2018, Vol. 44扩展功能
文章信息
- 王建行, 姜妍, 王妍, 吴磊, 穆玉, 韩淑英
- WANG Jianxing, JIANG Yan, WANG Yan, WU Lei, MU Yu, HAN Shuying
- 荞麦花叶发酵提取物对2型糖尿病db/db小鼠肾损伤的影响
- Influence of extract from fermented buckwheat flower and leaf in kidney injury in type 2 diabetic db/db mice
- 吉林大学学报(医学版), 2018, 44(01): 95-100
- Journal of Jilin University (Medicine Edition), 2018, 44(01): 95-100
- 10.13481/j.1671-587x.20180118
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文章历史
- 收稿日期: 2017-07-17
2. 华北理工大学冀唐学院教学管理部, 河北 唐山 063000;
3. 华北理工大学基础医学院药理学教研室, 河北 唐山 063000;
4. 河北省慢性疾病 重点实验室及唐山市慢性病临床基础研究重点实验室, 河北 唐山 063000
2. Teaching Management Department, JitangCollege, North China University of Science and Technology, Tangshan 063000, China;
3. Department of Pharmacology, School of Basic Medical Sciences, North China University of Science and Technology, 063000, China;
4. Hebei Key Laboratory of Chronic Diseases, Tangshan Key Laboratory of Clinical and Basic Research of Chronic Diseases, Tangshan 063000, China
糖尿病肾损伤是一种糖尿病病程中最常见且最严重的慢性并发症，是糖尿病全身性微血管病变表现之一，其以肾小球滤过率降低、肾小球外基质堆积和肾小球纤维化为主要病理特征[1]，持续发展可致终末期肾功能衰竭[2]。近年来随着糖尿病患者的增多，糖尿病肾损伤的发病率亦逐年上升，其发病机制尚不清楚。
前期研究[3-6]显示：从荞麦花叶中提取的黄酮具有降糖、降脂、改善胰岛素抵抗、改善微循环、抗氧化和抗炎等作用，并对实验性糖尿病大鼠肾脏具有一定的保护作用。近期对荞麦花叶进行酵母菌发酵处理，发现其黄酮含量有所降低[7]，表明微生物发酵后成分有所改变，且其发酵后的提取物可显著降低db/db小鼠随机血糖[8]，并对db/db小鼠肾组织中血管内皮生长因子(vascular endothetial growth factor, VEGF)和基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9, MMP-9)蛋白表达有明显的影响[9]，但其对肾脏的作用尚未明确。本实验是在前期研究的基础上，研究荞麦花叶发酵提取物(extract from fermented buckwheat flower and leaf，EFBFL)对自发肥胖2型糖尿病db/db小鼠的肾脏损伤的保护作用，并进一步探讨其可能的机制。
1 材料与方法 1.1 实验动物、药品、试剂和主要仪器8周龄SPF级db/db、db/m小鼠，雄性，体质量(35±5)g，购自常州卡文斯实验动物有限公司，动物许可证号：SCXK(苏)2001-0003。荞麦花叶：内蒙古通辽市库伦旗。EFBFL的制备：将活化增殖的酵母菌液加入干燥的荞麦花叶粉末中，给予蛋白胨和葡萄糖营养，置37℃恒温箱中培养48h，用70%乙醇回流提取2h，离心取上清液，合并滤液，70℃浓缩干燥，即得EFBFL。小鼠过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)单克隆抗体(货号：sc-7273)和小鼠核因子κB(NK-κB)单克隆抗体(货号：sc-372，美国Santa Cruz Biotechnology. Inc)，Western blotting用兔抗鼠多抗(货号：ab150073，美国Abcam公司)，其他试剂均为国产分析纯。Image-Pro Plus6.0图像分析软件(美国Media Cybernetics公司)，真彩病理图像分析系统(型号HMIAS-2000，高腾科技有限公司)，MV-Ⅱ型双垂直板式电泳槽(大连竞迈生物科技有限公司)，凝胶成像分析系统(Universal Hood Ⅲ，美国伯乐公司)，全自动生化分析仪(Cobas-8000，德国罗氏制药有限公司)，BX-53型光学显微镜(日本Olympus公司)，日立H-7650透射电子显微镜(日本日立公司)。
1.2 动物分组及给药db/db小鼠适应性饲养1周后，剪尾法取血，用血糖仪测定随机血糖，筛选出随机血糖(RBG)≥16.7 mmol·L-1的实验用鼠30只，再按体质量、血糖分层，随机分为3组，每组10只。模型组：灌胃蒸馏水；低和高剂量EFBFL组：分别灌胃低、高剂量EFBFL(50和100 mg·kg-1EFBFL)；另设db/m小鼠为正常对照组：灌胃蒸馏水。各组小鼠均每天灌胃1次，连续给药8周。
