吉林大学学报(医学版)  2018, Vol. 44 Issue (02): 315-320

扩展功能

文章信息

张艳霞, 李跃辉, 张丽红, 张年萍, 闫燕艳, 杨小会, 冯湘玲
ZHANG Yanxia, LI Yuehui, ZHANG Lihong, ZHANG Nianping, YAN Yanyan, YANG Xiaohui, FENG Xiangling
沉默HOXA13基因对肝癌HepG2和QGY-7703细胞恶性表型的影响
Effects of silencing HOXA13 gene on malignant phenotypes of hepatocellular carcinoma HepG2 and QGY-7703 cells
吉林大学学报(医学版), 2018, 44(02): 315-320
Journal of Jilin University (Medicine Edition), 2018, 44(02): 315-320
10.13481/j.1671-587x.20180220

文章历史

收稿日期: 2017-05-02
沉默HOXA13基因对肝癌HepG2和QGY-7703细胞恶性表型的影响
张艳霞1 , 李跃辉2 , 张丽红1 , 张年萍1 , 闫燕艳1 , 杨小会3 , 冯湘玲3     
1. 山西大同大学医学院, 山西 大同 037009;
2. 中南大学基础医学院肿瘤研究所, 湖南 长沙 410078;
3. 中南大学湘雅公共卫生学院, 湖南 长沙 410078
[摘要]: 目的: 探讨沉默HOXA13基因对肝癌细胞株HepG2与QGY-7703恶性表型的影响,为肝癌的诊断及治疗提供新的分子靶点。方法: 构建HOXA13基因的干扰重组质粒plent-U6-GFP/si-HOXA13,将其稳定转染至HepG2与QGY-7703细胞;采用RT-PCR和Western blotting法鉴定干扰效果;以HOXA13基因沉默细胞为实验组,以转染空质粒的细胞为对照组,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法、细胞倍增时间测定、平板克隆形成实验和流式细胞术等分析HOXA13基因沉默后HepG2与QGY-7703细胞生长速度、细胞倍增时间、克隆形成能力和细胞周期等的改变。结果: MTT实验,与对照组比较,实验组细胞的生长速度明显下降;其细胞周期也发生改变,G1期细胞增多、S期细胞减少。对照组HepG2和QGY-7703细胞平均倍增时间分别为(4.59±0.27)和(4.93±0.17)h,实验组HepG2和QGY-7703细胞平均倍增时间分别为(6.02±0.86)和(6.43±0.66)h,2组间比较差异有统计学意义(P < 0.05)。对照组HepG2和QGY-7703细胞平均细胞克隆形成数分别为(264.00±12.62)和(269.00±4.55)个,实验组HepG2和QGY-7703细胞平均细胞克隆形成数目分别为(165.00±10.61)和(215.00±4.43)个,2组比较差异有统计学意义(P < 0.01)。结论: HOXA13基因可以使肝癌细胞HepG2与QGY-7703的增殖加快、克隆形成能力增强、G1期细胞减少、S期细胞增多,可以成为肝癌诊断和治疗新的分子靶点。
关键词: HOXA13    肝肿瘤    细胞增殖    克隆形成    细胞周期    
Effects of silencing HOXA13 gene on malignant phenotypes of hepatocellular carcinoma HepG2 and QGY-7703 cells
ZHANG Yanxia1, LI Yuehui2, ZHANG Lihong1, ZHANG Nianping1, YAN Yanyan1, YANG Xiaohui3, FENG Xiangling3     
1. School of Medical Sciences, Shanxi Datong University, Datong 037009, China;
2. Cancer Research Institute, School of Basic Medical Sciences, Central South University, Changsha 410078, China;
3. School of Xiangya Public Health, Central South University, Changsha 410078, China
[Abstract]: Objective: To investigate the effects of silencing HOXA13 gene on the malignant phenotypes of hepatocellular carcinoma cell lines HepG2 and QGY-7703, and to provide a new molecular target for the diagnosis and treatment of hepatocellular carcinoma. Methods: The interference recombinant plasmid of plent-U6-GFP/si-HOXA13 was constructed, then it was stably transfected into the HepG2 and QGY-7703 cells.The interfering effects of HOXA13 gene were determined by RT-PCR and Western blotting methods.The HepG2 and QGY-7703 cells transfected with HOXA13 knockdown were used as experimental group, and the HepG2 and QGY-7703 cells transfected with empty plasmid were used as control group.Then the growth speed was examined by MTT assay, the cell doubling time was examined by double time assay, the colony formation ability was examined by colony formation assay, and the cell cycle was examined by flow cytometry. Results: The MTT assay results showed that compared with control group, the growth speeds of HepG2 and GY-7703 cells in experimental group were significantly decreased and the cell cycles were changed; the number of HepG2 and QGY-7703 cells in G1 phase was increased and the number of cells in S phase was decreased.The doubling time of HepG2 and QGY-7703 cells in control group and experimental group were (4.59±0.27), (4.93±0.17), (6.02±0.86), and (6.43±0.66)h, and the differences between control group and experimental group were significant(P < 0.05).The colony number of HepG2 and QGY-7703 cells in control group and experimental group were 264.00±12.62, 269.00±4.55, 165.00±10.61, and 215.00±4.43, and the differences between control group and experimental group were significant(P < 0.01). Conclusion: HOXA13 can increase the proliferation, enhance the clone formation, decrease the number of cells at G1 phase and increase the number of cells at S phase in the hepatocellular carcinoma HepG2 and QGY-7703 cells; and it may used as a new molecular target for diagnosis and treatment of hepatocellular carcinoma.
Key words: HOXA13     liver neoplasms     malignant phenotype     cell proliferation     colony formation     cell cycle    

