由动物脑组织中提取分离所得，内含小分子多肽、神经营养因子和游离氨基酸等活性成分^[1]。研究^[2-3]显示：BPH可跨过血脑屏障作用于中枢神经系统，具有增加脑活性、保护神经细胞免受缺血、低氧和神经毒素等损害的作用，并对神经退行性疾病有良好疗效。BPH中含有的肽类及氨基酸等有效物质，在小肠中上部无菌部位通过主动转运被小肠上皮细胞吸收，因此滞留时间越长吸收越好^[4-5]。目前国内外对BPH的剂型研究仅限于注射剂和片剂，剂型过于单一而常规片剂通过无菌部位时间仅为2~3 h，对多数口服制剂来说胃肠滞留时间相对过短，因此许多药物未被释放完全就已通过吸收部位，导致生物利用度不高，并且由于胃排空的个体差异较大，使某些药物的药效差异显著^[6-8]。本研究通过BPH在人工胃液、肠液处理后对H₂O₂诱导的PC12细胞氧化损伤修复作用的对比，制备BPH胃漂浮片剂，观察其胃肠滞留时间，并运用星点设计-效应面法优化BPH胃漂浮片处方，为该成分的有效利用提供参考。

BPH (长春长庆药业)，BPH片(黑龙江江世药业有限公司)，PC12细胞(通派上海生物科技有限公司)，十八醇(湖南尔康制药股份有限公司，批号：105220140801)，羟丙甲纤维素HPMC-K4M (安徽山河药用辅料股份有限公司，批号：F20072003)，聚丙烯酸树脂Ⅱ (安徽山河药用辅料股份有限公司，批号：F20090001)，乳糖(曲阜市天利药用辅料有限公司，批号：20110106)，硬脂酸镁(郑州亨多宝化工有限公司，批号：G20130358)，微晶纤维素(曲阜市天利药用辅料有限公司，批号：20140305)，MTT (北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司, 批号：51L10156)，H₂O₂ (沈阳市华东试剂厂，批号：20121009)，胎牛血清(天津市灏洋生物制品科技有限公司)。TDP-5型单冲压片机(长沙市云麓区中南制药机械厂)，电热恒温水浴锅(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)，MODEL LD310-2电子天平(沈阳龙腾电子有限公司)，SY-6D型片剂四用测定仪(常州锐品精密仪器有限公司)，实验室微型喷雾干燥机L-117 (北京来亨科贸有限公司技术开发中心)。

PC12细胞由上海生物科技有限公司提供。PC12细胞采用含10% FBS的DMEM在37℃、5% CO₂的培养箱中常规培养。

取对数生长期的PC12细胞(1.0×10⁵mL^-1)分为正常对照组和给药组，另设空白对照组。正常对照组和给药组每孔加入100 μL细胞悬液，接种到96孔板中，空白对照组只加100 μL培养基，设置3个复孔。24 h后空白对照组、正常对照组每孔加入100 μL培养基，给药组加入100 μL不同浓度(20、40、60和120 mg·L^-1) BPH，再培养24 h后加20 μL、0.5 g·L^-1的MTT，培养2 h，去除培养液，各孔分别加入100 μL DMSO，37℃下孵育5min，于酶标仪550 nm处测定吸光度(A)值，计算细胞活力。细胞活力=(给药组A值－空白对照组A值)/(正常对照组A值－空白对照组A值)×100%。

取对数生长期的PC12细胞分为正常对照组和模型组，另设空白对照组。正常对照组和模型组每孔加入100 μL细胞悬液，空白对照组加100 μL培养基，设置3个复孔。24 h后向模型组加入梯度浓度(100、200、300、400和500 μmol·L^-1)的H₂O₂溶液100 μL，空白对照组和正常对照组每孔加入培养基100 μL，采用MTT法，在1、2、3、4和5 h时检测A值，计算细胞活力。选择细胞活力为65%时的条件为最佳损伤条件。

取对数生长期的PC12细胞分为BPH组、人工胃液处理的BPH(GBPH)组、人工肠液处理的BPH (IBPH)组、人工胃液处理的BPH片(GBPH-T)组和人工胃液处理的BPH漂浮片(GBPH-FT)组，接种到96孔板中，设置3个复孔，每孔加入100 μL细胞悬液；另设空白对照组，只加100 μL培养基。24 h后空白对照组和正常对照组每孔加入100 μL培养基，其余各组加入以上处理的BPH 100 μL，浓度为20、40、60、80和100 mg·L^-1，再培养24h后用300 μmol·L^-1的H₂O₂损伤3 h，采用MTT法于酶标仪550 nm处检测A值，计算细胞活力，细胞活力越高氧化损伤修复水平越高。