1.3 实验指标检测分别于给药前和给药8周末尾静脉取血用血糖仪测定小鼠血空腹血糖(FBG)；各组小鼠禁食12 h，摘眼球取血，分离血清，用全自动生化分析仪测定血清中血肌酐(SCr)和尿素氮(BUN)的水平。小鼠处死后立即对其进行解剖，迅速摘取两侧肾脏，去除表面被膜，经生理盐水清洗，滤纸吸干后称质量，一部分置于2%戊二醛溶液保存，一部分置于4%多聚甲醛溶液固定；计算肾脏指数，肾脏指数=双肾平均肾质量(mg)/体质量(g)。
1.4 光镜和电镜下观察小鼠肾组织形态表现4%多聚甲醛溶液固定小鼠肾脏组织，冲水，梯度酒精脱水、二甲苯溶液透明，浸蜡、包埋、切片，HE染色及Masson染色，光镜下观察肾组织形态表现和肾组织纤维化程度。4%戊二醛溶液固定肾脏组织，采用透射电镜观察肾组织超微结构。
1.5 免疫组织化学法检测小鼠肾组织PPARγ和NF-κB蛋白表达水平石蜡包埋的肾组织连续切片(5 μm)，经脱蜡至水、抗原修复后，加1:100稀释的一抗4℃过夜，PBS洗3次，加二抗37℃、60min，PBS洗3次，DAB显色，自来水终止显色，常规梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。以PBS替代一抗作为阴性对照，在光镜下观察PPARγ和NF-κB蛋白表达及分布(细胞胞膜和胞质内棕黄色颗粒即为阳性信号)。将每张切片在400倍光学显微镜下观察，用Image-Pro Plus6.0图像处理系统检测PPARγ和NF-κB的平均积分吸光度(IA)值。
1.6 Western blotting法检测小鼠肾组织PPARγ和NF-κB蛋白表达水平取肾组织在裂解液中制成匀浆，离心后取上清液，采用BCA法测定总蛋白浓度。上样前加入5×buffer，100μg蛋白样品经电泳分离后电转至PVDF膜，5%的脱脂奶粉封闭1h后，孵育一抗PPARγ(1:500)、NF-κB(1:1 000)4℃缓慢振荡过夜。次日TBST漂洗滤膜5 min×3次，孵育二抗Goat anti-Rabbit IgG/HRP(1:5 000)稀释，37℃室温振荡孵育1h，TBST漂洗5 min×3次，加入超敏ECL化学发光试剂，暗室曝光。采用Image J软件进行灰度值分析，以β-actin为内参，结果用目的蛋白与β-actin灰度值的比值表示其相对表达水平。
1.7 统计学分析采用SPSS16.00统计软件进行统计学分析。各组小鼠FBG、SCr、BUN、肾脏指数及小鼠肾组织中PPARγ和NF-κB蛋白表达水平均以x±s表示。多组间样本均数比较采用单因素方差分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 给药前后各组小鼠FBG水平给药前后正常对照组小鼠FBG水平无明显变化(P>0.05)；与正常组比较，给药前模型组及EFBFL组小鼠FBG水平明显升高(P < 0.05)；给药8周后，与模型组比较，EFBFL组小鼠FBG水平均明显降低(P < 0.05或P < 0.01)，尤以高剂量EFBFL组效果最为明显。见表 1。
| [n=10，x±s，cB /(mmol·L-1)] | ||
| Group | FBG level | |
| Before administration | After administration | |
| Normal control | 4.87±0.60 | 4.46±0.64 |
| Model | 10.33±1.05* | 11.83±1.62* |
| EFBFL | ||
| Low dose | 10.85±0.94* | 9.87±1.24*△ |
| High dose | 10.58±1.57* | 8.36±1.10*△△ |
| * P < 0.05 vs normal control group; △ P < 0.05, △△ P < 0.01 vs model group. | ||
与正常对照组比较，模型组小鼠血清中的SCr和BUN水平明显升高(P < 0.05)，肾脏指数明显降低(P < 0.01)；与模型组比较，高剂量EFBFL组小鼠血清中的SCr和BUN水平明显降低(P < 0.05)，低剂量EFBFL组小鼠血清中的SCr和BUN水平降低不明显(P＞0.05)；与模型组比较，高剂量EFBFL组小鼠肾脏指数明显升高(P < 0.01)，低剂量EFBFL组小鼠肾脏指数升高不明显(P＞0.05)。见表 2。
| (n=10, x±s) | |||
| Group | SCr[cB /(μmol·L-1)] | BUN[cB /(mmol·L-1) ] | Kidney index |
| Normal control | 20.71±4.52 | 6.68±1.81 | 1.09±0.09 |
| Model | 25.92±5.01* | 8.70±1.27* | 0.67±0.05** |
| EFBFL | |||
| Low dose | 24.03±4.23 | 7.61±1.68 | 0.75±0.08** |
| High dose | 21.25±3.54△ | 7.00±1.29△ | 0.87±0.07**△△ |
| * P < 0.05, ** P < 0.01 vs normal control group; △ P < 0.05, △△ P < 0.01 vs model group. | |||
给药8周后，正常对照组小鼠肾组织中肾小球和肾小管结构正常，未见炎症细胞浸润；与正常对照组比较，模型组小鼠肾组织中肾小球固缩明显，囊腔增大，部分肾小球系膜增生、基底膜增厚，肾间质散在炎细胞浸润及出血点，肾小管细胞水肿明显；与模型组比较，EFBFL组小鼠上述病理改变均有不同程度减轻，高剂量EFBFL组小鼠肾损伤程度明显减轻。见图 1(插页四)。
