吉林大学学报(医学版)  2018, Vol. 44 Issue (01): 36-40

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苏寒, 张美家, 王怀杰, 李娜, 霍连广, 李桂芝, 戴功, 高志芹, 杨晓云, 曲梅花
SU Han, ZHANG Meijia, WANG Huaijie, LI Na, HUO Lianguang, LI Guizhi, DAI Gong, GAO Zhiqin, YANG Xiaoyun, QU Meihua
Exendin-4对胰岛素抵抗人肝癌HepG2细胞脂代谢相关因子基因表达的影响
Effects of Exendin-4 on expressions of lipid metabolism related genes in HepG2 cells with insulin resistance
吉林大学学报(医学版), 2018, 44(01): 36-40
Journal of Jilin University (Medicine Edition), 2018, 44(01): 36-40
10.13481/j.1671-587x.20180107

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收稿日期: 2017-09-27
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苏寒, 张美家, 王怀杰, 李娜, 霍连广, 李桂芝, 戴功, 高志芹, 杨晓云, 曲梅花. Exendin-4对胰岛素抵抗人肝癌HepG2细胞脂代谢相关因子基因表达的影响[J]. 吉林大学学报(医学版), 2018, 44(01): 36-40.
SU Han, ZHANG Meijia, WANG Huaijie, LI Na, HUO Lianguang, LI Guizhi, DAI Gong, GAO Zhiqin, YANG Xiaoyun, QU Meihua. Effects of Exendin-4 on expressions of lipid metabolism related genes in HepG2 cells with insulin resistance[J]. Journal of Jilin University (Medicine Edition), 2018, 44(01): 36-40.
Exendin-4对胰岛素抵抗人肝癌HepG2细胞脂代谢相关因子基因表达的影响
苏寒1,2 , 张美家1,2 , 王怀杰1,2 , 李娜1,2 , 霍连广1,2 , 李桂芝3 , 戴功1,2 , 高志芹1,4 , 杨晓云1,3 , 曲梅花1,2     
1. 潍坊医学院山东省高校应用药理学重点实验室, 山东 潍坊 261053;
2. 潍坊医学院药学院药理学教研室, 山东 潍坊 261053;
3. 潍坊医学院临床医学院生物化学教研室, 山东 潍坊 261053;
4. 潍坊医学院 生物科学与技术学院细胞生物学教研室, 山东 潍坊 261053
收稿日期: 2017-09-27
基金项目: 国家自然科学基金资助课题（31671208，H1304）；山东省科技厅自然科学基金资助课题（ZR2015HL128，ZR2009CL047，ZR2015HL056）；山东省教育厅高等学校科技计划基金资助课题（J14LK15，J15LM10）
作者简介: 苏寒(1992-), 女, 山东省济宁市人, 在读医学硕士, 主要从事内分泌和代谢性疾病方面的研究。
通信作者: 杨晓云, 副教授, 硕士研究生导师(Tel:0536-8462465, E-mail:xiaoyuny1118@163.com);
曲梅花, 教授, 硕士研究生导师(Tel:0536-8462466, E-mail:qumeihua2016@163.com)
[摘要]: 目的: 探讨Exendin-4（Ex-4）对胰岛素抵抗（IR）人肝癌HepG2细胞脂代谢相关因子表达的影响，阐明Ex-4改善IR的作用。方法: 选取处于对数生长期的人肝癌HepG2细胞，采用高浓度胰岛素诱导HepG2细胞制备IR模型（HepG2-IR细胞），再将其分为对照组（不含胰岛素的HepG2细胞）、IR组（IR模型，即HepG2-IR细胞）和Ex-4组（IR模型中加入10 nmol·L-1 Ex-4）。采用葡萄糖氧化酶法（GOD-POD）检测细胞中葡萄糖消耗量，采用油红O染色观察细胞形态及胞内脂滴形成情况，应用甘油三酯（TG）试剂盒检测细胞中TG水平，采用荧光定量PCR（qRT-PCR）法检测细胞中乙酰辅酶A羧化酶（ACC）、脂肪酸合成酶（FAS）、固醇调节元件结合蛋白1c（SREBP-1c）和载脂蛋白B100（apoB100）等脂代谢相关因子mRNA表达水平。结果: HepG2细胞建立IR模型后，与对照组比较，IR组HepG2-IR细胞葡萄糖消耗量明显降低（P < 0.01）；与IR组比较，Ex-4组HepG2-IR细胞葡萄糖消耗量明显增加（P < 0.05）。油红O染色法，与对照组比较，IR组细胞含脂率明显升高（P < 0.05）；与IR组比较，Ex-4组细胞中含脂率明显降低（P < 0.05）。与对照组比较，IR组细胞中TG水平明显升高（P < 0.01）；与IR组比较，Ex-4组细胞中TG水平明显降低（P < 0.05）。qRT-PCR检测，与对照组比较，IR组细胞中ACC、FAS和SREBP-1c mRNA表达水平明显升高（P < 0.01），apoB100mRNA表达水平明显降低（P < 0.05）；与IR组比较，Ex-4组细胞中ACC、FAS和SREBP-1c mRNA表达水平降低（P < 0.05），apoB100 mRNA表达水平升高（P < 0.01）。结论: Ex-4可通过调节人肝癌HepG2细胞脂类代谢相关因子的表达进而改善IR。
关键词: Exendin-4    HepG2细胞    胰岛素抵抗    乙酰辅酶A羧化酶    脂肪酸合成酶    脂代谢    
Effects of Exendin-4 on expressions of lipid metabolism related genes in HepG2 cells with insulin resistance
SU Han1,2, ZHANG Meijia1,2, WANG Huaijie1,2, LI Na1,2, HUO Lianguang1,2, LI Guizhi3, DAI Gong1,2, GAO Zhiqin1,4, YANG Xiaoyun1,3, QU Meihua1,2     
1. Department of Pharmacology, Key Laboratory of Applied Pharmacology in Universities of Shandong Province, Weifang Medical University, Weifang 261053, China;
2. Department of Pharmacology, School of Pharmacy, Weifang Medical University, Weifang 261053, China;
