吉林大学学报(医学版)  2018, Vol. 44 Issue (02): 270-274

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樊海瑞, 赵岩, 傅警龙, 张海波, 王德超, 郜玉钢, 张连学
FAN Hairui, ZHAO Yan, FU Jinglong, ZHANG Haibo, WANG Dechao, GAO Yugang, ZHANG Lianxue
痛风宁胶囊对大鼠急性痛风性关节炎的抗炎作用及其机制
Anti-inflammatory effect of Tongfengning Capsule in rats with acute gouty arthritis and its mechanism
吉林大学学报(医学版), 2018, 44(02): 270-274
Journal of Jilin University (Medicine Edition), 2018, 44(02): 270-274
10.13481/j.1671-587x.20180212

文章历史

收稿日期: 2017-06-23
痛风宁胶囊对大鼠急性痛风性关节炎的抗炎作用及其机制
樊海瑞1 , 赵岩1 , 傅警龙2 , 张海波2 , 王德超2 , 郜玉钢1 , 张连学1     
1. 吉林农业大学中药材学院人参工程技术研究中心, 吉林 长春 130118;
2. 吉林省长春市长中风湿骨病医院风湿科, 吉林 长春 130000
[摘要]: 目的: 探讨痛风宁胶囊(TFN)对大鼠急性痛风性关节炎模型的影响,阐明TFN对急性痛风性关节炎大鼠的治疗作用及机制。方法: 采用穿刺法对大鼠踝关节注射尿酸钠,建立大鼠急性痛风性关节炎模型。将48只大鼠分为空白对照组,模型组,低(100 mg·kg-1)、中(200 mg·kg-1)和高(550 mg·kg-1)剂量TFN组,秋水仙碱(0.63 mg·kg-1)阳性药对照组,每组8只,均采用灌胃给药。造模后检测不同时间段大鼠踝关节肿胀度,检测各组大鼠血液中白细胞、淋巴细胞和中性粒细胞数量,检测各组大鼠血清及踝关节组织匀浆中一氧化氮(NO)水平及血清中尿酸(UA)水平,测定各组大鼠踝关节周围软组织及关节液中白细胞介素1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平。结果: 与模型组比较,在0~8 h内阳性药对照组和高剂量TFN组大鼠踝关节肿胀度明显降低(P < 0.05或P < 0.01),在4h时最明显(P < 0.01);低和中剂量TFN组大鼠踝关节肿胀度无明显变化(P>0.05)。与模型组比较,阳性药对照组和不同剂量TFN组大鼠血液中白细胞、淋巴细胞和中性粒细胞数量降低,其中高剂量TFN组最为明显(P < 0.05),低和中剂量TFN组大鼠血液中白细胞、淋巴细胞和中性粒细胞数量比较差异无统计学意义(P>0.05)。与模型组比较,阳性药对照组和高剂量TFN组大鼠血清中UA水平明显降低(P < 0.05或P < 0.01),血清NO水平升高(P < 0.05);阳性药对照组和高剂量TFN组大鼠软组织及关节液NO水平及炎症因子IL-1β和TNF-α水平明显降低(P < 0.05或P < 0.01),低和中剂量TFN组差异无统计学意义(P>0.05)。结论: TFN治疗痛风性关节炎疗效显著,其作用机制可能与抑制炎症反应有关。
关键词: 痛风宁胶囊    痛风性关节炎    尿酸钠    炎症因子    
Anti-inflammatory effect of Tongfengning Capsule in rats with acute gouty arthritis and its mechanism
FAN Hairui1, ZHAO Yan1, FU Jinglong2, ZHANG Haibo2, WANG Dechao2, GAO Yugang1, ZHANG Lianxue1     
1. Research Center of Ginseng Engineering Technology, College of Chinese Medicine Material, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China;
2. Changzhong Rheumatism Hospital, Changchun City, Jilin Province, Changchun 130000, China
[Abstract]: Objective: To discuss the influence of Tongfengning Capsule(TFN)in the rats with acute gouty arthritis, and to clarify the curative effect and mechanism of TFN in the acute gouty arthritis rats. Methods: The rat model of acute gouty arthritis was induced by injection of microcrystal sodium urate solution into articular cavity of the ankle joint.A total of 48 mice were divided into blank control group, model group, low(100 mg·kg-1), middle(200 mg·kg-1)and high(550 mg·kg-1)doses of TFN groups, colchicine (0.63 mg·kg-1) positive drug control group; 8 rats in each group.The degrees of joint swelling of the rats were monitored at different time after modeling.The number of white blood cells(WBC), lymphocytes and neutrophils in the whole blood of the rats in various groups were detected, and the nitric oxide(NO)levels in the serum and homogenate as well as serum uricacid(UA)were detected.The levels of IL-1β and TNF-α in the soft tissue and synovial fluid around the ankle joint of the rats in various groups were measured. Results: Compared with model group, the swelling degrees of ankle joint of the rats in positive drug control group and high dose of TFN group were significantly decreased in 0-8 h (P < 0.05 or P < 0.01), especially in 4 h(P < 0.01);but there were no significant differences in low and medium doses of TFN groups (P>0.05).Compared with model group, the levels of WBC, lymphocytes and neutrophils in the blood of the rats in positive drug control group and TFN groups were decreased, especially in high dose of TFN group (P < 0.05).The UA levels in serum of the rats in positive drug control group and high dose of TFN group were significantly lower than that in model group (P < 0.05 or P < 0.01), and the levels of serum NO was increased (P < 0.05);but there were no significant differences in low and medium doses of TFN groups(P < 0.05).The levels of NO, IL-1β and TNF-α in soft tissue and synovial fluid of the rats in positive drug control group and high dose of TFN group were significantly lower than those in model group(P < 0.05 or P < 0.01);but there were no significant differences in low and medium doses of TFN groups(P < 0.05). Conclusion: TFN has a remarkable effect in the treatment of gouty arthritis, and this effect may be associated with inhibiting the inflammatory reactions.
Key words: Tongfengning Capsule     gouty arthritis     sodium urate     inflammatory reactions    