同源盒(homeobox, HOX)基因最初是在研究果蝇的胚胎发育调控过程中被发现,是形态发生、细胞分化和维持成体细胞稳定的主要调节基因,其绝大多数分散在整个基因组,只有39个HOX基因,即HOX基因家族,有序地排列在特定的染色体上[1]。越来越多的研究显示:HOX基因表达改变与多种实体肿瘤密切相关,如肺癌[2]、乳腺癌[3]和口腔癌[4]等。Cillo等[5]研究发现:HOXA13在肝癌样本中高表达,而在相对应的癌旁组织中低表达,但对于HOXA13在肝癌发生发展过程中的作用目前少有报道。本研究采取RNA干扰技术,使HOXA13基因在肝癌细胞中低表达,进而从基因水平研究HOXA13对肝癌细胞恶性表型的影响。

1 材料与方法 1.1 细胞和主要试剂

人肝癌细胞株HepG2和QGY-7703购自中南大学细胞中心。plent-U6-GFP载体(山东维真生物技术有限公司),新生小牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司),嘌呤霉素(研科生物试剂公司),RPMI-1640培养基(美国Gibco公司),细胞培养板、MTT和DMSO(北京鼎国昌盛技术有限责任公司),Lipofectamine 2000 Reagent(上海英维捷基贸易有限公司),Giemsa染料和碘化丙啶(PI)(美国Sigma公司)。

1.2 plent-U6-GFP/si-HOXA13重组载体构建

从GenBank中提取HOXA13基因序列(序列号:NM_000522),设计、合成HOXA13基因的干扰序列5′-CAGAATCGTATTGGTTACA-3′,并定向克隆入plent-U6-GFP载体,构建plent-U6-GFP/si-HOXA13重组载体,并以空载体plent-U6-GFP为对照。

1.3 细胞转染

将HepG2和QGY-7703细胞接种于24孔细胞培养板;第2天转染,具体操作方法参照脂质体2000(Lipofectamine 2000)产品说明书。A液制备:分别取2 μL Lipofectamine 2000与48 μL无血清RPMI-1640培养基轻轻混匀,37℃、5%CO2培养箱放置5 min;B液制备:分别取1 μg重组质粒plent-U6-GFP/si-HOXA13和1 μg对照质粒plent-U6-GFP与49 μL无血清RPMI-1640培养基轻轻混匀,37℃、5%CO2培养箱放置5 min;将A液和B液混匀,静置25 min;将待转染的HepG2和QGY-7703细胞用D-Hank’ s液洗1次,然后加入450 μL无血清RPMI-1640,再分别将上述A液和B液混合溶液加至板中,混匀后培养4~6h;换新鲜的无抗生素的RPMI-1640,48h后传代,然后加含1 mg·L-1嘌呤霉素的RPMI-1640筛选阳性克隆。

