间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一类具有自我更新、复制和多向分化潜能的细胞^[1-2]。多项动物研究和早期临床试验^[3-5]证明:异体MSCs移植可用于治疗多种疾病。MSCs移植需要大量细胞，需要对分离的MSCs在移植前进行体外扩增^[6]。随着MSCs体外培养传代次数的增加，其分化潜能和增殖能力逐渐降低，细胞呈现衰老的特征^[7]，成为限制临床应用的严重瓶颈。细胞形态的改变是细胞衰老的重要特征^[8]。通常衰老的细胞体积增大，并呈现扁平状。有研究^[9-10]比较年老和年轻供者来源的骨髓MSCs特征显示：与年轻供者比较，年老供者的MSCs虽具一定的增殖和分化能力，但细胞骨架流动性和重塑性降低，导致了细胞结合、物质转运和物质代谢等功能明显降低，同时细胞对外界理化环境刺激的反应迟缓，从而在功能上影响了MSCs在组织再生修复中的作用。然而细胞骨架影响MSCs衰老的具体机制尚未见相关报道。

细胞骨架由微丝、微管和中间纤维3种结构构成，其中微丝由纤维型肌动蛋白(fibrous actin，F-actin)聚合而成^[11]，细胞骨架蛋白F-actin的聚合可以影响细胞的迁移、增殖和分化等能力^[12-15]。本研究采用人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cells，hBMSCs)体外复制性衰老模型，探讨F-actin及其下游分子YAP在hBMSCs复制性衰老中的变化，使用F-actin抑制剂处理hBMSCs，检测hBMSCs中衰老相关指标的改变，初步阐明其相关分子机制。

本实验所用细胞为hBMSCs，取自车祸患者截肢骨内的骨髓，已获得杭州医学院伦理委员会批准。DMEM培养基和胎牛培养基(美国Gibco公司)，青霉素、链霉素、胰蛋白酶、牛血清白蛋白(BSA)、PBS、4%多聚甲醛、L-谷氨酰胺、鬼丙环肽Phalloidin和Actin-stain 555 Phalloidin(美国Cytoskeleton公司)，F-actin抑制剂Latrunculin B(美国Abcam公司)，YAP一抗和Ki67一抗(上海Santa Cruz公司)，SA-β-Gal染液、成骨诱导液、成软骨诱导液和成脂诱导液(美国Oricell cyagen公司)，488二抗(美国Abbkine公司)。生物安全柜(上海博迅医疗生物仪器股份有限公司)，超净台(苏州医疗器械七厂)，80℃超低温冰箱(美国Thermo公司)，冰冻切片机(德国Microm公司)，水浴锅(美国Millipore公司)，PCR仪(美国Thermo Fisher公司)，灭菌锅(上海博迅医疗生物仪器股份有限公司)，CO₂培养箱和纯水仪(美国Millipore公司)，烘箱和离心机(德国Eppendoff公司)，倒置荧光电子显微镜(日本Olympus公司)，水浴锅(上海医疗器械七厂)，高速离心机(德国Eppendoff公司)，电泳仪(北京六一生物科技有限公司)，Hitachi S-3000扫描电子显微镜(日本Hitachi公司)等。

取车祸患者截肢骨中的骨髓，将取得的骨髓置于无菌肝素管中离心去上清，采用PBS液调整骨髓细胞浓度至1×10⁶ mL^-1，按体积比1:1分别加入Ficoll分离液和骨髓细胞悬液，1 800 r·min^-1离心20 min，吸取界面单个核细胞，采用PBS洗涤2次，加入细胞培养液后以1×10⁶cm^-1的密度接种于25 cm²培养瓶中，置于含5%CO₂、37℃孵箱中培养。

采用胰酶消化hBMSCs(37℃、2 min)后，采用含血清培养基终止胰酶作用，吹打离心(×200 g、5 min)去上清。将细胞重悬于含10%胎牛血清的L-DMEM培养基后进行细胞计数。分别接种至相应孔板中，在成骨诱导液中诱导培养2周，成脂诱导液中诱导培养3周，成软骨诱导液中诱导培养5周，诱导结束后弃去诱导液。分别用茜素红染色、SO染色和油红O染色确定诱导效果。

原代hBMSCs长满后按1:3传代，在含5%CO₂、37℃孵箱中培养。细胞长至80%左右时将细胞分组，分为对照组(P2代hBMSCs，不进行任何处理)、F-actin抑制剂组(2.5 μmol·L^-1 F-actin抑制剂Latrunculin B处理P2代hBMSCs1 h)和P11代hBMSCs组(P2代hBMSCs连续传代得到P11代hBMSCs)。

待各组细胞分别长满至约60%，吸去培养基，PBS清洗3次，每次5 min。4%多聚甲醛溶液固定15 min后，PBS洗去多余固定液。采用0.2%TritonX-100透膜5 min，采用PBS清洗3次，每次5 min。用5% BSA室温封闭30 min，用1%BSA稀释一抗(YAP、Ki67和Acti-stain 555 Phalloidin)，加入稀释好的一抗，置于湿盒里孵育，4℃过夜。次日，采用PBS洗涤3次，每次5 min。在孵育了YAP、Ki67一抗的样本中加入1%BSA稀释的488二抗(山羊抗鼠)避光孵育1 h后，采用PBS洗涤3次。加入DAPI进行细胞核染色5 min，采用PBS洗涤3次，每次5 min。采用免疫荧光封片剂封片，暗盒保存。在激光共聚焦显微镜下观察hBMSCs中Ki67阳性细胞、F-actin的形态和聚合情况及YAP在细胞内的亚细胞定位。