痛风性关节炎(gouty arthritis, GA)是机体嘌呤代谢紊乱导致尿酸(uric acid,UA)增加或排泄减少使尿酸盐结晶沉积于软骨、滑膜和关节囊引发关节与周围软组织发生的病理变化与炎症反应[1],若不及时进行正确的治疗会使关节严重受损甚至导致残疾[2]。随着国家经济发展和人们饮食结构的变化, 痛风的患病率呈逐年上升的趋势[3]。目前用于治疗痛风的药物主要有秋水仙碱、白细胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)抑制剂、非甾体抗炎药(NSAIDs)、促肾上腺皮质激素类(ACTH)和皮质类固醇类等。此类药物虽作用迅速、效果明显,但患者需长期使用且常伴有严重的不良反应[4-5],如秋水仙碱具有恶心、腹泻等不良反应;非甾体抗炎药会导致肾损伤或胃肠道溃疡、出血等,IL-1β抑制剂有加重痛风症状的危险[6-7]。由于以上不良反应,临床遇到对各种药物使用的限制问题。而传统中医药在治疗疾病方面具有不良反应小等优点,因此开发治疗痛风中药是目前亟待解决的问题。我国研究人员[8-13]在创建相关模型、药物疗效等领域做了大量研究,并且已证实中药具有治疗痛风及其并发症的效果。

TFN组方为长春中医药大学风湿医院临床多年应用的经验方,在临床上使用十余年[14]。本研究探讨不同剂量TFN对尿酸钠诱导大鼠急性痛风性关节炎的治疗作用与作用机制,为进一步开发和利用TFN提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 实验动物、药物、主要试剂和仪器

SD雄性大鼠,体质量为(200±10) g,由吉林省长春市生物制品研究所有限责任公司提供,动物许可证号:SCXK(吉)2011-0003。痛风宁胶囊(TFN)(组方由土茯苓、泽兰、蚕砂、黄柏、大黄和金钱草等21味中药组成;口服制剂,由吉林省长春市长中风湿骨病医院提供,规格:0.5 g;批准文号:吉药制字Z2007A050)。秋水仙碱(规格:0.5 mg,批准文号:国药准字H20113208),广东彼迪药业有限公司。尿酸钠(U2875-5G,美国Sigma公司)。UA、一氧化氮(NO)、IL-1β和肿瘤坏死因子α(TNF-α)等ELISA试剂盒(美国R&D公司),其他试剂均为分析纯。分析天平(ABS 320-4N型)(上海岛韩实业有限公司), 酶标仪K[SPECTRAMAX190,美谷分子仪器(上海)有限公司], CT14D台式高速离心机(天美科学仪器有限公司)。

1.2 实验动物模型制备[15-17]和分组

取48只健康大鼠适应性饲养1周后随机分为6组,即空白组,模型组,秋水仙碱阳性药对照组,低、中和高剂量TFN组;每组8只。将大鼠仰卧固定于解剖板,右后肢小腿踝关节经医用酒精消毒后,用6号注射针以踝关节外侧为穿刺点,针口斜面朝上且与胫骨成45°刺入踝关节腔,有落空感。注入250 mg·mL-1尿酸钠溶液0.2 mL,踝关节对侧鼓起视为注射成功。除空白对照组注射等体积的无菌生理盐水外,其他各组均注射0.2 mL上述尿酸钠溶液。制作大鼠急性GA模型。