1.4 RT-PCR法鉴定HOXA13干扰效果

按FERMENTAS产品说明书进行,具体操作如下:取细胞总RNA 2 μg,加Oligo(dt)18引物1 μL,加无Rnase的去离子水12 μL,轻轻混匀后,70℃、5 min;迅速将取出的PCR管放于冰上冷却,再加入5×Reaction buffer 4 μL,Ribonuclease inhibitor 1 μL和dNTP mix 2 μL,轻轻混匀后,70℃、5 min;再加1 μL RevertAidTMM-MuLV Reverse transcriptase,轻轻混匀,42℃、60 min,70℃、10 min,反应终止后进行PCR。PCR条件:95℃、1 min预变性;95℃、30s,60℃、30s,68℃、90s,循环28次;68℃延伸10 min。PCR扩增产物,采用1% Agaross凝胶(含0.8%Goldview)电泳进行鉴定。人HOXA13引物:正向引物5′-GGCCTTACCACCACCATCAG-3′,反向引物5′-TGGCGTATTCCCGTTCAAGT-3′,扩增产物片段长度为315 bp。GAPDH引物:正向引物5′-AATCCCATCACCATCTTCCA-3′,反向引物5′-CCTGCTTCACCACCTTCTTG-3′,扩增产物片段长度为580 bp。

1.5 Western blotting法鉴定HOXA13干扰效果

分别制备5%的浓缩胶和10%的分离胶;样品制备:分别取50 μg蛋白样品,加5%的巯基乙醇,在100℃下煮沸5 min;电泳:先在70V电压下电泳约30 min,然后在100V电压下电泳约2h;转膜:分别将滤纸、SDS-PAGE胶、转印膜、滤纸按负极到正极的顺序放置在转膜装置上,100 mA转膜2h;抗体孵育:将转印后的转印膜置于封闭液中,4℃过夜。将转印膜取出,放于含1:400稀释的Rabbit Anti-Human HOXA13的抗体溶液中,置于恒温摇床上反应2 h,将膜取出漂洗3次,每次3~5 min,再加1:3000稀释的Mouse Anti-Rabbit IgG-HRP的抗体溶液中,置于恒温摇床上反应1h;PBST漂洗3次,每次3~5 min;暗室内进行曝光、显影和定影;胶片扫描。

1.6 实验分组

以HOXA13基因沉默的HepG2和QGY-7703细胞(HepG2/si-HOXA13和QGY-7703/si-HOXA13)为实验组,以转染空质粒的HepG2和QGY-7703细胞(HepG2/C和QGY-7703/C)为对照组。

1.7 MTT法检测细胞生长速度

各组细胞均按5×103/孔的数量分别接种于96孔板,然后在培养箱中放置24h;分别加MTT(终浓度为5 g·L-1),再继续培养4 h;吸尽上层液体,再分别加入200 μLDMSO,约8 min后,酶标仪490nm处测吸光度(A)值。以A值为纵轴,时间为横轴绘制HepG2/si-HOXA13、QGY-7703/si-HOXA13、HepG2/C和QGY-7703/C细胞生长曲线图,比较2组细胞的生长速度。

1.8 细胞倍增时间检测

实验组和对照组细胞以1×103个细胞/孔接种于24孔板,第2天收集细胞并计数。按以下计算公式计算HepG2/si-HOXA13、QGY-7703/si-HOXA13、HepG2/C和QGY-7703/C细胞的平均倍增时间:TD=t[lg2/(lgNt1-lgN0)](TD为细胞倍增时间,t为培养时间,N0、Nt分别代表接种后及培养t小时后的细胞数)。

1.9 平板克隆形成能力检测

实验组和对照组细胞均按1000个细胞/孔接种于6孔板,在培养箱中放置2~3周;终止培养后,甲醇固定15 min;Giemsa染色15 min,洗去染色液,空气风干;计算克隆数(多于50个细胞者为1个克隆)。

1.10 细胞周期检测

将实验组和对照组细胞以5×104个接种于培养瓶,24 h后,用不完全培养基培养12 h;再换完全培基,第2天收集细胞,用D-Hank’s液将细胞漂洗2次,PI染色25~35 min。流式细胞仪分析细胞周期分布情况。

