吉林大学学报(医学版)  2018, Vol. 44 Issue (02): 299-304

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孙敏英, 周红月, 接晶, 谢飞, 翟瑞萍, 陈潭秀, 袁红艳, 台桂香
SUN Minying, ZHOU Hongyue, JIE Jing, XIE Fei, ZHAI Ruiping, CHEN Tanxiu, YUAN Hongyan, TAI Guixiang
胸腺肽α1诱导MUC1特异性Th2型免疫应答
Specific Th2 immune response of MUC1 induced by thmosin α1
吉林大学学报(医学版), 2018, 44(02): 299-304
Journal of Jilin University (Medicine Edition), 2018, 44(02): 299-304
10.13481/j.1671-587x.20180217

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收稿日期: 2017-04-25
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孙敏英, 周红月, 接晶, 谢飞, 翟瑞萍, 陈潭秀, 袁红艳, 台桂香. 胸腺肽α1诱导MUC1特异性Th2型免疫应答[J]. 吉林大学学报(医学版), 2018, 44(02): 299-304.
SUN Minying, ZHOU Hongyue, JIE Jing, XIE Fei, ZHAI Ruiping, CHEN Tanxiu, YUAN Hongyan, TAI Guixiang. Specific Th2 immune response of MUC1 induced by thmosin α1[J]. Journal of Jilin University (Medicine Edition), 2018, 44(02): 299-304.
胸腺肽α1诱导MUC1特异性Th2型免疫应答
孙敏英1 , 周红月2 , 接晶2 , 谢飞2 , 翟瑞萍2 , 陈潭秀2 , 袁红艳2 , 台桂香2     
1. 吉林大学基础医学院医学生物学实验中心, 吉林 长春 130021;
2. 吉林大学基础医学院免疫学教研室, 吉林 长春 130021
收稿日期: 2017-04-25
基金项目: 吉林省科技厅科技攻关双十工程项目资助课题（20140201012YY）；吉林省长春市科技局科技项目资助课题（201622010100025）
作者简介: 孙敏英(1987-), 女, 吉林省长春市人, 助理工程师, 医学硕士, 主要从事医学生物学方面的研究。
通信作者: 台桂香, 教授, 博士研究生导师(Tel:0431-85619476, E-mail:taiguixiang@163.com)
[摘要]: 目的: 采用黏蛋白与麦芽糖结合蛋白融合蛋白（MUC1-MBP）作为特异性抗原，研究胸腺肽α1（Tα1）加强诱导MUC1特异性免疫应答的类型，探讨其作为佐剂应用的可行性。方法: 将C57BL/6小鼠随机分为生理盐水组（注射生理盐水）、MUC1-MBP+BCG组（注射MUC1-MBP+BCG）和MUC1-MBP和Tα1组（注射MUC1-MBP+Tα1），分别进行T细胞免疫活性、MUC1特异性抗体效价及亚类、Tα1联合MUC1-MBP抗肿瘤作用检测。第3次免疫后4~7 d无菌取脾脏组织，测定脾指数；淋巴细胞增殖反应测定各组小鼠的刺激指数（SI）；ELISA法测定小鼠脾细胞培养上清中干扰素γ（IFN-γ）、白细胞介素2（IL-2）、白细胞介素4（IL-4）和白细胞介素10（IL-10）的水平及小鼠血清中MUC1特异性抗体水平；第3次免疫后7 d，注射黑色素瘤细胞B16-MUC1，观察各组小鼠生存期。结果: 与生理盐水组比较，MUC1-MBP+BCG组和MUC1-MBP+Tα1组小鼠脾指数与SI均升高（P < 0.05或P < 0.01），MUC1特异性SI明显升高（P < 0.05）。与生理盐水组比较，MUC1-MBP+BCG组小鼠脾细胞培养上清中IFN-γ和IL-2水平均明显升高（P < 0.05）；IL-4和IL-10水平均略微升高，但差异无统计学意义（P>0.05）。与生理盐水组比较，MUC1-MBP+Tα1组小鼠脾细胞培养上清中IL-4水平明显升高（P < 0.01）；IFN-γ、IL-2和IL-10水平均略微升高，但差异无统计学意义（P>0.05）。MUC1-MBP+Tα1免疫小鼠能够产生抗MUC1特异性抗体且效价随浓度升高而升高。抗体亚型检测，与生理盐水组比较，MUC1-MBP+Tα1组IgG1水平明显升高（P < 0.05或P < 0.01），IgG2a水平无明显变化。肿瘤预防实验，与生理盐水组比较，MUC1-MBP+BCG组和MUC1-MBP+Tα1组小鼠生存期未见明显差异。结论: MUC1-MBP联合Tα1更倾向于Th2型免疫应答，Tα1可以作为预防性疫苗佐剂使用，不适合治疗性疫苗使用。
关键词: 胸腺肽α1    黏蛋白与麦芽糖结合蛋白融合蛋白    Th2型免疫应答    佐剂    疫苗    
Specific Th2 immune response of MUC1 induced by thmosin α1
SUN Minying1, ZHOU Hongyue2, JIE Jing2, XIE Fei2, ZHAI Ruiping2, CHEN Tanxiu2, YUAN Hongyan2, TAI Guixiang2     
1. Experimental Center of Medical Biology, School of Basic Medical Sciences, Jilin University, Changchun 130021, China;