3. Department of Biochemistry, Weifang Medical University, Weifang 261053, China;
4. School of Biological Science and Technology, Weifang Medical University Department of Biology, Weifang 261053, China
[Abstract]: Objective: To investigate the effects of Exendin-4 (Ex-4) on the expressions of lipid metabolism related genes in the human liver cancer HepG2 cells with insulin resistance (IR), and to elucidate the effect of Ex-4 in improvement of IR. Methods: The HepG2 cells in logarithmic growth phase were induced into IR model with high concentration of insulin, then divided into control group (HepG2 cells), IR group (HepG2 cells were treated with insulin, HepG2-IR cells), and Ex-4 group (HepG2-IR cells were treated with Ex-4). Glucose oxidase (GOD-POD) kit was used to detect the consumption of glucose.The cell morphology and intracellular lipid drip formation were observed by Oil red O staining. The triglyceride (TG) level in cells was detected by kit; qRT-PCR was used to detect the mRNA expression levels of acetyl-CoA carboxylase (ACC), fatty acid synthase (FAS), sterol regulatory element-binding protein-1c (SREBP-1c) and apolipoprotein B100 (apoB100). Results: Compared with control group(HepG2 cells), the glucose consumption in the HepG2-IR cells in IR group was significantly decreased (P < 0.01). Compared with IR group, the glucose consumption in the HepG2-IR cells in Ex-4 group was increased (P < 0.05). The Oil O red staining results showed that compared with control group, the fat percentage in the HepG2-IR cells in IR group was increased(P < 0.05); compared with IR group, the fat percentage in Ex-4 group was decreased (P < 0.05). Compared with control group, the level of TG in the cells in IR group was significantly increased (P < 0.01); compared with IR group, the level of TG in the cells in Ex-4 group was significantly decreased (P < 0.05).The qT-PCR results showed that compared with control group, the expression levels of ACC FAS and SREBP-1c mRNA in the cells in IR group were increased (P < 0.01), and the expression level of apoB100 mRNA was decreased (P < 0.05); compared with IR group, the expression levels of ACC, FAS and SREBP-1c mRNA in the cells in Ex-4 group were decreased (P < 0.05), and the expression level of apoB100 mRNA was increased (P < 0.01). Conclusion: Ex-4 can regulate the expressions of lipid metabolism related genes in the HepG2 cells and improve IR.
Key words: Exendin-4     HepG2 cells     insulin resistance     acetyl-CoA carboxylase     fatty acid synthase     lipid metabolism    

Exendin-4(Ex-4)是从墨西哥巨型蜥蜴的唾液中分离得到的一种氨基酸多肽，可促进胰岛素分泌[1]，改善胰岛素抵抗(insulin resistance, IR)。Ex-4具有稳定性好、半衰期长的优点，现已在临床用于治疗2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)，其治疗机制仍未完全阐明[2]。IR与多种疾病的发生有关，其中主要包括T2DM，如何改善IR是寻求治疗T2DM及其他代谢疾病的一个重要途径[3-4]。有研究[5]表明：IR在T2DM中更为普遍，导致了T2DM脂代谢的紊乱。乙酰辅酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase，ACC)、脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，FAS)、固醇调节元件结合蛋白1c(sterol regulatory element-binding protein-1c，SREBP-1c)和载脂蛋白B100(apolipoprotein B100，apoB100)是维持肝脏脂代谢的关键环节[6]。本研究通过建立HepG2细胞IR模型，研究Ex-4处理对IR细胞葡萄糖消耗、细胞内脂肪和甘油三酯(triglyceride, TG)的影响，以及对脂代谢相关因子ACC、FAS、SREBP-1c和apoB100等表达的影响，阐明Ex-4对肝细胞脂代谢的作用机制。