将BPH喷成固体粉末。十八醇在60℃熔融，加入丙烯酸树脂Ⅱ号和HPMC-K4M质量的2/3立即用16目筛制粒，剩余的HKMC-K4M与乳糖、微晶纤维素和BPH湿法制粒。2次制得的粒混合后干燥，整粒，加0.3%硬脂酸镁，压片。

取6片放入(37±0.5) ℃的人工胃液中，模拟胃蠕动。记录起漂时间与持续漂浮时间，观察漂浮性。每片的起漂时间均＜5 s，持续漂浮时间＞8 h，说明漂浮性能良好。

建立标准曲线：精密称取对照品，用人工胃液配成浓度为1.02、2.03、4.06、8.13、16.25和32.50 mg·L^-1的标准溶液，于254 nm波长处测定A值，以A值对浓度(C)进行线性回归，其方程为A＝0.0158C+0.1943；r²＝0.9991 (n=6)。对照品为1.02~32.50 mg·L^-1，其A值与浓度具有良好的线性关系。释放度测定方法：根据《中国药典》2015年版四部释放度测定法^[9]第一法进行测定。转速50 r·min^-1，温度(37±0.5) ℃，人工胃液1000 mL为溶出介质，分别在第2、5和8 h取样20 mL，过0.45 μm微孔滤膜，于254 nm测A值，代入标准曲线方程，求出浓度并计算累计释放度。累计释放度(C_i×V_取×a+C_n×V×a)/m×W%×100%，式中C_i为上一时间点溶出的药物浓度。V_取为取出介质的体积，Cn为n时间点的药物浓度，V为溶出介质总体积，a为稀释倍数，m为漂浮片重量，W%为BPH漂浮片中药物的含量。

由预实验确定BPH 20 mg、乳糖10 mg和微晶纤维素20mg为固定含量。十八醇(X₁)、HPMC-K4M (X₂)和丙烯酸树脂Ⅱ号(X₃)质量为考察因素，其8 h的累计释放度为指标，用Design-expert 8.0.6 Trial按水平编码表进行3因素3水平试验。模型拟合：根据显著性(P < 0.05)以及R²，优选出二次模型方程为最佳拟合方程。并对其各项系数进行方差分析。响应面及优化处方^[10]：根据拟合方程，固定一个变量后对其余2个变量以8 h总释放度对其影响做曲面图和等高线图。

进行3次平行实验，验证最佳处方的可行性。比较8 h总释放度的预测值和实测值。

采用SPSS 16.0统计软件进行统计学分析。所有计量资料均符合正态分布，各组细胞活力水平以x ±s表示，多组样本均数比较采用单因素方差分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。

与正常对照组比较，60 mg·L^-1BPH组细胞活力明显升高(121.17%±1.80%) (P < 0.05)，120 mg·L^-1BPH组细胞活力时明显降低(89.61%±1.70%)(P < 0.05)。见图 1。

*P < 0.05 vs normal control group. 图 1 MTT法检测各组PC12细胞活力 Figure 1 Viabilities of PC12 cells in various groups detected by MTT assay

图选项

与正常对照组比较，300 μmol·L^-1H₂O₂组损伤3 h时，细胞活力为(65.37%±0.90%) (P < 0.05)，为最佳条件，其他各组细胞活力均未达到65%。见图 2。

*P < 0.05 vs normal control group. 图 2 H2O2作用下各组PC12细胞活力 Figure 2 Viabilities of PC12 cells in various groups after treated with H2O2

图选项

与模型组比较，60 mg·L^-1BPH组和GBPH-FT组细胞活力明显升高(P < 0.01)，IBPH组和GBPH组细胞活力升高(P < 0.05)；与BPH组比较，IBPH组细胞活力降低(P < 0.05)，GBPH组细胞活力差异无统计学意义(P>0.05)；与GBPH-T组比较，GBPH-FT组细胞活力明显升高(P < 0.05)。见表 1。

