实体瘤的生长和转移依赖于新生血管的形成，因此肿瘤血管生成是实体瘤侵袭转移的关键步骤^[1-2]。肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是人类常见的恶性肿瘤之一，肿瘤血管丰富，恶性程度高，发展迅速，生存率低。因此，寻找特异性抗血管生成的靶点成为提高HCC患者生存率的研究热点。肿瘤抑素(tumstatin，Tum)属于血管基底膜Ⅳ型胶原蛋白α3链的一部分，是Saus等^[3]在20世纪80年代作为肺-肾出血综合征的自身抗原而被发现，具有抗血管生成和抗肿瘤活性。Tum是目前发现活性最强的内源性血管生成抑制因子，可通过特异性地抑制血管内皮细胞蛋白的合成，导致内皮细胞特异性凋亡，使新生血管合成受到抑制，从而抑制肿瘤细胞的生长、浸润和转移^[4-6]。Tum-5片段是Tum抗血管生成的活性片段，位于第54~132位氨基酸之间，具有与全长Tum相同的抗血管生成活性^[7]，且不含肺-肾出血综合征的抗原表位。

本课题组前期研究人Tum-5目的基因，构建了逆转录病毒pLXSN-Tum-5重组体，使用包装细胞PA317将其包装成假病毒颗粒感染NIH3T3细胞，获得了pLXSN-Tum-5病毒颗粒^[8]。前期实验^[9]证实：Tum-5可明显抑制人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的增殖，通过下调Bcl-2、促进Bax和Caspase-3表达诱导HUVEC发生凋亡。在此基础上，本课题以肝癌细胞为研究对象，体外检测Tum-5对人肝癌细胞的增殖抑制作用，体内建立小鼠肝细胞癌移植瘤模型，检测Tum-5对移植瘤生长的作用和对移植瘤内新生血管的影响，以期为临床肿瘤患者提供抗血管生成治疗的新途径。

8~12周龄雌性昆明小鼠20只(体质量15~20g)，由吉林大学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK(吉)2015-0005。人肝癌细胞株HepG-2和小鼠肝癌细胞株H22均购自中国科学院细胞库。RPMI-1640购自美国Hyclone公司，新生小牛血清购自杭州四季青公司，MTT试剂购自美国Sigma公司，兔抗鼠CD31单克隆抗体购自美国eBioscience公司，免疫组织化学试剂盒购自北京中杉试剂有限公司。

HepG-2和H22细胞分别培养于含有10%新生小牛血清的RPMI-1640培养液(含100 U·mL^-1青霉素和100 mg·L^-1链霉素)中，在含有5% CO₂的37℃孵箱中培养。

取处于对数生长期的HepG-2细胞，以8×10³个/孔接种96孔板中，每组5个复孔。待细胞贴壁后分别加入不同感染复数(MOI)(0、1、5、10、25和50)的pLXSN和pLXSN-Tum-5病毒颗粒，置于37℃、含5% CO₂的孵箱中继续培养72 h。每孔加入MTT溶液20 μL(终浓度为0.5 g·L^-1)，培养4h后每孔加入DMSO 150 μL，充分溶解后酶标仪检测各孔吸光度(A)值，检测波长590 nm，测定各组细胞增殖率。细胞增殖率=(实验组A值－对照组A值)/对照组A值×100%。

剔去小鼠右侧腋窝下及周围毛发，碘伏皮肤常规消毒。将对数生长期的H22细胞配制成1×10⁷mL^-1的细胞悬液，以RPMI-1640培养基重悬。取0.1 mL分别注射到小鼠右侧腋下已经事先备皮的皮肤下，回抽无血，缓慢注入后迅速拔针，用酒精棉球稍按压进针处皮肤，即可完成接种，约1周左右成瘤，挑选移植瘤体积在30~70mm³的小鼠分组实验，移植瘤模型成功建立。

15只荷瘤小鼠随机分成saline(生理盐水)组、pLXSN组和pLXSN-Tum-5组，每组5只。在第0、2、4、6和8天分别实施瘤内注射saline和病毒颗粒(MOI=5)，共注射5次。治疗效果和安全性分别通过测量肿瘤的体积、质量和小鼠体质量来评估。每2d用游标卡尺测量肿瘤的长径(a)和短径(b)，按公式V = ab²/2计算肿瘤体积，绘制肿瘤体积-时间生长曲线。10 d后，采用颈椎离断处死荷瘤鼠，完整剥离出瘤体，电子天平称质量，计算各组瘤体质量的平均值。

小鼠肝癌移植瘤组织石蜡包埋后制备成5 μm切片，CD31单克隆抗体标记血管内皮细胞。实验步骤参照免疫组织化学试剂盒说明书，PBS代替一抗作阴性对照，计算各组肿瘤微血管密度(MVD)。结果判定：高倍镜(×200)视野下计数高密度区被抗CD31抗体染成棕色的血管数目，每个高密度区计数5个视野下的微血管计数，取其平均值为该标本的MVD。

采用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析。各组细胞增殖率、移植瘤体积和质量、小鼠体质量及移植瘤组织MVD值均以x±s表示，两组间比较采用两独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。

采用不同MOI(0、1、5、10、25和50)的pLXSN-Tum-5和pLXSN病毒颗粒感染HepG-2细胞72 h检测细胞增殖率。pLXSN-Tum-5组随着MOI的增高HepG-2细胞增殖率无明显变化，与pLXSN组比较差异无统计学意义(P> 0.05)。见表 1。