1 材料与方法 1.1 细胞和主要试剂

人肝癌HepG2细胞(中国科学院上海生命科学研究院细胞库)。DMEM培养基(美国Hyclone公司)，胎牛血清、胰酶、油红O、苏木素和牛胰岛素(北京索莱宝科技有限公司)，Ex-4(美国MedChemExpress公司)，甘油三酯检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)，BCA蛋白定量试剂盒和Trizol(北京康为世纪生物科技有限公司)，SYBR Green PCR(日本TOYOBO公司)，PCR引物(上海生工生物工程有限公司)，葡萄糖检测试剂盒(北京普利莱基因技术有限公司)。

1.2 HepG2细胞IR模型建立

HepG2细胞按1:3比例传代后，用含10%胎牛血清(FBS)的高糖DMEM培养基，在培养箱中37℃、5%CO2条件下进行培养，待到细胞长满80%左右，将细胞分为对照组和胰岛素组。待细胞培养12h后，对照组加入不含胰岛素的DMEM培养基，将李秀丽等[7]建立模型方法进行改进，胰岛素组分别加入含1×10-8、1×10-7、1×10-6和1×10-5mol·L-1胰岛素的培养基，继续培养24、36和48h。处理后分别取出细胞培养基上清液，应用葡萄糖氧化酶法(GOD-POD)检测上清葡萄糖浓度，计算葡萄糖消耗量(mmol·L-1)。葡萄糖消耗量最低的一组即IR最佳模型组(葡萄糖消耗量=模型初始葡萄糖浓度－建模后葡萄糖浓度)。HepG2细胞建立IR模型(HepG2-IR细胞)后，然后将细胞分为对照组(不含胰岛素诱导)、IR组(IR模型，即HepG2-IR细胞)和Ex-4组(HepG2-IR细胞中加入10nmol·L-1 Ex-4)。

1.3 油红O染色

在装有载玻片的6孔板中建立HepG2细胞IR模型(HepG2-IR细胞)，IR模型建成后分组同上。吸出培养基，用PBS清洗3次，4%多聚甲醛固定10 min，加入油红O工作液孵育10min；细胞爬片破膜10min，PBS漂洗3次，每次5min，入油红O工作液37℃染色1~2h。苏木素复染1~2min，自来水冲洗，1%盐酸酒精分化数秒，自来水冲洗，氨水返蓝，流水冲洗。在显微镜下观察细胞中脂滴形成情况。用酶标仪测定各组细胞吸光度(A)值，计算细胞含脂率。细胞含脂率＝(实验组A值－对照组A值)/对照组A值×100%。

1.4 TG水平检测

细胞分组同上。细胞长满约1×106mL-1时，将细胞用胰酶消化，离心留沉淀，PBS洗3次后再次离心，留沉淀；加入少许裂解液进行裂解，取部分上清液检测TG水平。

1.5 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测HepG2细胞中脂类代谢相关因子mRNA表达水平

HepG2细胞建立IR模型后，分组同上。每个培养瓶中加入Trizol 1mL，利用Trizol法提取细胞总RNA，RNA定量后进一步逆转录成cDNA。建立PCR反应体系，其中ACC、FAS、SREBP-1c和apoB100及GAPDH引物序列见表 1，以GAPDH为内参基因。反应条件：预变性95℃、10min，变性95℃、10s，退火60℃、30s，共40个循环；熔解曲线为：从55℃到95℃，每隔10s增加0.5℃。使用LightCycler® 480实时荧光定量PCR系统上机扩增，得出实验数据，根据2－ΔΔCt计算各基因的相对表达水平。

表 1 基因引物序列 Table 1 Sequences of primers of RT-PCR
Gene Forward primer (5′-3′) Reverse primer (5′-3′)
ACC CACGCTCAAGTCACCAAGAA GCAAATGGGAGGCAATAAGA
FAS CAAGAACTGCACGGAGGTGT AGCTGCCAGAGTCGGAGAAC
SREBP-1c TTCCCAGCCCCTCAGATAC GAGAAGCACCAAGGAGACGA
apoB100 TCTCGGGAATATTCAGGAACTATTG CTAAGGATCCTGCAATGTCAAGGT
GAPDH GTCGGAGTCAACGGATTTGG CATGGGTGGAATCATATTGGA
表选项
1.6 统计学分析