1.11 统计学分析

采用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析。对照组和实验组细胞平均倍增时间和克隆形成数均以x±s表示,2组间比较采用方差分析和SNK-q检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 沉默HOXA13基因细胞系的构建

分别将重组质粒plent-U6-GFP/si-HOXA13和对照质粒plent-U6-GFP用Lipofectamine 2000转染HepG2和QGY-7703细胞,经2 mg·L-1嘌呤霉素筛选约14d,挑单克隆扩大培养,首先采用RT-PCR法分别检测HepG2/plent-U6-GFP/si-HOXA13、HepG2/plent-U6-GFP、QGY-7703/ plent-U6-GFP/si-HOXA13和QGY-7703/ plent-U6-GFP细胞中的HOXA13 mRNA表达水平,结果显示:实验组HepG2/plent-U6-GFP/si-HOXA13和QGY-7703/plent-U6-GFP/si-HOXA13细胞中HOXA13 mRNA表达水平明显低于对照组,而对照组HepG2/plent-U6-GFP和QGY-7703/plent-U6-GFP细胞HOXA13 mRNA水平明显无变化(图 1 AB),分别将HepG2/plent-U6-GFP/si-HOXA13、QGY-7703/ plent-U6-GFP/si-HOXA13、HepG2/ plent-U6-GFP和QGY-7703/ plent-U6-GFP细胞系命名为HepG2/si-HOXA13、QGY-7703/si-HOXA13、HepG2/C和QGY-7703/C。进一步采用Western blotting法分别检测实验组和对照组HepG2/si-HOXA13、QGY-7703/si-HOXA13、HepG2/C和QGY-7703/C细胞中HOXA13蛋白表达水平,结果显示:实验组HepG2/si-HOXA13和QGY-7703/si-HOXA13细胞中HOXA13蛋白表达水平明显低于对照组(图 1 CD),结果与RT-PCR法检测结果一致。说明沉默HOXA13细胞系建立成功,可用于后续实验。

Lane 1:HepG2/C cells; Lane 2:HepG2/si-HOXA13 cells; Lane 3:QGY-7703/C cells: Lane 4:QGY-7703/si-HOXA13 cells. 图 1 RT-PCR (A, B)和Western blotting (C, D)法检测稳定转染plent-U6-GFP/si-HOXA13和plent-U6-GFP细胞中HOXA13表达电泳图 Figure 1 Electrophoregram of expressions of HOXA13 in cells transfected with plent-U6-GFP/si-HOXA13 and plent-U6-GFP detected by RT-PCR(A, B) and Western blotting(C, D) methods
2.2 2组细胞生长曲线

与对照组HepG2/C和QGY-7703/C细胞比较,实验组HepG2/si-HOXA13和QGY-7703/si-HOXA13细胞的生长速度明显下降。见图 2

图 2 MTT法检测2组HepG2 (A)与QGY-7703 (B)细胞的生长曲线 Figure 2 Growth curves of HepG2(A) and QGY-7703(B) cells in two groups detected by MTT method
2.3 2组细胞倍增时间

HepG2/C和HepG2/si-HOXA13细胞平均倍增时间分别为(4.59±0.27)和(6.02±0.86)h;QGY-7703/C和QGY-7703/si-HOXA13细胞平均倍增时间分别为(4.93±0.17)和(6.43±0.66)h;实验组HepG2/si-HOXA13和QGY-7703/si-HOXA13细胞的平均倍增时间明显延长,与对照组比较差异有统计学意义(P < 0.05)。

2.4 2组细胞克隆形成数

HepG2/C和HepG2/si-HOXA13细胞克隆形成数分别为(264.00±12.62)和(165.00 ±10.61)个;QGY-7703/C和QGY-7703/si-HOXA13细胞克隆形成数分别为(269.00±4.43)和(215.00±4.50)个;实验组HepG2/si-HOXA13和QGY-7703/si-HOXA13细胞克隆形成数明显低于对照组(P < 0.01)。见图 3

A, B:Control group; C, D:Experimental group; A, C:HepG2 cells; B, D:QGY-7703 cells. 图 3 平板克隆形成实验检测2组细胞的克隆形成能力 Figure 3 Abilities of colony formation of cells in two groups detected by colony formation assay
2.5 2组细胞周期的分布