2. Department of Immunology, School of Basic Medical Sciences, Jilin University, Changchun 130021, China
[Abstract]: Objective: To investigate the MUC1 specific immune response enhanced by thmosinα1(Tα1) using MUC1-MBP as the specific antigen, and to discuss the feasibility of MUC1-MBP as an adjuvant. Methods: The C57BL/6 mice were randomly divided into normal saline group, MUC1-MBP+BCG group and MUC1-MBP+Tα1 group.The T cellular immune activities, MUC1 special antibody and subclass, anti-tumor effect of Tα1 combined with MUC1-MBP were detected.4-7d after the 3rd immunization, the spleen indexes of the mice in various groups were measured; the lymphocyte proliferation response was used to detect the stimulate index(SI) of the mice in various groups; the levels of specific cytokines IFN-γ, IL-2, IL-4 and IL-10 in the supernatant of spleen cells of the mice were detected by ELISA; the level of serum MUC1-specific antibody was detected by ELISA.The C57BL/6 mice were inoculated with B16-MUC1 7 d after the last immunization and the survival of the mice was observed. Results: Compared with normal saline group, the spleen index and SI of the mice in MUC1-MBP+Tα1 and MUC1-MBP+BCG groups were significantly increased (P < 0.05 or P < 0.01); the specific SI of MUC1 were significantly increased (P < 0.05).Compared with normal saline group, the levels of IFN-γ and IL-2 in the supernatant of spleen cells of the mice in MUC1-MBP+BCG group were obviously increased (P < 0.05);the levels of IL-4 and IL-10 were slightly increased, but there were no significant differences (P>0.05); compared with normal saline group, the level of IL-4 in MUC1-MBP+Tα1 group was obviously increased (P < 0.01);the levels of IFN-γ, IL-2 and IL-10 were slightly increased, but there were no significant differences (P>0.05). The titer of MUC1 specific antibody was increased with the increase of concentration of Tα1. The antibody subtype detection results showed that compared with normal saline group, the level of IgG1 in MUC1-MBP+BCG group was significantly increased(P < 0.05 or P < 0.01), and the level of IgG2a had no obvious change.The tumor prevention experiment results showed that compared with normal saline group, the survival rates of the mice in MUC1-MBP+BCG group and MUC1-MBP+Tα1 group had no significant differences. Conclusion: MUC1-MBP combined with Tα1 prefers to Th2 immune responses in the mice.It indicates that Tα1 can be used as an adjuvanted preventive vaccines, but not suitable for therapeutic vaccines.
Key words: thmosin α1     mucin1-maltose brinding protein fusion protein     Th2 immune response     adjuvant     vaccines    

