肝细胞癌是我国常见的恶性肿瘤，放射治疗(放疗)是原发性肝癌的重要治疗手段^[1]。放疗常与手术、介入栓塞化疗、分子靶向药物和化疗药物联合应用，以提高治疗效果^[2-4]。抗肝细胞癌药物消癌平(XAP)注射液的有效成分是中药材通关藤提取物，是萝摩科牛奶菜属植物通关散的藤茎，具有清热解毒、化痰软坚的作用，临床上用于食道癌、肺癌和肝癌的治疗^[5]。XAP可以抑制肿瘤细胞生长，诱导周期阻滞并促进细胞凋亡，肝癌细胞在受射线照射后可出现G₂期阻滞，但两者联合应用对肝细胞癌作用机制方面的研究少有报道。本研究旨在将XAP与X射线联合应用，探讨其协同增强对肝癌细胞的杀伤效应，为肝细胞癌的治疗提供新的思路。

人肝癌HepG₂细胞由吉林大学公共卫生学院卫生部放射生物学重点实验室保存。培养血清及高糖DMEM培养基(江苏恩莫阿塞生物技术有限公司)，Annexin Ⅴ/FITC凋亡检测试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司)，碘化丙啶(propidium iodide, PI，美国Sigma公司)，CCK8试剂盒(Cell Counting Kit-8，日本Dojindo公司)，GAPDH和caspase-3多克隆抗体(美国Santa Cruz公司)，XAP注射液(南京圣合药业有限公司，国药准字：Z20025868，每支20 mL，含有效成分通关藤25 g)，其他试剂均为国产分析纯。

实验分为对照组、XAP组、2 Gy照射组和XAP + 2 Gy照射组。HepG₂细胞培养于含有10%胎牛血清及青、链霉素的高糖DMEM中，于37℃、5% CO₂条件下培养。根据参考文献[6]，XAP注射液在终浓度> 50 mg·L^-1的情况下具有明显的效应，所以本实验采用的终浓度为75 mg·L^-1。按照实验分组分别将生长状态良好的HepG₂细胞按照一定的浓度接种于96孔、24孔和6孔板，分别检测细胞增殖活性、细胞周期进程和细胞凋亡率以及细胞凋亡蛋白caspase-3的表达。X射线照射采用X-RAD320生物辐照仪(美国PXI公司)，照射条件：电压180 kV，电流12.0 mA，靶皮距70 cm，剂量率1.0 Gy·min^-1，总剂量为2 Gy。

HepG₂细胞按照5 × 10⁴个细胞/孔接种于96孔板，24 h后按照终浓度为75 mg·L^-1加入XAP注射液预处理细胞，12 h后进行2 Gy X射线照射，计为0 h，分别于12、24和48 h后每孔加入10 μL CCK-8试剂，继续培养1 h，轻轻震荡后在490 nm处酶标仪检测各孔吸光度[A(490)]值，代表细胞增殖活性，实验设6复孔。

HepG₂细胞按照4 × 10⁵个细胞/孔接种24孔板，24 h后按照终浓度为75 mg·L^-1加入XAP注射液预处理细胞，12 h后进行2 Gy X射线照射，24 h后收集细胞，1 mol·L^-1 PBS洗2次，每管中加入200 μL的PI和100 μL RNaseA，轻微震荡混匀，室温条件避光20 min，上机收细胞，CellQuest软件收集，ModFit软件分析数据，结果以各期细胞百分率表示。

HepG₂细胞接种、加药和照射处理同1.4，24 h后收集细胞，1 mol·L^-1的PBS洗2次，每个管中加入5 μL PI和5 μL Annexin Ⅴ-FITC试剂，混匀后避光10 min，上机收集细胞，CellQuest软件收集，ModFit软件分析数据，结果以凋亡细胞百分率表示。

HepG₂细胞按照2 × 10⁵个细胞/孔接种6孔板，24 h后按照终浓度为75 mg·L^-1加入XAP注射液预处理细胞，12 h后行2 Gy X射线照射，24 h后收集细胞，利用RIPA裂解液裂解细胞，总蛋白提取后进行定量，按照25 μg蛋白上样进行SDS-PAGE电泳，将蛋白转到硝酸纤维膜后，利用TBST配置的5%脱脂奶粉进行封闭1 h，4℃过夜GAPDH和caspase-3一抗孵育。含有0.05% Tween 20的TBST洗3次，每次5 min，辣根过氧化物酶标记的二抗37℃下孵育1 h，TBST洗3次，利用化学发光试剂ECL进行显像，并进行拍照分析。

采用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析。细胞增殖活性、细胞周期百分率和细胞凋亡率均以x±s表示，观察指标符合正态分布，两两比较采用Student’ s t检验。以P < 0.05表示差异有统计学意义。

HepG₂细胞经XAP处理和2 Gy照射后，在12、24和48 h时，与对照组比较，XAP组、2 Gy照射组和XAP + 2 Gy照射组细胞增殖活性明显降低(P < 0.05或P < 0.01)，且XAP + 2 Gy照射组细胞增殖活性较XAP组和2 Gy照射组明显降低(P < 0.05或P < 0.01)。见表 1。