HepG2/si-HOXA13和QGY-7703/si-HOXA13细胞G1/G0期细胞比例分别是(59.90±3.10)%和(55.19±2.10)%;S期细胞比例分别是(25.00±2.17)%和(32.71±2.07)%;G2/M期细胞比例分别是(13.10±1.23)%和(12.10±1.23)%。而HepG2/C和QGY-7703/C细胞G1/G0期细胞比例分别是(52.72±3.26)%和(47.12±2.26)%;S期细胞比例分别是(34.56±2.77)%和(41.78± 2.57)%;G2/M期细胞比例分别是(12.10±1.52)%、(11.10±1.49)%。与对照组比较,实验组HepG2/si-HOXA13和QGY-7703/si-HOXA13细胞G1期比例增多,S期细胞比例减少。见图 4

A, B Control group; C, D Experimental group; A, C:HepG2 cells; B, D:QGY-7703 cells. 图 4 流式细胞术检测2组细胞的细胞周期 Figure 4 Cell cycles of cells in two groups detected by flow cytometry
3 讨论

HOX基因是调控机体发育、细胞增殖与分化的主要分子之一[6],分为HOXA、HOXB、HOXC和HOXD 4种类型,各自排列在一条特定的染色体上[7]。越来越多的研究[8-10]显示:HOX异常与人类许多肿瘤的发生和进展有关联。Vider等[11]研究发现:HOXB6、HOXB8、HOXC8和HOXC9基因在结肠癌细胞CaCo-2和HT-29中表达上调。有研究[12]显示:HOXA1、HOXA5、HOXA10和HOXC6基因在肺癌样本中的表达明显升高,其中以HOXA5和HOXA10基因的差异表达尤为明显。Kanai等[13]发现:HOXA9、HOXB3、HOXB8和HOXB9在肝癌样本中的表达明显升高。Quagliatat等[14]发现HOXA13在肝癌组织中高表达与肝癌预后不良有密切关联。

本实验结果显示:HOXA13基因沉默以后,HepG2和QGY-7703细胞的体外生长速度明显降低,细胞倍增时间明显延长,克隆形成能力也明显降低,表明可能是基因水平的改变导致了HOXA13蛋白表达减少,从基因水平印证了HOXA13可以使肝癌细胞的生长速度明显加快、细胞倍增时间明显缩短、克隆形成能力也明显增加,从而增殖速度加快、成瘤能力增加,加速了肿瘤发生发展的进程,导致其预后不良,与Quagliatat等[14]的研究结果趋势一致。另外,肝癌细胞的生长速度明显加快,细胞倍增时间明显缩短,而血管形成相对不足导致营养供应不足,从而肿瘤更容易发生出血、坏死等继发改变,更容易破坏局部组织和发生远处转移,这也是导致肿瘤不良预后的原因[15]。可见HOXA13可以使肝癌的恶性程度增加。

Gu等[16]研究HOXA13对食管鳞癌的促瘤作用发现:HOXA13沉默后,食管鳞癌细胞的克隆形成能力、裸鼠成瘤能力均明显降低。Li等[7]研究发现,HOXA7基因有效沉默后,HepG2和QGY-7703细胞体外生长速度明显减慢,细胞周期也发生改变,即G1期细胞比例升高,S期细胞比例降低,裸鼠体内成瘤能力也下降,并且发现细胞周期蛋白E1和细胞周期蛋白2表达水平也明显下降。且在正常肝细胞中采用基因重组的方法使HOXA7过表达后,肝细胞的体外增殖速度加快,细胞周期蛋白E1和细胞周期蛋白2水平明显升高。说明HOXA7能促进肝细胞增殖,与细胞周期蛋白E1和细胞周期蛋白2介导有关。本实验中HOXA13基因有效沉默后,HepG2和QGY-7703细胞周期分布发生明显变化,G1期细胞增多,S期细胞减少,可能是HOXA13在HepG2和QGY-7703细胞中的表达具有周期依赖性,以维持HepG2和QGY-7703细胞的有丝分裂,其机制尚需进一步证实。