1.3 给药方式

大鼠每天上午灌胃给药,根据人与实验动物给药量的剂量换算[18],低、中和高剂量TFN组给药剂量分别为100、200和550 mg·kg-1。阳性对照组大鼠灌服秋水仙碱0.63 mg·kg-1。其他组灌胃蒸馏水。连续给药9 d,第7天给药30 min后按上述1.2法造模。

1.4 检测方法和观察指标[19-20]

造模后2、4、6和8 h用宽度为1 cm纸条测量每组大鼠踝关节同一部位周长(单位mm,记号笔标记),计算肿胀度。肿胀度=(造模后踝关节周长-造模前踝关节周长)/造模前踝关节周长。实验第9天给药30 min后,将每组大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉后固定于解剖板,取腹主静脉血,一部分置于采血管检测血液中白细胞、淋巴细胞和中性粒细胞(1×10-9 L-1)。另一部分置于离心管放置室温下1 h后离心(3 500 r·min-1,12 min)取上清,在-70℃条件下冻存待测UA和NO水平。取血之后处死大鼠,置于冰冻干燥托盘内,快速分离踝关节周围软组织、关节液于匀浆管内离心取上清,放置在-20℃保存,待测IL-1β、TNF-α及NO水平。以上UA、NO、IL-1β和TNF-α等指标均按试剂盒说明书采用酶联吸附实验测定。

1.5 统计学分析

采用SPSS16.0统计软件进行统计学分析。各组大鼠踝关节肿胀度,血清NO和UA水平,血液中白细胞、淋巴细胞、中性粒细胞数量,关节液及滑膜IL-1β、TNF-α和NO水平均以x±s表示,多组间样本均数比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用SNK-q法。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 各组大鼠关节肿胀度

与空白对照组比较,模型组大鼠在0~8 h内踝关节肿胀度明显升高(P < 0.01),表明大鼠急性痛风性关节炎造模成功。与模型组比较,阳性药对照组和高剂量TFN给药组大鼠在2~8 h踝关节肿胀度明显降低(P < 0.05或P < 0.01),在4 h时效果最为显著(P < 0.01)。低和中剂量TFN组大鼠踝关节肿胀度亦降低,但差异无统计学意义(P>0.05)。见表 1。TFN量效之间符合正态分布。

表 1 各组大鼠踝关节肿胀度 Table 1 Degrees of swelling of anklejoint of rats in various groups
(n=8, x±s)
Group Dose (mg·kg-1) Degree of joint swelling
(t/h)   0 2 4 6 8
Blank control 0 0.19±0.03 0.21±0.04 0.22±0.05 0.23±0.06 0.21±0.05
Model 0 0.26 ±0.06* 0.32±0.07* 0.36±0.07* 0.39 ±0.07* 0.44±0.09 *
Positive drug control 0.63 0.21±0.04 0.24±0.04△△ 0.29±0.05 0.33±0.06 0.34±0.06△△
TFN
  Low dose 100 0.25±0.06 0.31±0.05 0.35±0.06 0.37±0.06 0.38±0.06
  Middle dose 200 0.24±0.05 0.28±0.06 0.34±0.05 0.36±0.06 0.37±0.05
  High dose 550 0.21±0.04 0.25±0.05 0.28±0.05△△ 0.34±0.04 0.35±0.06△△
*P < 0.01 vs blank control group;P < 0.05, △△P < 0.01 vs model group.
2.2 各组大鼠全血中白细胞、淋巴细胞和中性粒细胞水平

与空白对照组比较,模型组大鼠白细胞、淋巴细胞和中性粒细胞水平有明显升高的趋势;与模型组比较,阳性药对照组和高剂量TFN组大鼠白细胞、淋巴细胞和中性粒细胞数量明显减少(P < 0.05);中剂量TFN组大鼠白细胞数量明显减少(P < 0.05),但淋巴细胞与中性粒细胞数量无明显变化(P>0.05)。见表 2。TFN量效之间符合正态分布。

表 2 各组大鼠白细胞、淋巴细胞和中性粒细胞数量 Table 2 Number of WBC, lymphocytes and neutrophils of rats in various groups
(n=8, x±s,×10-9L-1)
Group Dose(mg·kg-1) WBC Lymphocyte Neutrophil
Blank control 0 7.76±0.81 61.45±8.26 16.95±2.43
Model 0 15.91±3.83** 75.86 ±8.95* 21.23±4.37*
Positive drug control 0.63 11.46±2.54 63.48±7.77 17.54±3.71
TFN
  Low dose 100 14.08±3.37 72.53±8.99 24.14±3.21
  Middle dose 200 12.05±3.16 71.26±9.02 21.05±2.81
  High dose 550 11.70±3.09 64.40±7.05 17.33±3.82
* P < 0.05, * * P < 0.01 vs blank control group; P < 0.05, △△ P < 0.01 vs model group.
2.3 各组大鼠血清UA和NO水平