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| A:Normal control group; B:Model group; C:Low dose of EFBFL group; D:High dose of EFBFL group. 图 1 各组小鼠肾组织形态表现(HE, ×400) Figure 1 Morphology of kidney tissue of mice in various groups (HE, ×400) |
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给药8周后，正常对照组小鼠肾组织中肾小球清晰，大小正常，可见少量蓝染物质，纤维化程度极低；与正常对照组比较，模型组小鼠肾组织中肾小球系膜基质和肾间质见大量蓝染物质沉积，组织纤维化明显；与模型组比较，EFBFL组小鼠肾组织蓝染物质明显减少，纤维化程度均有不同程度降低。见图 2(插页四)。
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| A:Normal control group; B:Model group; C:Low dose of EFBFL group; D:High dose of EFBFL group. 图 2 各组小鼠肾组织Masson染色结果(×400) Figure 2 Results of Masson staining of kidney tissue of mice in various groups(×400) |
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电镜下观察，正常对照组小鼠肾组织中肾小球结构清晰，肾小球基底膜厚度均匀，足细胞结构完整，足突分布均匀、排列整齐清晰，无融合现象；与正常对照组比较，模型组小鼠肾组织中肾小球基底膜弥漫性增厚，足细胞数量减少，足突增宽、融合甚至消失。与模型组比较，EFBFL组小鼠肾组织上述现象有不同程度改善。见图 3。
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| A: Normal control group; B: Model group; C:Low dose of EFBFL group; D:High dose of EFBFL group. 图 3 各组小鼠肾组织电镜观察结果(Bar=2 μm) Figure 3 Results of electronic microscope of kidney tissue of mice in various groups(Bar=2 μm) |
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正常对照组小鼠肾组织中PPARγ主要位于肾小球，阳性表达蛋白染色呈棕色；模型组小鼠肾组织中PPARγ呈低表达，阳性染色颗粒数量减少，分布不均匀，颜色呈浅黄色；EFBFL组小鼠肾组织中PPARγ表达明显增强，阳性染色颗粒数量较模型组明显增多，颜色明显加深，其中高剂量EFBFL组增强最为明显(图 4，见插页四)。模型组小鼠肾组织中NF-κB表达于肾小管，高剂量EFBFL组与正常对照组NF-κB表达相当，仅有少量表达(图 5，见插页四)。与正常对照组比较，模型组小鼠肾组织中PPARγ蛋白表达水平明显降低(P < 0.05)；与模型组比较，EFBFL组小鼠肾组织中PPARγ蛋白表达水平明显升高(P < 0.05)，其中高剂量EFBFL组PPARγ蛋白表达水平最高，且与正常对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。与正常对照组比较，模型组小鼠肾组织中NF-κB蛋白表达水平明显升高(P < 0.05)；与模型组比较，EFBFL组小鼠肾组织中NF-κB蛋白表达水平明显降低(P < 0.05)，且高剂量EFBFL组与正常对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表 3。
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| A:Normal control group; B:Model group; C:Low dose of EFBFL group; D:High dose of EFBFL group. 图 4 各组小鼠肾组织中PPARγ蛋白表达(免疫组织化学，×400) Figure 4 Expressions of PPARγ protein in kidney tissue of mice in various groups (Immunohistochemistry, ×400) |
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| A:Normal control group; B:Model group; C:Low dose of EFBFL group; D:High dose of EFBFL group. 图 5 各组小鼠肾组织中NF-κB蛋白表达(免疫组织化学，×400) Figure 5 Expressions of NF-κB protein in kidney tissue of mice in various groups (Immunohistochemistry, ×400) |
