；miR-21-5p和miR-92b-5p表达量虽有降低的趋势，但组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。与模型组比较，HACE组大鼠肾组织中miRNAs相对表达量明显升高的仅有miR-672-5p(P < 0.05)；miR-21-5p、miR-92b-5p和miR-3550相对表达量虽有升高的趋势，但组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。给药8周后表达量发生变化且给予HACE后趋于正常的miRNAs仅有miR-672-5p。见表 1。

表 1 给药8周后各组大鼠肾组织中miRNAs相对表达量(ΔCt) Table 1 Relative expression amounts of miRNAs in kidney tissue of rats in various groups after treated for 8 weeks
(x±s)
Group n miR-21-5p miR-1306-3p miR-92b-5p miR-672-5p miR-466d let-7b miR-3550
Control 12 －1.50±0.23 1.53±0.21 －9.37±1.97 0.51±0.07 2.75±0.13 －1.84±0.29 6.44±0.19
Model 24 －1.26±0.22 3.70±0.43* －8.08±1.52 1.54±0.26* 2.96±0.29 －1.86±0.41 7.68±0.38**
HACE 24 －1.68±0.28 3.83±1.03* －9.26±1.01 0.77±0.11△ 3.56±0.52 －1.73±0.34 7.24±0.55*
* P < 0.05，** P < 0.01 compared with control group；△ P < 0.05 compared with model group.
表选项

给药16周后，与对照组比较，模型组大鼠肾组织中miRNAs相对表达量升高的为miR-21-5p(P < 0.01)，相对表达量降低的为miR-1306-3p(P < 0.05)、miR-672-5p(P < 0.01)和miR-466d(P < 0.05)；与模型组比较，HACE组大鼠肾组织中miRNAs相对表达量降低的有miR-21-5p(P < 0.05)和miR-1306-3p(P < 0.05)，相对表达量升高的有miR-672-5p(P < 0.05)。给药16周后相对表达量变化且给予HACE后趋于正常的miRNAs有miR-21-5p和miR-672-5p。见表 2。

表 2 给药16周后各组大鼠肾组织中miRNAs的相对表达量(ΔCt) Table 2 Relative expression amounts of miRNAs in kidney tissue of rats in various groups after treated for 16 weeks
(x±s)
Group n miR-21-5p miR-1306-3p miR-92b-5p miR-672-5p miR-466d let-7b miR-3550
Control 12 －1.40±0.37 2.26±0.52 －6.80±1.66 1.14±0.26 2.58±0.35 －1.27±0.25 6.04±1.28
Model 24 －3.64±0.38** 3.31±0.94* －6.85±1.44 3.28±0.34** 4.20±0.58* －0.88±0.28 7.60±0.66
HACE 24 －1.79±0.37△ 5.09±0.26△ －7.85±1.76 1.98±0.36△ 5.10±1.00** －0.90±0.21 6.74±0.98
* P < 0.05，** P < 0.01 compared with control group；△ P < 0.05 compared with model group.
表选项
3 讨论

本课题组在前期研究[1]的基础上，应用单次腹腔注射STZ复制DN大鼠模型，从肾功能和肾脏病理学改变等方面观察HACE对DN大鼠不同时期的保护作用，并采用miRNA芯片技术筛选DN大鼠差异表达的阳性miRNAs，对部分阳性miRNAs进行相关的验证。

模型组大鼠尿白蛋白排泄率明显升高，肾组织中肾小球出现不同程度的病理变化，给予HACE治疗后，这二方面均有不同程度的改善，且随着给药时间的延长，其改善作用也随之增强，说明HACE可以缓解DN大鼠肾脏功能和组织形态改变，且不论在DN大鼠的任何阶段，HACH均可在一定程度上保护肾脏，抑制肾脏病变的进展。

miRNA芯片筛查与RT-qPCR验证已成为近年来研究miRNAs差异表达的最常用技术手段。多项研究表明：DN状态下miRNAs表达谱出现变化。彭睿等[18]通过芯片筛查检测早期DN患者中miRNAs差异表达谱发现：有明显差异表达的miRNAs共有49个，其中35个表达量升高，14个表达量降低，RT-qPCR验证结果与芯片一致。张政等[19]通过芯片筛查检测早期DN小鼠肾组织中miRNAs差异表达谱结果显示：有66个miRNAs有明显差异表达，其中35个表达量升高，31个表达量降低，差异倍数为1.08~10.20;RT-qPCR进一步验证其中一部分miRNAs表达结果显示：有3个miRNAs呈高表达，4个miRNAs呈低表达。杨雪唯等[20]研究发现：与正常小鼠比较，DN小鼠肾组织中miR-196a、miR-21、miR-200b表达量明显升高，且与血糖、甘油三酯、总胆固醇、24 h尿蛋白排泄率呈正相关关系。Campion等[21]还提出将miRNAs作为DN诊断与预后的重要生物标记物。本研究结果显示：组间多个miRNAs出现差异表达。结合相关研究[22-23]和生物信息学数据库，本课题组选择了7个与DN密切相关且差异表达在1.74倍(log2|Fold change|>0.8)以上、高丰度(信号>800)miRNAs进行RT-qPCR验证显示：本实验中DN miRNAs表达谱存在一定的差异表达，且在疾病的不同时期miRNAs的表达谱也不同，在DN早期(给药8周)时，miR-21-5p相对表达量变化不明显；DN中期(给药16周)时miR-21-5p相对表达量明显升高。在给药8周时miR-466d相对表达量无明显变化，给药16周时其相对表达量明显降低。而给药8和16周时miR-1306-3p和miR-672-5p相对表达量的变化趋势一致。还有一些miRNAs相对表达量在给药8周时有所变化，给药16周时无变化，如miR-3550。上述结果提示DN时miRNAs的变化较为复杂。给予HACE治疗后，部分miRNAs表达发生了变化，本研究分析2个时间点的RT-qPCR结果显示：造模后出现差异变化且给予HACE后表达量趋于正常的miRNAs有miR-21-5p和miR-672-5p，提示HACE可能通过影响这2个miRNAs表达从而延缓DN的发生发展。

综上所述，本研究在证实了HACE的肾脏保护作用基础上，筛查了大鼠DN不同时期miRNAs表达谱的变化，提示多个miRNAs参与DN的发生发展，且部分miRNAs的变化在给予HACE治疗后可趋向于正常，提示部分miRNAs参与了HACE对DN的干预作用。本文作者下一步计划以miR-21-5p或miR-672-5p作为研究目标，深入探讨其在HACE延缓DN发生发展中的具体机制。

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