根据星点设计实验水平编码表和实验结果以及曲面图和等高线图，t检验在P < 0.05水平上简化得到拟合方程：y=－1170.29515+31.17345X₁+6.52281X₂+28.42872X₃+0.047361X₁X₂+0.048359X₁X₃－0.11451X₂X₃－0.26182X₁₂－0.14885X₂₂－0.10181X₃₂(R²=0.9636)，F=20.60，P=0.0003＜0.05，表明该模型高度显著，失拟度和拟合度良好，实验误差小，有较高的可信度^[11-12]。可用其对BPH胃漂浮片的工艺进行分析和预测。通过对回归模型方程计算，最大释放率为85.4377%；BPH胃漂浮片最佳处方为HPMC-K4M27 mg，十八醇63 mg，丙烯酸树脂Ⅱ号13 mg，BPH 20 mg，乳糖10 mg，微晶纤维素20 mg，硬脂酸镁0.4 mg。水平编码表见表 2，实验结果见表 3，方差分析见表 4。曲面图和等高线图见图 3~5(插页五)。

图 3 y=f (X2，X3)等高线(A)和响应曲面(B) Figure 3 y=f (X2, X3)contour lines(A) and response surfaces(B)

图选项

图 4 y=f (X1，X3)等高线(A)和响应曲面(B) Figure 4 y=f (X1, X3)contour lines(A) and response surfaces(B)

图选项

图 5 y=f (X1，X2)等高线(A)和响应曲面(B) Figure 5 y=f (X1, X2)contour lines(A) and response surfaces(B)

图选项

药物累积释放度的实测值与预测值偏差 < 5%，非常接近，BPH胃漂浮片漂浮滞后时间均 < 5 s，持续漂浮时间>8 h。见表 5。

BPH含有的成分具有修复脑神经元的作用，能够促进脑蛋白合成和突触形成，诱导神经元分化进而改善神经元代谢，并可增加脑内葡萄糖及氧的利用, 促进脑功能的恢复^[13-14]。研究^[15-16]表明：PC12细胞源于生成神经系统的外胚层，具有某些神经元的特征，是比较理想的细胞模型，主要用于评价各类药物对神经元氧化损伤的影响。因此本研究选用PC12细胞并建立H₂O₂对PC12细胞氧化损伤模型，结果表明：在60 mg·L^-1浓度时BPH不仅对正常PC12细胞有很好的增殖作用，而且对损伤细胞有明显的修复作用，同时与人工肠液相比，人工胃液环境处理的BPH的修复作用与BPH对损伤细胞修复作用最为接近，证明BPH在胃环境下可以稳定存在，使BPH胃漂浮片剂的研制成为可能。

BPH相对分子质量小并易被肾小球滤过，导致体内循环的半衰期过短，这样不仅达不到疗效还需要多次注射给药才能稳定药效，造成治疗成本高并且患者顺应性差^[17]。而本文作者研制的BPH胃漂浮片剂可以充分延长胃滞留时间，从而提高小肠上皮细胞吸收药物，释放的药物以溶液状态大量到达无菌部位，通过主动转运跨越生物膜，促进细胞的代谢调节功能，能很好地提高生物利用度，从而减少多次给药降低治疗成本并提高患者顺应性，在神经退行性疾病治疗中具有较强的应用潜力。本实验运用的星点设计-效应面法在药学领域是新型的设计实验方法，实验次数少且精确度高，能科学有效处理处方辅料因素的影响^[18]。根据星点设计-响应面法拟合方程(P < 0.05，R²=0.9636)，模型显著性及拟合度良好，实验误差小，方差分析结果显示：十八醇是影响漂浮片的体外释放的最显著因素，HPMC-K4M和丙烯酸树脂Ⅱ号分别次之。制成的漂浮片可持续漂浮8 h，充分延长了胃内滞留时间，体外释放率可达85.4377%，释放充分而且药效与BPH片对比能得到更好的利用。与BPH片比较，研制成的漂浮片剂与在人工胃环境中能更好地抑制H₂O₂引起的PC12细胞活力降低。

处方中HPMC-K4M在漂浮片中含量越少, 漂浮片的密度越低、十八醇密度较低、质量小, 且越多在水中越呈不溶性, 在HPMC-K4M形成的凝胶体制中, 一定程度上起助漂作用^[19]；丙烯酸树脂Ⅱ号可用于增加药物的稳定性，改变药物的释放性能^[20]；乳糖作为致孔剂并有水溶性，可增加药物的缓释作用^[21]。本实验为今后的BPH活性探讨及其胃漂浮制剂处方优化和辅料研究等提供了参考。