肝癌是全球5大常见肿瘤之一，放射治疗已经成为原发性肝癌的治疗手段，并在我国的原发性肝癌诊治指南得到推荐^[1]。但是，由于肿瘤干细胞(cancer stem cell，CSC)的存在，导致肿瘤的复发和转移，而且是肿瘤放疗抵抗的重要原因之一^[2]，因此如何提高肝癌放疗效果成为目前研究的热点之一。肿瘤细胞受到辐射后，DNA的损伤如未修复则发生细胞凋亡^[3]，检查点激酶1(checkpoint kinase1，Chk-1)是一种进化上高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，可有效调节细胞周期进程，具有重要的生理功能，当Chk-1被抑制后，则调控周期阻滞的功能消失，使其成为肿瘤治疗的重要靶点。另外，咖啡因(caffeine)是一种茶叶、可可豆和咖啡果中的提取物，近期研究显示其具有抗肿瘤作用，并且取得了较好的效果^[4-6]。本研究探讨咖啡因增强辐射对沉默了Chk-1的CD133⁺肝癌HepG₂细胞增殖、周期和凋亡的作用，为改善肝癌细胞放疗抵抗提供新的思路。

人肝癌HepG₂细胞和人肾上皮293T细胞由吉林大学公共卫生学院王志成博士惠赠。培养血清及高糖DMEM培养基(江苏恩莫阿塞生物技术有限公司)，DMEM/F12培养基、靶向沉默Chk-1的慢病毒载体pGIPZ-Chk-1 shRNA(第6外显子)、非靶对照载体pGIPZ-control shRNA、质粒pMD2G和pSPAX2由吉林大学卫生部放射生物学重点实验室保存；转染试剂Lipofectamine 2000和B27(美国Invitrogen公司)，puromycin、MTT试剂、咖啡因和碘化丙啶(PI)(美国Sigma公司)，重组人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和重组人表皮生长因子(EGF)(美国Peprtech公司)，牛血清白蛋白(BSA)(美国Gbico公司)，AnnexinⅤ-FITC凋亡检测试剂盒(南京凯基生物公司)，CD133一抗(美国Abcam公司)，GAPDH、Chk-1兔多克隆抗体和ECL发光试剂盒(美国Santa Cruz公司)，辣根过氧化物酶标记的抗兔二抗(北京中山金桥公司)，其他试剂为国产分析纯。

293T细胞接种6孔板，待80%~90%融合时，利用Lipofectamine 2000转染试剂将pGIPZ-Chk-1 shRNA、pMD2G和pSPAX2质粒共转染到293T细胞中，48和72 h收取上清液并利用0.45 μm滤膜过滤后加到培养于6孔板80%~90%融合的HepG₂细胞中，共感染2次。通过观察绿色荧光的状态判定感染的效率，并加入50 g·L^-1的puromycin 10 μL进行阳性筛选，将获得的细胞命名为HepG₂-Chk-1，以pGIPZ-control作为非靶对照，命名为HepG₂-control，冻存备用。

收集HepG₂、HepG₂-Chk-1和HepG₂-control组细胞，利用RIPA裂解细胞，总蛋白提取后进行定量，按照25 μg蛋白上样进行SDS-PAGE电泳，将蛋白转到硝酸纤维膜后，利用TBST配置的5%脱脂奶粉封闭1 h，4℃过夜GAPDH和Chk-1一抗孵育。含有0.05%Tween 20的TBST洗3次，每次5 min，辣根过氧化物酶标记的二抗37℃下孵育1 h，TBST洗3次，利用化学发光试剂ECL进行显像，并进行拍照分析。

参照文献[7-8]进行肝癌干细胞的悬浮培养，DMEM/F12培养基中加入20 μg·L^-1 EGF、10 μg·L^-1 bFGF、2% B27、0.4% BSA、100 U· mL^-1青霉素和100 mg·L^-1链霉素，于37℃、5% CO₂条件下培养，约6 d可形成悬浮球，采用Western blotting法检测CD133蛋白表达确定是否为肝癌干细胞，命名为S-HepG₂-Chk-1细胞(沉默Chk-1的肝癌干细胞)和S-HepG₂-control细胞(肝癌干细胞)。

S-HepG₂-Chk-1和S-HepG₂-control细胞分别分为对照组、咖啡因(0.2 mmol·L^-1)组、4 Gy组和4 Gy+咖啡因组。X射线照射采用X-RAD320生物辐照仪(美国PXI公司)，照射条件：电压180 kV，电流12.0 mA，靶皮距70 cm，剂量率1.0 Gy·min^-1，总剂量为4 Gy。