待各组hBMSCs分别长至约70%，吸去培养基，采用PBS洗涤细胞2次，加入1 mL SA-β-Gal染色固定液固定15 min。PBS洗涤3次，每次5 min，每孔加入1 mL染色工作液，37℃孵育过夜。普通光学显微镜下观察显示细胞衰老的SA-β-Gal染色阳性细胞数。

成功分离并培养得到hBMSCs，人骨髓中分离得到的hBMSCs为类成纤维细胞(图 1A，见插页一)，细胞融合时呈现螺旋旋涡样生长。细胞分别在成骨、成脂和成软骨诱导液中诱导后采用茜素红染色、油红O染色和SO染色检测诱导效果。成骨分化诱导后茜素红染色阳性(图 1B，见插页一)，成脂肪分化诱导后油红O染色阳性(图 1C，见插页一)，成软骨分化诱导后SO染色阳性(图 1D，见插页一)，证明分离得到的hBMSCs具有成骨、成脂和成软骨分化的能力。

A: hBMSCs under light microscope(Bar = 200 μm); B: Osteogenic differentiation ability, Alizarin red staining(Bar = 50μm); C:Adipogenic differentiation ability, Oil red staining(Bar =100 μm); D:Chondrogenic differentiation ability, SO staining (Bar = 50 μm). 图 1 hBMSCs的成骨、成脂和成软骨分化能力 Figure 1 Osteogenic adipogenic and chondrogenic differentiation abilities of hBMSCs(seen on page 485in paragraph)

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通过Ki67荧光染色标记各组hBMSCs中处于增殖周期中的细胞，通过SA-β-Gal染色标记各组细胞中衰老的细胞。与对照组比较，P11代hBMSCs组SA-β-Gal染色阳性细胞数明显增多，而Ki67阳性细胞数明显减少。见图 2(插页二)。

图 2 各组hBMSCs在传代过程中细胞衰老的鉴定(Bar = 100 μm) Figure 2 Identification of cell senescence during passage of hBMSCs in various groups(Bar = 100 μm)(seen on page 485in paragraph)

图选项

对照组hBMSCs中的微丝纤维束较多较粗，F-actin长度较长，YAP主要集中在细胞核(YAP在细胞核内为活化态)；P11代hBMSCs组细胞中的微丝纤维束明显减少，F-actin长度变短，YAP主要集中在胞浆(YAP在胞浆为失活态)；同时hBMSCs中YAP出核的细胞SA-β-Gal染色阳性；F-actin抑制剂组F-actin聚合异常，YAP出核失活，SA-β-Gal染色阳性细胞数明显增多。见图 3~5(插页二)。

图 3 免疫荧光染色检测各组hBMSCs中YAP分布和F-actin形态表现(Bar=50 μm) Figure 3 YAP distribution and morphology of F-actin in hBMSCs in various groups detected by immunofluorescence staining(Bar = 50 μm)(seen on page 485in paragraph)

图选项

图 4 荧光染色和SA-β-Gal染色共定位检测P2和P11 hBMSCs中YAP分布(Bar=50 μm) Figure 4 YAP distribution in P2 and P11 hBMSCs detected by fluorescence staining and SA -β- Gal dyeing positioning (Bar = 50 μm)(seen on page 485in paragraph)

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A-E:Control group(Bar=50 μm); F-I:F-actin inhibitor group(Bar=50 μm); J: F-actin inhibitor group (Bar=100 μm); A, F:DAPI fluorescence staining; B, G:Phalloidin fluorescence staining; C, H:YAP fluorescence staining; D, I:Merge; E, J: SA-β-Gal staining. 图 5 荧光染色检测各组hBMSCs衰老形态表现 Figure 5 Morphology of senescence of hBMSCs in various groups detected by fluorescence staining(seen on page 485in paragraph)

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干细胞衰老影响体外培养的MSCs数量和质量，传代次数较多的MSCs临床疗效明显不如传代次数较少的MSCs，使得MSCs衰老成为其临床应用的制约因素^[16]。研究^[17]表明：细胞衰老是老年性疾病的关键致病因子，因此研究MSCs的衰老及相关分子机制具有重要意义。研究^[8]显示:MSCs在传代过程中伴随细胞形态表现的改变，而细胞骨架蛋白决定了细胞的形态结构。本研究结果表明：随着细胞代数的增加，细胞表面积明显增大，微丝纤维束减少，F-actin长度变短、变细且聚合减少。

YAP作为一种多功能转录共激活因子，在MSCs周期进程中起关键作用^[18]。同时，YAP也被认为参与了细胞的衰老过程，YAP表达随着细胞传代次数的增加而逐渐降低，通过敲除YAP可直接诱导人胚肺成纤维细胞和肝脏卫星细胞的衰老^[19-20]。本研究结果显示：YAP在不同代数hBMSCs中的亚细胞定位呈现明显差异，且YAP出核的细胞SA-β-Gal染色阳性。

YAP的生物活性可受F-actin调控，细胞中F-actin的聚合差异可以导致YAP的细胞定位不同，从而影响细胞的迁移、增殖或分化^{[11-14, 21]}。因此本文作者探讨了F-actin是否通过调节YAP活性影响hBMSCs的衰老。本研究结果显示：F-actin抑制剂可以促进YAP出核失活，同时明显增加SA-β-Gal染色阳性的细胞。

综上所述，F-actin和YAP参与了hBMSCs的衰老过程，F-actin抑制剂可以抑制F-actin聚合，进一步调节YAP的出入核从而影响hBMSCs的衰老。本研究结果从分子生物学角度为MSCs的衰老提供了新的认知，MSCs具有广阔的临床应用前景。