胸腺肽α1(thmosin α1，Tα1)由28个氨基酸多肽组成，具有高度保守酸多肽结构。Tα1主要分布于胸腺组织，也存在于淋巴组织(如脾、淋巴结)和非淋巴组织(如肺、肾和脑)[1]，其分泌和释放并不受其他激素或者释放因子所调节[2]。尽管Tα1确切的免疫机制还不清楚，但是实验[3]证实：Tα1具有强大的免疫调节作用，是一种细胞免疫增强剂和生物反应调节因子，在机体免疫应答过程中十分重要。大量的实验数据[4-7]证实：Tα1不仅自身具有延缓肿瘤复发、改善免疫功能的作用，在与其他抗肿瘤药物联合使用时还可提高癌症治疗效果。MUC1是Mucins黏蛋白家族成员，存在于正常腺管上皮细胞及其来源的肿瘤细胞表面, 由多肽核芯(核芯肽)和侧枝糖链构成，其核芯肽胞外段为20个氨基酸(SAPD TRPAP GSTAPPA HGVT)的串联重复序列(variable numbers tandem repeats, VNTRs)。正常组织的MUC1与肿瘤组织不同，前者分布于腺管上皮细胞分泌极，与免疫细胞相对隔离，糖基化丰富；而后者广泛分布并异常丰富地表达于癌细胞表面，糖基化不完全，因此暴露出正常情况下隐蔽的表位，成为免疫细胞攻击的靶点[8-9]，是制备肿瘤疫苗的理想分子。目前研制的以MUC1为靶点的疫苗包括糖疫苗、蛋白或多肽疫苗和DNA疫苗[10-12], 其中蛋白疫苗具有一定的临床应用前景。本课题组前期研究[13-14]以MUC1为靶点，研制黏蛋白与麦芽糖结合蛋白融合蛋白(mucin1-maltose binding protein fusion protein, MUC1-MBP)的抗肿瘤疫苗，表明MUC1-MBP联合卡介苗(bacillus calmette-guérin, BCG)佐剂在小鼠体内可以诱导细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic Tlymphocyte, CTL)细胞毒的杀伤活性和Th1反应，可以抑制肺癌转移及实体瘤的生长，具有明显的肿瘤治疗作用[13-16]。但由于BCG是减毒活疫苗，而且其活菌数较难控制，导致疫苗稳定性差，且高剂量BCG的不良反应较大，因此探索良好的肿瘤疫苗佐剂一直是本课题组的重要研究课题。由于Tα1具有免疫调节作用，本研究探讨Tα1是否能作为MUC1-MBP的佐剂用于抗肿瘤治疗，旨在为开发新的佐剂提供依据。

1 材料与方法 1.1 实验动物、主要试剂和仪器

67只雌性C57BL/6小鼠，体质量为18~20 g，6~8周龄，动物合格证号：SCXK(京)2014-0004，购自北京阜康生物科技股份有限公司。小鼠黑色素瘤细胞B16-MUC1由本室建立并保存，重组MUC1-MBP和MUC1-GST融合蛋白由本室重组构建及纯化[6]。BCG购自石家庄开创生化公司，Tα1购自成都地奥九泓制药厂，伊思柯夫改良培养液(Iscove’ s modified Dubecco’ s medium, IMDM)和G418购自美国Gibco公司，FBS和小鼠淋巴细胞分层液购自天津市灏洋生物制品有限公司，ConA购自美国Sigma公司，小鼠抗人MUC1购自美国Abcam公司，FITC-山羊抗小鼠IgG和山羊抗鼠IgG-HRP购自北京中杉金桥生物技术有限公司，鼠抗MBP多克隆抗体购自基因公司，大鼠抗鼠IgG1-HRP和山羊抗鼠IgG2a-HRP购自美国Southern Biotech公司，小鼠细胞因子干扰素γ(IFN-γ)、白细胞介素2(IL-2)、白细胞介素4(IL-4)和白细胞介素10(IL-10) ELISA检测试剂盒购自美国eBioscience公司。低温冰箱和CO2孵箱购自日本SANYO公司，酶标仪购自美国BIOTEK公司，紫外分光光度计购自日本岛津公司。