综上所述,有效沉默HOXA13后,可引起肝癌细胞周期阻滞、细胞倍增时间明显延长和增殖能力明显降低,说明HOXA13在肝癌的发生发展过程中发挥了重要的作用,这为以HOXA13为靶点的肝癌诊断和治疗提供了新的理论依据及靶向策略。

参考文献
[1] 杨小会, 李跃辉, 冯湘玲. 同源异型盒基因甲基化与实体肿瘤的研究进展[J]. 医学临床研究, 2017, 34(9): 1739–1742.
[2] Chang CJ, Chen YL, Hsieh CH, et al. HOXA5 and p53 cooperate to suppress lung cancer cell invasion and serve as good prognostic factors in non-small cell lung cancer[J]. Cancer, 2017, 8(6): 1071–1081. DOI:10.7150/jca.17295
[3] Xia B, Shan M, Wang J, et al. Homeobox A11 hypermethylation indicates unfavorable prognosis in breast cancer[J]. Oncotarget, 2017, 8(6): 9794–9805.
[4] Xue M, Zhu FY, Chen L, et al. HoxB9 promotes the migration and invasion via TGF-β1/Smad2/Slug signaling pathway in oral squamous cell carcinoma[J]. Am J Transl Res, 2017, 9(3): 1151–1161.
[5] Cillo C, Schiavo G, Cantile M, et al. The HOX gene network in hepatocellular carcinoma[J]. Int J Cancer, 2011, 129(11): 2577–2587. DOI:10.1002/ijc.25941
[6] Sauvegarde C, Paul D, Bridoux L, et al. Dynamic pattern of HOXB9 protein localization during oocyte maturation and early embryonic development in mammals[J]. PLoS ONE, 2016, 11(10): e0165898. DOI:10.1371/journal.pone.0165898
[7] Li YH, Yang XH, Fang SJ, et al. HOXA7 stimulates human hepatocellular carcinoma proliferation through cyclin E1/CDK2[J]. Oncol Rep, 2015, 33(2): 990–996. DOI:10.3892/or.2014.3668
[8] Armas-López L, Piña-Sánchez P, Arrieta O, et al. Epigenomic study identifies a novel mesenchyme homeobox2-GLI1 transcription axis involved in cancer drug resistance, overall survival and therapy prognosis in lung cancer patients[J]. Oncotarget, 2017, 8(40): 67056–67081.
[9] Brechka H, Bhanvadia RR, VanOpstall C, et al. HOXB13 mutations and binding partners in prostate development and cancer:Function, clinical significance, and future directions[J]. Genes Dis, 2017, 4(2): 75–87. DOI:10.1016/j.gendis.2017.01.003
[10] Li M, Li X, Zhuang Y, et al. Induction of HOXA9 expression in three-dimensional organotypic culture of the Claudin-low breast cancer cells[J]. Oncotarget, 2016, 7(32): 51503–51514.
[11] Vider BZ, Zimber A, Chastre E, et al. Deregulated expression of homeobox-containing genes, HOXB6, B8, C8, C9, and Cdx-1, in human colon cancer cell lines[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2000, 272(2): 513–518. DOI:10.1006/bbrc.2000.2804
[12] Abe M, Hamada J, Takahashi O, et al. Disordered expression of HOX genes in human non-small cell lung cancer[J]. Oncol Rep, 2006, 15(4): 797–802.
[13] Kanai M, Hamada J, Takada M, et al. Aberrant expressions of HOX genes in colorectal and hepatocellular carcinomas[J]. Oncol Rep, 2010, 23(3): 843–851.
[14] Quagliata L, Quintavalle C, Lanzafame M, et al. High expression of HOXA13 correlates with poorly differentiated hepatocellular carcinomas and modulates sorafenib response in in vitro models[J]. Lab Invest, 2018, 98(1): 95–105. DOI:10.1038/labinvest.2017.107
[15] 沙亮, 何剑波, 李科志, 等. 特异性下调LKB1的表达对肝癌细胞侵袭迁移能力的影响[J]. 临床肝胆病杂志, 2016, 33(5): 875–879.
[16] Gu ZD, Shen LY, Wang H, et al. HOXA13 promotes cancer cell growth and predicts poor survival of patients with esophageal squamous cellcarcinoma[J]. Cancer Res, 2009, 69(12): 4969–4973. DOI:10.1158/0008-5472.CAN-08-4546