收集各组肝癌干细胞悬浮球，0.25%胰蛋白酶消化后按照1× 10⁴个/孔接种96孔板，参照1.4中的方法继续培养，12 h后加入终浓度为0.2 mmol·L^-1的咖啡因，24 h后进行X射线照射，计为0 h，分别于4、12、24和48 h加入MTT试剂，再培养4 h后吸去上清，加DMSO到孔底结晶处，于酶标仪上490 nm处测定吸光度[A(490)]值，代表其增殖活性。

收集肝癌干细胞悬浮球，0.25%胰蛋白酶消化后按照4 × 10⁵个/孔接种24孔板，参照1.4中的方法继续培养12 h后加入终浓度为0.2mmol·L^-1的咖啡因，24 h后进行X射线照射，24 h后收集细胞，1 mol·L^-1PBS洗2次，每个管中加入200 μLPI和100 μL RNaseA，轻微震荡混匀，室温条件避光20 min，上机收细胞，CellQuest软件收集，ModFit软件分析数据，结果以各期细胞百分率表示。

收集各组肝癌干细胞悬浮球，0.25%胰蛋白酶消化后按照4 × 10⁵个/孔接种24孔板，参照1.4中的方法继续培养，12 h后加入终浓度为0.2 mmol·L^-1的咖啡因^[9]，24 h后进行X射线照射，24 h后收细胞，1 mol·L^-1的PBS洗2次，每个管中加入5 μL PI和5 μL Annexin V-FITC试剂，混匀后避光10 min，上机收细胞，CellQuest软件收集数据，ModFit软件分析，细胞凋亡率以百分率表示。

采用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析。细胞增殖活性、细胞周期百分率和凋亡率均符合正态分布，以x±s表示，两两比较采用两独立样本t检验。以P < 0.05表示差异有统计学意义。

利用转染293T细胞获得的慢病毒感染HepG₂细胞后获得稳定沉默Chk-1的细胞模型，通过Western blotting法检测Chk-1蛋白的表达。HepG₂和非靶对照shRNA的HepG₂细胞中均可见Chk-1蛋白的表达，而靶向沉默Chk-1的HepG₂细胞中Chk-1蛋白低表达，表明本研究获得的沉默Chk-1的HepG₂细胞模型成功。见图 1。

Lane 1:HepG2cells; Lane 2:HepG2-control shRNA cells; Lane 3:HepG2-Chk-1 shRNA cells. 图 1 Western blotting法检测Chk-1蛋白表达电泳图 Figure 1 Electrophoregram of Chk-1 protein expression measured by Western blotting method

图选项

根据Yoshikawa等^[10]报道，肝癌干细胞表面标志为CD133。在悬浮培养6 d后，收集细胞采用Western blotting法检测，HepG₂-control和HepG₂-Chk-1细胞中可见CD133蛋白表达，而将2种细胞悬浮培养后，CD133蛋白均高表达，提示细胞中高比例的CD133⁺细胞为肝癌干细胞。见图 2。

Lane 1:HepG2-controlcells; Lane 2:HepG2-Chk-1 cells; Lane 3:S-HepG2-control cells; Lane 4:S-HepG2-Chk-1 cells. 图 2 Western blotting法检测CD133蛋白表达电泳图 Figure 2 Electrophoregram of CD133 protein expressions measured by Western blotting method

图选项

采用MTT比色法检测细胞增殖活性。在相同时间点，与对照组比较，同一种细胞的增殖活性均明显降低(除了4 h时S-HepG₂-control细胞)(P < 0.05或P < 0.01)，且以咖啡因+ 4 Gy组的细胞活性最低；与S-HepG₂-control细胞比较，48 h时对照组，4、12、24和48 h时咖啡因组，12、24和48 h时4 Gy组，以及4、12、24和48 h时咖啡因+4 Gy组S-HepG₂-Chk-1细胞活性均明显降低(P < 0.01)。见表 1。

与对照组比较，咖啡因组S期和G₂/M期细胞百分率明显增加(P < 0.05或P < 0.01)，4 Gy组G₀/G₁期和G₂/M期细胞百分率明显增加(P < 0.01)；咖啡因+ 4 Gy组S期细胞百分率明显降低，而G₂/M期细胞百分率明显增加(P < 0.05或P < 0.01)。与S-HepG₂-control细胞比较，S-HepG₂-Chk-1细胞G₂/M期细胞百分率均明显降低(P < 0.05或P < 0.01)。见表 2。