HepG₂细胞经XAP处理和2 Gy照射后24 h，与对照组比较，XAP组、2 Gy照射组和XAP+2 Gy照射组S期和G₂/M期细胞百分率明显增加(P < 0.05或P < 0.01)，G₀/G₁期细胞百分率明显降低(P < 0.01)，其中2 Gy照射组及XAP + 2 Gy照射组S期和G₂/M期细胞百分率较XAP组均明显增加(P < 0.01)；与XAP组和2Gy照射组比较，XAP+2 Gy组G₀/G₁期细胞百分率明显降低(P < 0.05或P < 0.01)，G₂/M期细胞百分率增加(P < 0.05或P < 0.01)。见表 2。

HepG₂细胞经XAP处理和2 Gy照射后24 h，流式细胞术检测细胞凋亡百分率，对照组、XAP组、2 Gy照射组和XAP+2 Gy照射组细胞凋亡率分别为(5.78±0.71)%、(14.02±1.05)%、(15.95±0.24)%和(30.53±2.67)%，XAP组、2 Gy组和XAP+2 Gy组细胞凋亡百分率均较对照组明显升高(P < 0.05或P < 0.01)；与XAP组和2Gy照射组比较，XAP+2 Gy照射组细胞凋亡率明显升高(P < 0.01)。见图 1。

A:Control group; B:XAP group; C:2 Gy radiation group; D:XAP+2 Gy radiation group. 图 1 流式细胞术检测各组HepG2细胞凋亡率 Figure 1 Apoptotic rates of HepG2 cells in various groups detected by flow cytometry

图选项

HepG₂细胞经XAP处理和2 Gy照射后24 h，Western blotting法检测凋亡蛋白caspase-3的断裂，可见caspase-3蛋白被切割成相对分子质量为17 000和19 000的片段，与对照组比较，XAP组、2 Gy照射组和XAP+2 Gy照射组相对分子质量为17 000和19 000的caspase-3片段表达均增加，提示其细胞凋亡增加。见图 2。

Lane 1:Control group; Lane 2:XAP group; Lane 3:2 Gy radiation group; Lane 4:XAP+2 Gy radiation group. 图 2 Western blotting法检测各组HepG2细胞中caspase-3蛋白表达电泳图 Figure 2 Electrophoregram of expressions of caspase-3 protein in HepG2 cells in various groups detected by Western blotting method

图选项

美国国家综合癌症网络(NCCN)肝癌诊治指南推荐：外照射放疗可作为不能手术的原发性肝癌患者的理想治疗手段，我国也在原发性肝癌诊疗规范中推荐了肝癌的放射治疗。曾昭冲^[1]指出：肝癌放疗需要结合其他治疗手段。放疗与其他疗法的联合应用早有先例，能够明显提高肝癌的治疗效果，且减少正常组织的不良反应，这其中包括与增敏剂的联合、与分子靶向治疗联合、与基因治疗联合以及联合热疗等^[7]。

本文作者前期研究^[8-9]结果显示：电离辐射可以诱导MCF-7细胞G₂/M期阻滞，进而导致细胞凋亡的增加。在本研究中，2 Gy照射后，肝癌细胞HepG₂增殖被抑制，细胞周期阻滞于G₂/M期，且细胞凋亡率较对照组明显升高，说明X射线照射针对肝癌细胞也具有相似的作用。XAP以通关藤为原料，利用现代提取技术提取获得，临床主要应用于抗癌、消炎和平喘，主要用于食道癌、胃癌、肺癌、大肠癌、宫颈癌和白血病等多种恶性肿瘤的治疗，发挥作用的主要机制是诱导细胞凋亡和提高机体免疫力等^[10-11]。有研究^[12]表明：XAP联合化疗药物顺铂能明显增强其对高转移人卵巢癌HO-8910PM细胞的抑制作用，且能促进细胞凋亡，诱导G₀/G₁期细胞阻滞，降低侵袭能力。本研究结果显示：XAP对人肝癌HepG₂细胞有明显的增殖抑制作用，且与X射线对肝癌HepG₂细胞的抑制作用相似，二者联合时效果更明显；但与以往研究不同的是：XAP对HepG₂细胞具有诱导G₂/M期阻滞，与郑爱文等^[12]的结果略有不同，而与赵和平等^[13]的研究结果相似。

针对于XAP和X射线照射均具有凋亡促进作用、且以诱导肿瘤细胞凋亡为目的的治疗方案已成为肿瘤研究领域的一个热点^[14]。本研究通过流式细胞术检测细胞凋亡的变化，同时利用Western blotting法检测凋亡效应蛋白caspase-3断裂的情况，结果显示：XAP和X射线照射均可诱导HepG₂细胞凋亡，二者联合能够使诱导能力大大加强；同时，caspase-3被切割成相对分子质量为17000和19000的片段，也证明了二者联合的凋亡诱导作用。

综上所述，XAP与X射线照射联合作用于人肝癌HepG₂细胞，具有明显的细胞增殖抑制、细胞周期阻滞和凋亡诱导作用，且二者联合应用可产生协同效应。但其是否涉及到其他机制，如何发挥协同作用，对动物实验是否具有相似的结果等问题，仍需进一步探讨。本研究结果为临床上肝癌的放射治疗提供了新的思路和实验数据。