1.2 小鼠分组与免疫方案

① T细胞免疫活性检测组。将21只C57BL/6小鼠随机分成3组，每组7只，分别为生理盐水组(注射生理盐水)、MUC1-MBP+ BCG组(注射MUC1-MBP+BCG)和MUC1-MBP+ Tα1组(注射MUC1-MBP+Tα1)，其中MUC1-MBP+ BCG组为阳性对照组。免疫方案：小鼠颈背部皮下多点注射，MUC1-MBP 50 μg/只，BCG作为佐剂1 mg/只, Tα1为30 μg/只，隔周1次，共注射3次。②MUC1特异性抗体检测组：将25只C57BL/6小鼠随机分成5组，每组5只，分别为生理盐水组(注射生理盐水)、MUC1-MBP 50 μg组、MUC1-MBP 50 μg+ Tα1 15 μg组、MUC1-MBP 50 μg+ Tα1 30 μg组和MUC1-MBP 50 μg+ Tα1 60 μg组，各组分别用生理盐水调至400 μL。免疫方案：小鼠颈背部皮下多点注射及两侧腹股沟皮下注射，第1次免疫后2周，同等剂量加强免疫2次。③肿瘤模型组。将21只C57BL/6小鼠随机分成3组，每组7只，分别为生理盐水组(注射生理盐水)、MUC1-MBP+ BCG组(注射MUC1-MBP+BCG)和MUC1-MBP+ Tα1组(注射MUC1-MBP+Tα1)，其中MUC1-MBP+BCG组为阳性对照组。免疫方案：小鼠颈背部皮下多点注射，MUC1-MBP 50 μg/只，BCG作为佐剂1 mg/只, Tα1为30 μg/只，隔周1次，共注射3次。

1.3 脾指数测定

第3次免疫后第4~7天，先称每只小鼠体质量，杀鼠，无菌取脾脏，称脾脏质量，计算脾指数。脾指数=小鼠脾质量/体质量。

1.4 检测各组小鼠的刺激指数(stimulus index，SI)和特异性SI

在第3次免疫后第4~7天杀鼠，无菌取脾脏、研磨、细胞计数, 制备脾细胞悬液，采用小鼠淋巴细胞分层液分离小鼠脾脏单个核细胞，采用IMDM调整细胞浓度至1×107mL-1每孔100 μL加入96孔板中。非特异性淋巴细胞增殖反应：实验分为阴性对照组和ConA刺激组(终浓度5mg·L-1)，每组设3复孔，37℃的CO2培养箱中培养48 h后，加入WST-1检测试剂每孔10 μL，继续反应1 h，通过酶标仪检测450 nm处吸光度(A)值。MUC1特异淋巴细胞增殖反应：实验分为阴性对照组、IL-2单独刺激组(终浓度100 U·mL-1)和MUC1多肽刺激组(MUC1多肽20 mg·L-1+IL-2 100 U·mL-1)。37℃、CO2培养箱3 d，半量换液，继续培养5 d后，吸取每孔细胞培养上清100 μL用于细胞因子的检测，加入WST-1检测试剂每孔10 μL，继续反应1 h，通过酶标仪检测450 nm波长处测量吸光度(A)值，计算SI。SI=实验孔A值/对照孔A值。

1.5 ELISA法检测各组小鼠脾细胞培养上清中细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10水平

收集ConA刺激2 d和MUC1刺激5 d的淋巴细胞培养上清，按照IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10试剂盒说明书进行操作。包被抗体(抗IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10的抗体)包被96孔酶标板，每个样本设双复孔，4℃过夜。采用PBS-0.05%Tween-20洗板5次，加入封闭液封闭1 h后，洗涤2次，加入标准品(IFN-γ：2 000.000、1 000.000、500.000、250.000、125.000、62.500、32.500和15.625 ng·L-1；IL-2标准品配制：1 200、600、300、150和75 ng·L-1；IL-4标准品配制：500.0、250.0、125.0、62.5、32.5、15.6、7.8和3.9 ng·L-1；IL-10标准品配制：200.0、100.0、50.0、25.0和12.5 ng·L-1)和样品，每孔100 μL，4℃过夜。洗涤5次，加入检测抗体室温孵育1 h，洗涤5次，加入酶标抗体Avindin-HRP, 室温孵育30 min。洗7次，加入TMB，室温15 min。加入硫酸终止后，采用酶标仪于450 nm波长测定A值。计算IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10水平。