与对照组比较，咖啡因组、4 Gy组和咖啡因+ 4 Gy组细胞凋亡率均明显增加(P < 0.05或P < 0.01)，且咖啡因+ 4 Gy组增加最明显；与S-HepG₂-control细胞比较，各组S-HepG₂-Chk-1细胞凋亡率均明显增加(P < 0.05或P < 0.01)。见表 3和图 3。

A-D:S-HepG2-control cells; E-H:S-HepG2-Chk-1 cells; A, E:Control group; B, F:Caffeine group; C, G:4 Gy group; D, H:Caffeine+4 Gy group. 图 3 流式细胞术检测各组肝癌干细胞凋亡率 Figure 3 Apoptotic rates of hepatocellular carcinoma stem cell in various groups detected by flow cytometry

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CSC为肿瘤组织中存在的非常小比例的细胞，具有无限自我更新和增殖能力，维持细胞群的生命力。CSC长时间处于休眠状态，对肿瘤的存活、增殖、转移和复发具有重要作用，同时也是肿瘤放疗抵抗和化疗多药耐药的影响因素之一，以CSC为靶点的肿瘤治疗策略越来越引起重视^[11-12]。原发性肝癌包括肝细胞癌和肝内胆管癌，有学者认为可能部分起源于肝癌干细胞。目前，识别CSC的表面标志物被认为是鉴定CSC的重要途径。肝癌干细胞具有多个表面标志物，如CD133、CD90、CD44、OV6和EpCAM等^[13]。在本研究中悬浮培养6 d后，检测肝癌干细胞表面标志物CD133蛋白表达结果显示：与未悬浮的相同细胞比较，CD133蛋白呈高表达，提示有高比例的肝癌干细胞存在，为后续实验提供了保障。

肿瘤放疗时损伤细胞的一个重要的机制就是诱导DNA损伤，继而导致细胞最终走向死亡。DNA损伤时细胞周期Chk-1/2在限制细胞周期进展的DNA损伤反应通路中发挥重要作用^[14]。肿瘤临床放疗时，往往因肿瘤细胞逃避了凋亡，使得以诱导细胞凋亡为目的的治疗方案效果降低，这与细胞周期检查点的活化关系密切。当细胞遭受DNA损伤剂作用时，Chk1被激活，致使细胞停留在S和G₂/M期检查点，保证DNA有充足的时间完成修复，从而维持基因组的稳定性^[15]。本研究中靶向Chk-1第6外显子的靶向RNAi慢病毒pGIPZ-Chk-1感染肝癌细胞HepG₂后，Western blotting法检测结果显示：Chk-1蛋白表达大大降低，具有较好的沉默效果，而对照序列的慢病毒则不影响Chk-1蛋白的表达。另外，流式细胞术检测Chk-1被沉默的HepG₂细胞和对照序列的HepG₂细胞周期结果显示：G₂/M期细胞百分率明显降低，表明经过悬浮培养后沉默Chk-1的细胞更少的处于G₂/M期。

2013年，美国国家综合癌症网络(NCCN)肝癌诊治指南推荐：原发性肝癌患者无论肿瘤位于何处，都适合外照射放疗。我国也在肝癌诊治指南中推荐肝癌放疗，而肿瘤放疗与其他疗法的联合应用则具有更高的治疗效果。咖啡因广泛存在于茶叶、咖啡和其他饮料中，有研究^[16]表明：咖啡因能够通过诱发细胞凋亡和抑制增殖实现抗肿瘤效应。放疗也可以诱导肿瘤细胞凋亡，因此本研究将二者结合以增加彼此的诱导凋亡作用，并且以沉默了Chk-1的肝癌干细胞为靶细胞。沉默了Chk-1后G₂/M期细胞比例减少，而该细胞周期是对X射线最敏感的期，这将对放射效果产生影响，但从本研究结果来看，二者协同作用于沉默Chk-1的肝癌干细胞能明显提高其增殖抑制和凋亡促进效果。另外，咖啡因对于细胞周期的影响主要集中在S相延迟和G₂/M期阻滞，而4 Gy照射则诱导G₀/G₁和G₂/M期阻滞，对于逆转因缺少Chk-1调控周期检查点监控失调具有一定的作用。

综上所述，由沉默了Chk-1的HepG₂细胞悬浮培养获得的肝癌干细胞G₂/M期比例降低，本身不利于细胞维持正常化，但对于肿瘤来说，则有利于以此为突破口进行靶向治疗。咖啡因和电离辐射均可诱导细胞凋亡，二者联合应用大大增强了单一治疗的效果。本研究结果为肝癌的放射治疗提供了新的实验数据和思路。