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| (n=10, x±s) | ||
| Group | PPARγ | NF-κB |
| Normal control | 0.115±0.011 | 0.035±0.009 |
| Model | 0.041±0.005* | 0.125±0.032* |
| EFBFL | ||
| Low dose | 0.092±0.012*△ | 0.066±0.012*△ |
| High dose | 0.114±0.014△ | 0.049±0.014△ |
| * P < 0.05 vs normal control group; △ P < 0.05 vs model group. | ||
与正常对照组比较，模型组小鼠肾组织中PPARγ蛋白表达水平明显降低(P < 0.05)，NF-κB蛋白表达水平明显升高(P < 0.01)；与模型组比较，EFBFL组小鼠肾组织中PPARγ蛋白表达水平明显升高(P < 0.05或P < 0.01)，NF-κB蛋白表达水平明显降低(P < 0.05或P < 0.01)，高剂量EFBFL组效果最为明显，且高剂量EFBFL组小鼠肾组织中PPARγ和NF-κB蛋白表达水平与正常对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。与免疫组织化学染色结果一致。见图 6。
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n=3, x±s;
* P < 0.05, ** P < 0.01 vs normal control group; △ P < 0.05, △△ P < 0.01 vs model group. Lane 1:Normal control group; Lane2:Model group; Lane3:High dose of EFBFL group; Lane4:Low dose of EFBFL group. 图 6 各组小鼠肾脏PPARγ和NF-κB蛋白表达电泳图(A)和直条图(B) Figure 6 Electrphoregram (A) and histogram(B) of expressions of PPARγ and NF-κB proteins in kidney tissue of mice in various groups |
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糖尿病肾损伤是一个由高血糖启动的、多因素共同参与的渐进性肾脏损伤过程。高血糖作为一个独立的危险因素，是糖尿病微血管病变发生和发展的始动因素[10]。已有研究[11]表明：db/db小鼠处于高血糖状态，易发生肾脏病变，表现为尿蛋白增高、系膜细胞增生、基质增加和基底膜增厚等肾脏结构破坏，随着高血糖进展，肾脏病变进一步恶化。db/db小鼠与2型糖尿病患者有类似的肾脏病变，本研究采用db/db小鼠作为研究对象可以较好模拟2型糖尿病肾损伤的特征[12]。本研究结果显示：db/db小鼠给予EFBFL治疗后，与模型组比较，其血糖、肾脏组织学病变和肾功能均有不同程度改善，表明EFBFL可在一定程度上减轻小鼠肾损伤，且有一定的降血糖功能，提示EFBFL对高血糖引起的肾脏疾病具有一定的治疗作用。
随着对糖尿病肾损伤的深入研究，其被认为是与先天免疫有关的慢性炎症疾病。糖尿病患者的长期高血糖环境，可促使机体促炎因子及炎症介质大量产生，攻击肾脏组织并加重糖尿病肾损伤发生[13]。糖尿病肾损伤患者微炎症状态与肾功能损伤程度直接相关。过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome pro-liferator-activated receptors, PPARs)是一类配体激活的核转录因子，其亚型之一PPARγ在降低血糖、调节脂类代谢和抗炎过程中发挥重要作用[14-15]。NF-κB是调控机体免疫和炎症反应的重要转录因子，阻断NF-κB通路具有多重的抗炎作用。进一步的研究[16]表明：PPARγ-NF-κB途径是调控炎症反应的一个重要的靶点，PPARγ通过降低NF-κB的活性或抑制其活化，可以下调炎症基因的表达，从而调节炎症通路，最终缓解炎症反应。本研究结果显示：与模型组比较，EFBFL可明显升高db/db小鼠肾脏组织中PPARγ的蛋白表达水平，下调NF-кB蛋白表达水平，表明EFBFL通过激活PPARγ减少NF-кB的转录活性，减少淋巴细胞产生促炎分子，促进免疫系统产生抗炎症分子，改善炎症反应，减轻肾功能的损伤，延缓肾损伤的进展。与此同时，EFBFL在一定程度上可激活PPARγ信号通路，从而降低血糖，增加肾脏组织胰岛素敏感性，改善肾脏糖代谢异常，抑制肾脏损伤。
综上所述，EFBFL可降低db/db小鼠血糖，改善肾组织的损害程度，减缓糖尿病的症状。其机制可能是通过调控炎症反应PPARγ-NF-κB这一重要靶点，改善炎症反应及肾脏功能；与此同时，EFBFL能增加小鼠肾脏组织内PPARγ蛋白表达，降低血糖，增加肾脏组织对胰岛素的敏感性，对肾脏起到一定的保护作用。本研究为荞麦花叶的深入研究提供了新的思路，为荞麦花叶的开发再利用提供了新的研究方向。
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