1.6 ELISA法检测MUC1总抗体效价及亚类

第3次免疫后第4天，眶上静脉采血，分离血清，通过间接ELISA试剂盒检测MUC1特异性抗体IgG、IgG1和IgG2a。首先将包被抗原MUC1-GST包被96孔板，每个样本设双复孔，4℃过夜。采用PBS-0.05%Tween-20洗板3次，加入封闭液封闭1.5 h后，洗涤2次，加一抗(待测血清)不同用药组每只小鼠血清倍比稀释(1:500、1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000、1:64000)，每孔100 μL，均设双复孔，37℃孵育1.5 h。洗涤6次，加酶标二抗HRP(辣根过氧化物酶)(山羊抗小鼠IgG，1:10000；山羊抗小鼠IgG1，1:4000；山羊抗小鼠IgG2a，1:1000)，每孔100 μL，37℃孵育1.5 h。洗涤7次，加入TMB，室温15 min。加硫酸终止后，采用酶标仪于450nm波长处测定A值。

1.7 肿瘤预防实验模型构建

第3次免疫后1周，在小鼠右后背胁处接种黑色素瘤细胞B16-MUC1，每只2.0 × 106个。隔天称体质量，用游标卡尺测量肿瘤的最大直径(a)和最小半径(b)，计算肿瘤体积(V)：V=1/2ab2，直至第23天第1只小鼠死亡，观察小鼠生存期。

1.8 统计学分析

采用Graphpad Prism5统计软件对数据进行统计学分析。各组小鼠脾指数、SI、脾细胞培养上清中细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10表达水平和脾细胞中T淋巴细胞亚群比例以x±s表示，组间样本均数比较采用单因素方差分析。以α=0.05为检验水准。

2 结果 2.1 各组小鼠脾指数和淋巴细胞增殖反应

MUC1-MBP+ BCG组和MUC1-MBP+ Tα1组小鼠脾指数明显高于生理盐水组(P < 0.01)。非特异性淋巴细胞增殖反应：MUC1-MBP+ BCG组和MUC1-MBP+ Tα1组SI均高于生理盐水组(P < 0.05)，以MUC1-MBP+BCG组升高最为明显。MUC1特异性淋巴细胞增殖反应：MUC1-MBP+BCG组和MUC1-MBP+Tα1组特异性SI均高于生理盐水组(P < 0.05)。见表 1。

表 1 各组小鼠脾指数、SI和特异性SI Table 1 Spleen indexes, SI and specific SI of mice in various groups
(n=7, x±s)
Group Spleen index SI Specific SI
Normal saline 0.003 9±0.000 7 1.457 0±0.359 9 1.429 0±0.179 9
MUC1-MBP+BCG 0.005 2±0.001 7** 2.286 0±0.224 9* 1.957 0±0.359 9*
MUC1-MBP+Tα1 0.006 1±0.000 8** 1.914 0±0.498 1* 1.843 0±0.269 9*
  *P < 0.05, * * P < 0.01 vs normal saline group.
表选项
2.2 各组小鼠脾细胞培养上清中IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10水平

与生理盐水组比较，MUC1-MBP+BCG组小鼠脾细胞培养上清中IFN-γ和IL-2水平明显升高(P < 0.05)；IL-4和IL-10水平略升高，但差异无统计学意义(P>0.05)。与生理盐水组比较，MUC1-MBP+Tα1组小鼠脾细胞培养上清中IL-4水平明显升高(P < 0.01)；IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10水平升高, 但差异无统计学意义(P>0.05)。见表 2。