与空白对照组比较,模型组大鼠血清UA水平明显升高(P < 0.01),NO水平明显降低(P < 0.01)。与模型组比较,阳性药对照组和高剂量TFN组大鼠血清中UA水平明显降低(P < 0.05或P < 0.01),NO水平明显升高(P < 0.05)。低和中剂量TFN组较模型组虽有改善,但差异无统计学意义(P>0.05)。见表 3。TFN量效之间符合正态分布。

表 3 各组大鼠血清中UA和NO水平 Table 3 Levels of serum UA and NO in rats in various groups
(n=8, x±s)
Group Dose (mg·kg-1) UA [ρB/(g·L-1)] NO [cB/(μmol·L-1)]
Blank control 0 9.55±2.00 36.85±5.26
Model 0 18.12±2.33* 25.14±4.22*
Positive drug control 0.63 11.82±2.55 32.19±5.11
TFN
  Low dose 100 17.12±1.84 27.75±3.13
  Middle dose 200 16.70±1.84 27.24±5.78
  High dose 550 12.57±2.16 31.64±4.01
*P < 0.01 vs blank control group;P < 0.01 vs model group.
2.4 各组大鼠踝关节组织和关节液中炎症因子及NO水平

与空白对照组比较,模型组大鼠踝关节组织和关节液中NO、炎症因子TNF-α和IL-1β水平均明显升高(P < 0.01)。与模型组比较,阳性药对照组和高剂量TFN组NO、炎症因子TNF-α和IL-1β水平均明显降低(P < 0.05或P < 0.01)。低和中剂量TFN组较模型组NO、TNF-α和IL-1β水平有所降低,但差异无统计学意义(P>0.05)。见表 4。TFN量效之间符合正态分布。

表 4 各组大鼠踝关节组织和关节液中炎症因子和NO水平 Table 4 Levels of inflammatory factors and NO in ankle joint tissue and synovial fluid of rats in various groups
(n=8, x±s)
Group Dose(mg·kg-1) TNF-α[ρB/(ng·L-1)] IL-1β[cB/(μmol·L-1)] NO[cB/(μmol·L-1)]
Blank control 0 267.15±30.58 21.34±4.36 14.00±1.99
Model 0 342.07±41.24* 38.08±4.00* 29.70±3.02*
Positive drug control 0.63 286.47±38.00△△ 26.86±3.05△△ 19.68±2.01△△
TFN
  Low dose 100 337.48±47.25 36.40±5.55 27.12±4.72
  Middle dose 200 327.42±44.38 34.95±5.11 25.30±3.99
  High dose 550 289.60±37.91△△ 27.32±4.03△△ 20.86±4.21△△
*P < 0.01 vs blank control group;P < 0.05, △△P < 0.01 vs model group.
3 讨论

本实验通过向大鼠关节腔注入尿酸钠建立急性痛风性关节炎模型,此法由于效率高且其病理表现与临床极为相似,已被作为经典的急性痛风性关节炎造模法。导致关节炎临床特征的原因之一是由于尿酸钠(monosodium urate, MSU)沉积产生了大量的NO。研究[3, 21]显示:TNF-α和IL-1β为前炎症网链内一级细胞因子,其存在使炎症恶化,释放大量的炎症物质导致软骨基质和骨的破损。中医药在治疗痛风性关节炎上具有标本兼治的特点,且中药复方联合用药具有增效和减毒的优势[22-24]。因此研究与开发具有痛风治疗效果的中药复方具有重要意义。

本研究结果显示:TFN不仅可以降低UA水平,还能够降低TNF-α和IL-1β水平,升高血清NO水平,降低组织中NO水平及血清UA水平,可以减小急性痛风性关节炎大鼠踝关节肿胀度,且与剂量呈正相关关系,高剂量组效果最显著。

综上所述,TFN治疗急性痛风性关节炎的机制可能与抑制炎症因子的释放和降低血液中白细胞、淋巴细胞和中性粒细胞数量有关联。而且实验动物在治疗过程中无不良反应出现。TFN为长中风湿骨病医院临床多年应用的经验方,在临床上使用十余年,但是对于其药理活性缺乏研究。组方中药物含有丰富的生物碱及黄酮类等化合物,且生物碱、黄酮类化合物如槲皮素、山奈酚、木犀草素和桑色素等对痛风有重要作用[25],因此本研究结果对于进一步探讨TFN治疗痛风性关节炎的疗效具有重要意义。

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