各组荷瘤鼠在实验前6 d皮下移植瘤生长速度未见明显差异；第7天后瘤体生长差异逐渐显现，pLXSN-Tum-5组小鼠皮下移植瘤生长速度明显减慢，滞后于pLXSN组和saline组。治疗结束后，pLXSN-Tum-5组小鼠皮下移植瘤体积明显低于saline组和pLXSN组(P < 0.05或P < 0.01)；pLXSN组与saline组比较差异无统计学意义(P> 0.05)。见图 1。

*P < 0.01 compared with saline group; △P < 0.05 compared with pLXSN group. 图 1 各组小鼠移植瘤体积变化曲线 Figure 1 Curves of changes of transplanted tumor volumes of mice in various groups

图选项

治疗10 d后处死荷瘤鼠，切取肿瘤称质量并拍照，pLXSN-Tum-5组肿瘤大小与pLXSN组和saline组相比明显缩小，见图 2(插页三)。pLXSN-Tum-5组肿瘤质量明显低于saline组和pLXSN组(P < 0.05或P < 0.01)，见表 2。

图 2 各组小鼠移植瘤离体图像 Figure 2 Images of excised tumors of mice in various groups

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隔日测量各组荷瘤鼠体质量，saline组、pLXSN组和pLXSN-Tum-5组荷瘤小鼠在治疗过程中体质量呈稳步增加。治疗10 d后3组小鼠的体质量组间比较差异无统计学意义(P> 0.05)。见图 3。

图 3 各组荷瘤鼠体质量变化曲线 Figure 3 Curves of changes of body weights of tumorof bearing mice in various groups

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移植瘤组织内可见形态不规则的新生血管, 血管分布以肿瘤组织边缘处多见。与saline组和pLXSN组比较，pLXSN-Tum-5组小鼠移植瘤组织中新生血管数目明显减少，pLXSN-Tum-5组平均MVD值与saline组和pLXSN组比较明显降低(P < 0.05)。见图 4(插页三)和表 3。

A: Saline group; B: pLXSN group; C: pLXSN-Tum-5 group. 图 4 各组小鼠移植瘤组织中CD31蛋白表达(免疫组织化学, ×200) Figure 4 Expressions of CD31 in xenograft tumor tissue of mice in various groups (Immunohistochemistry, ×200)

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研究^[10-12]表明：Tum全长基因具有抑制肿瘤细胞增殖和促进肿瘤细胞凋亡的作用。Tum-5作为Tum的抗血管生成活性片段，主要通过特异性抑制血管内皮细胞增殖发挥抗肿瘤活性，而不直接作用于肿瘤细胞^{[5, 7, 13]}。有研究^[14]表明：Tum-5体外可明显抑制胃癌细胞的增殖，促进胃癌细胞凋亡。本研究为了验证Tum-5体外是否对肝癌细胞有直接的增殖抑制作用，选用HepG-2细胞株作为研究对象，选用不同浓度pLXSN-Tum-5和pLXSN病毒颗粒感染HepG-2细胞，检测HepG-2细胞的增殖情况。本研究结果显示：随着pLXSN-Tum-5病毒颗粒浓度的增加，HepG-2细胞的增殖率并无明显变化，与pLXSN对照组比较也无明显变化，表明Tum-5体外对HepG-2细胞没有直接的抗肿瘤活性。考虑这种结果差异可以归因于不同类型的肿瘤细胞。

肿瘤血管生成过程中，血管内皮细胞在肿瘤细胞活化、增殖、迁移和浸润等过程中发挥重要作用^[15-16]。HCC血管丰富，通过特异性抗血管靶向干预抑制上述过程可成为HCC潜在的治疗靶点。因此，本文作者采用小鼠皮下肝癌移植瘤模型，通过局部多点注射pLXSN和pLXSN-Tum-5病毒颗粒来检测Tum-5的体内抗肿瘤效果。治疗5次后，pLXSN-Tum-5组小鼠肿瘤的体积和质量明显低于saline和pLXSN组，主要体现在小鼠皮下移植瘤体积的增大受到明显抑制，并且最终肿瘤质量的增加明显减慢，说明pLXSN-Tum-5组肿瘤细胞的成瘤活性和增殖能力均处于较低水平。此外，治疗结束后3组小鼠体质量无明显差异，说明pLXSN-Tum-5病毒颗粒在体内起到抗肿瘤作用的同时未引起明显的不良反应。

MVD目前被认为是评价肿瘤血管生成的金标准，以抗CD31抗体等标记肿瘤血管内皮细胞，计数单位面积中的微血管数目即为MVD ^[17-20]。为进一步明确Tum-5对小鼠肝癌移植瘤内血管生成的影响，对各治疗组小鼠的瘤组织进行CD31免疫组织化学染色，检测MVD。本研究结果显示：肿瘤组织内可见形态不规则的新生血管，血管分布以肿瘤组织的边缘处为多见。与saline和pLXSN组比较，pLXSN-Tum-5组小鼠肿瘤组织内的平均MVD明显降低，新生血管密度明显减少，表明Tum-5体内对肝癌组织有明显的抗血管生成作用。

综上所述，Tum-5对肝癌细胞的增殖没有直接的抑制作用，但可通过抑制肝癌组织内新生血管的生成抑制肝癌细胞的生长。Tum-5基因片段可作为一种有效的血管生成抑制剂，为肝癌患者提供新的治疗策略。