表 2 各组小鼠脾细胞培养上清中IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10水平 Table 2 Levels of IFN-γ, IL-2, IL-4 and IL-10 in culture supernatant of spleen cells of mice in various groups
[n=7, x±s, ρB/(pg·L-1)]
Group IFN-γ IL-4 IL-2 IL-10
Normal saline 152.90±49.49 47.14±13.50 145.00±44.91 42.86±13.50
MUC1-MBP+ BCG 471.40±135.00* 72.86±17.99 471.40±179.90* 53.57±8.99
MUC1-MBP+ Tα1 200.00±95.74 113.10±44.99** 185.70±89.97 57.14±17.99
  *P < 0.05, * * P < 0.01 vs normal saline group.
表选项
2.3 各组小鼠抗MUC1特异性抗体效价

随着Tα1剂量的增加，相应的抗体效价也有所提高，并且高剂量的Tα1能促进抗体的产生。见表 3。抗体亚类检测结果显示：Tα1能够明显诱导IgG1的产生，并且有剂量依赖关系，而IgG2a产生不明显。见表 4。

表 3 ELISA法检测免疫小鼠抗MUC1特异性抗体效价 Table 3 Anti-MUC1 specific antibody titers in serum of immunized mice detected by ELISA
Antigen(MUC1-MBP)(50 μg) Tα1(μg) Titer of antibody
 － － 0
 + － 1:500－1:1 000
 + 15 1:500－1:2 000
 + 30 1:1 000－1:4 000
 + 60 1:4 000－1:8 000
表选项
表 4 间接ELISA法检测MUC1特异性抗体亚型 Table 4 Subtypes of MUC1 specific antibodies detected by indirect ELISA
(n=5, x±s)
Group IgG1 IgG2a IgG1/IgG2a
 A 0.0484±0.000 4 0.049 8±0.001 0 0.963 1±0.020 5
 B 0.987 1±0.000 8* 0.048 1±0.000 8 20.630 0±0.435 9
 C 3.632 0±0.025 6** 0.051 5±0.001 9 72.470 0±0.609 4
 D 3.798 0±0.080 0** 0.057 5±0.000 4 66.600 0±2.271 0
 E 1.838 0±0.125 5** 0.608 9±0.007 1 2.946 0±0.286 3
  *P < 0.05, * * P < 0.01 vs A group.A:Control; B:MUC1-MBP (50 μg); C:MUC1-MBP (50 μg)+ Tα1(5 μg); D:MUC1-MBP (50 μg)+ Tα1(130 μg); E:MUC1-MBP (50 μg)+ Tα1 (60 μg).
表选项
2.4 各组小鼠生存期

注射肿瘤细胞1周之内肿瘤生长缓慢，第8天生理盐水组最先触及肿瘤结节，第11天MUC1-MBP+Tα1组触及肿瘤结节，第14天MUC1-MBP+BCG组触及肿瘤结节。生理盐水组小鼠生存期为(26±4) d，MUC1-MBP+BCG组小鼠生存期为(28.7±6.3) d，MUC1-MBP+ Tα1组小鼠生存期为(28±6) d。见图 1。MUC1-MBP+BCG组和MUC1-MBP+Tα1组与生理盐水组小鼠生存期比较差异均无统计学意义(P>0.05)。

A:Tumor growth situation; B: Survival time curve. 图 1 各组小鼠接种荷瘤23d后肿瘤生长情况和小鼠生存期 Figure 1 Tumor growth and survival curves of tumor-bearing mice in various groups 23 d after inoculation
图选项
3 讨论

本文作者将BCG与MUC1-MBP联合作为阳性对照组，并与Tα1联合MUC1-MBP免疫C57BL/6小鼠进行对比。本研究免疫活性检测结果显示：MUC1-MBP+ BCG组和MUC1-MBP+Tα1组小鼠脾指数、有丝分裂原SI、MUC1多肽特异性SI均有所升高，说明MUC1-MBP联合Tα1和联合BCG均可诱导非特异性淋巴细胞增殖和特异性淋巴细胞增殖。由于CTL杀伤活性离不开Th1的辅助，因此，本文作者分析了诱导活化的Th类型。采用MUC1多肽刺激5 d，检测了脾脏特异性T淋巴细胞分泌的细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10水平，结果显示：MUC1-MBP联合Tα1明显提高了IL-4和IL-10的分泌，而联合BCG提高了IFN-γ和IL-2的分泌水平，提示Tα1诱导MUC1特异的Th2型应答，而BCG却诱导MUC1特异的Th1应答，该结果与本文作者前期的研究[15-18]结果一致。抗体的产生提示体液免疫应答的激活，也提示Th2的活化。而且，IgG1在IL-4诱导下才能产生，IgG2a在IFN-γ诱导下产生，因此检测IgG1和IgG2a能间接提示Th2和Th1应答。本文作者进一步通过ELISA法检测对免疫小鼠的血清IgG和亚类IgG1和IgG2a进行分析，结果发现：当免疫3次后，与MUC1-MBP组比较，MUC1-MBP+ Tα1组产生了较高效价的MUC1特异性IgG，并随着Tα1剂量增加而升高，提示Tα1在促进MUC1-MBP产生体液免疫应答中有佐剂作用。进一步检测抗体亚类结果发现：随着Tα1剂量的增加，IgG1抗体的产生能力逐渐增强，而IgG2a未见产生，进一步提示Tα1诱导MUC1特异性Th2应答。

Th1应答不仅辅助CTL的杀伤，而其本身释放的IL-2、IFN-γ和TNF-α在治疗肿瘤中发挥重要的作用，Th2应答主要辅助体液免疫应答产生抗体，抗体在肿瘤治疗早期发挥作用，到晚期不仅发挥不了抗肿瘤作用，可能还会起到相反的作用[19-21]。因此，本文作者采用荷瘤鼠模型，深入探讨了Tα1联合MUC1-MBP抗肿瘤作用。本文作者将小鼠免疫3次后，给小鼠注射稳定转染MUC1的黑色素瘤细胞B16-MUC1，结果显示：Tα1联合MUC1-MBP作用下肿瘤生长在早期较对照组缓慢，而到后期与对照组无明显差别，未明显延长小鼠生存期，与本文作者的预期一致。而MUC1-MBP+BCG组作为阳性对照组也未见明显延长生存期，考虑可能是BCG活疫苗本身不稳定导致，其诱导产生的Th1应答强度较低，不足以诱导有效的抗肿瘤应答。

综上所述，Tα1促进MUC1-MBP诱导产生特异性Th2应答，明显促进体液免疫应答的产生，具有佐剂作用。Th2型应答的佐剂不适合应用于治疗性疫苗，但适合用于预防性疫苗。本研究结果也提示在临床中使用Tα1应该慎重，盲目应用有可能产生相反的作用。

参考文献
[1] GoldsteinAL. From lab to bedside:emerging clinical applications of thymosin alpha-1[J]. Expert OpinBiolTher, 2009, 9(5): 593–608.
[2] Naylor PH, Quadrini K, Garaci E, et al. Immunopharmacology of thymosin alpha 1 and cytokine synergy[J]. Ann NY Acad Sci, 2007, 1112: 235–244. DOI:10.1196/annals.1415.036
[3] Romani L, Moretti S, Fallarino F, et al. Jack of all trades:thymosin α1 and its pleiotropy[J]. Ann NY Acad Sci, 2012, 1269(1): 1–6. DOI:10.1111/j.1749-6632.2012.06716.x
[4] Schulof RS, Lloyd MJ, Cleary PA, et al. A randomized trial to evaluate the immunorestorative properties of synthetic thymosin-alpha 1 in patients with lung cancer[J]. J Biol Response Mod, 1985, 4(2): 147–158.
[5] Maio M, Mackiewicz A, Testori A, et al. Large randomized study of thymosin alpha 1 interferon alfa or both in combination with dacarbazine in patients with metastatic melanoma[J]. J Clin Oncol, 2010, 28: 1780–1787. DOI:10.1200/JCO.2009.25.5208
[6] Stefanini GF, Foschi FG, Castelli E, et al. Alpha-1 thymosin and transcatheter arterial chenoembolization in hepatocellular carinoma patients-a preliminary experience[J]. Hepatogastroenterology, 1998, 45(19): 209–215.
[7] Cheng SQ, Wu MC, Chen H, et al. Anti-viral therapy using lamivudine and thymosin is helpful to prevent recurrence in hepatocellular carcinoma with coexisting active hepatitis B[J]. Zhonghua Zhong Liu Za Zhi, 2005, 27(2): 114–116.
[8] Acres B, Limacher JM. MUC1 as a target antigen for cancer immunotherapy[J]. Expert Rev Vaccines, 2005, 4(4): 493–502. DOI:10.1586/14760584.4.4.493
[9] Nath S, Mukherjee P. MUC1:a multifaceted oncoprotein with a key role in cancerprogression[J]. Trends Mol Med, 2014, 20(6): 332–342. DOI:10.1016/j.molmed.2014.02.007
[10] Vassilaros S, Tsibanis A, Tsikkinis A, et al. Up to 15-year clinical follow-up of a pilot Phase Ⅲ immunotherapy study in stage Ⅱ breast cancer patients using oxidized mannan-MUC1[J]. Immunotherapy, 2013, 5(11): 1177–1182. DOI:10.2217/imt.13.126
[11] Quoix E, Ramlau R, Westeel V, et al. Therapeutic vaccination with TG4010 and first-line chemotherapy in advanced non-small-cell lung cancer:a controlled phase 2B trial[J]. Lancet Oncol, 2011, 12(12): 1125–1133. DOI:10.1016/S1470-2045(11)70259-5
[12] Wurz GT, Kao CJ, Wolf M, et al. Tecemotide:Anantigen-specific cancer immunotherapy[J]. Hum Vaccin Immunother, 2014, 10(11): 3383–3393. DOI:10.4161/hv.29836
[13] Hu B, Wang J, Guo Y, et al. Pre-clinical toxicity and immunogenicity evaluation of a MUC1-MBP/BCG anti-tumor vaccine[J]. Int Immunopharmacol, 2016, 33: 108–118. DOI:10.1016/j.intimp.2016.02.006
[14] Wang F, Ni W, Liu G, et al. Escherichia coli maltose-binding protein (MBP) directly induces mouseTh1activation through upregulating TLR2 and downregulating TLR4expressions[J]. Immunobiology, 2015, 220(6): 782–788. DOI:10.1016/j.imbio.2014.12.016
[15] 台桂香, 张凤吉, 朱迅. 重组人MUC1-MBP融合蛋白的抗肿瘤作用[J]. 中国肿瘤生物治疗杂志, 2003, 10(3): 202–205.
[16] Fang F, Ma J, Ni W, et al. MUC1 and maltosebinding protein recombinant fusion protein combined with Bacillus Calmette-Guerin induces MUC1-specific and nonspecific anti-tumor immunity in mice[J]. Mol Med Rep, 2014, 10(2): 1056–1064. DOI:10.3892/mmr.2014.2306
[17] 赵小霞, 马吉春, 方芳, 等. 大肠杆菌麦芽糖结合蛋白(MBP)诱导小鼠Th1细胞的活化作用[J]. 中国免疫学杂志, 2009, 25(6): 504–507.
[18] Ni W, Wang F, Liu G, et al. TLR9 played a more important role than TLR2 in the combination ofmaltose-bindingprotein and BCG-induced Th1 activation[J]. Mol Immunol, 2016, 79: 32–37. DOI:10.1016/j.molimm.2016.09.021
[19] Li Q, Zhang H, Yu L, et al. Down-regulation of Notch signaling pathway reverses the Th1/Th2 imbalance in tuberculosis patients[J]. Int Immunopharmacol, 2018, 54: 24–32. DOI:10.1016/j.intimp.2017.10.026
[20] Li L, Jing YB, Liu J, et al. Study on the correlation of the effect of entecavir on Th1/Th2 cytokines level in the treatment of chronic hepatitis[J]. Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi, 2017, 25(8): 606–611.
[21] Kaminuma O, Saeki M, Nishimura T, et al. Differential contribution of adhesion molecules to Th1 and Th2 cell-mediated lung and bowel inflammation[J]. Biol Pharm Bull, 2017, 40(10): 1801–1805. DOI:10.1248/bpb.b17-00279