采用SPSS 20.0统计软件进行统计学分析。葡萄糖消耗量、细胞含脂率、TG水平和脂代谢相关因子mRNA表达水平以x±s表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析。以P < 0.05表示差异有统计学意义。

2 结果 2.1 IR模型建立

在不同浓度胰岛素作用下，HepG2细胞在24、36和48h时葡萄糖消耗量见表 2。与对照组比较，胰岛素浓度为1×10-7mol·L-1作用36h, HepG2葡萄糖消耗量最低，故本次实验中应用的胰岛素浓度为1×10-7mol·L-1、作用时间36h为最佳造模条件。

表 2 不同浓度胰岛素作用HepG2细胞24、36和48h后葡萄糖消耗量 Table 2 Glucose consumption of HepG2 cells treated with different concentrations of insulin for 24, 36 and 48 h
[n=4, x±s，cB/ (mmol·L-1)]
Group Glucose consumption
(t/h)    24 36 48
Control 1.645±0.098 1.845±0.138 2.148±0.143
Insulin(mol·L-1)
  1×10-8 1.723±0.147* 1.737±0.042* 2.148±0.182
  1×10-7 1.703±0.067* 1.656±0.133* 1.879±0.127
  1×10-6 1.834±0.183* 1.762±0.053 2.012±0.129
  1×10-5 2.034±0.108* 1.937±0.067 2.388±0.157
* P < 0.05 compared with control group at same time.
表选项
2.2 各组细胞葡萄糖消耗量

HepG2细胞诱导成IR形成后，采用GOD-POD法检测各组细胞葡萄糖消耗量，IR组(36h, 胰岛素浓度为1×10-7 mol·L-1)细胞葡萄糖消耗量[(1.656±0.133)mmol·L-1)]明显低于对照组[(1.845±0.138)mmol·L-1)](P < 0.01)，说明IR模型已建立。

与IR组比较，Ex-4组细胞的葡萄糖消耗量[(2.190±0.080)mmol·L-1)]明显升高(P < 0.05)。

2.3 各组细胞的形态表现及TG水平

油红O染色结果显示：与对照组比较，IR组HepG2-IR细胞中红色脂滴明显增多；与IR组比较，Ex-4组细胞中红色脂滴明显减少(图 1，见插页二)。与对照组(25%±6%)比较，IR组细胞含脂率(63%± 12%)明显升高(P < 0.05)；与IR组比较，Ex-4组细胞含脂率(34%±8%)明显降低(P < 0.05)。各组细胞中TG水平(mmol·g-1)检测：与对照组(0.21±0.03)比较，IR组HepG2-IR细胞中TG水平(0.33±0.08)明显升高(P < 0.05)；Ex-4组HepG2-IR细胞中TG水平(0.24±0.04)明显低于IR组(P < 0.05)，接近对照组HepG2细胞中TG水平(P>0.05)，表明Ex-4通过调节TG的代谢影响细胞的脂质代谢途径，进而减少细胞内脂质的积聚。

A: Control group; B: IR group; C: Ex-4 group. 图 1 油红O染色检测各组HepG2细胞形态表现(×400) Figure 1 Morphology of HepG2 cells in various groups detected by oil red O staining (× 400)
图选项
2.4 各组细胞中脂类代谢相关因子mRNA表达水平

与对照组比较，IR组HepG2-IR细胞中ACC、FAS和SREBP-1c mRNA表达水平明显升高(P < 0.01)，apoB100 mRNA表达水平明显降低(P < 0.05)；与IR组比较，Ex-4细胞中ACC、FAS和SREBP-1c mRNA表达水平明显降低(P < 0.05)，apoB100 mRNA表达水平明显升高(P < 0.01)。见表 3。

表 3 各组HepG2细胞中脂类代谢相关因子mRNA表达水平 Table 3 Expression levels of lipid metabolism-related factors mRNA in HepG2 cells in various groups
(n=3, x±s)
Group ACC FAS SREBP-1 ApoB100
Control 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00
IR 2.47±0.35** 2.20±0.26** 2.50±0.66** 0.46±0.09*
Ex-4 1.50±0.30△ 1.76±0.2△ 1.4±0.30△ 1.56±0.20△△
* P < 0.05，* * P < 0.01 compared with control group；△ P < 0.05，△△ P < 0.01 compared with IR group.
表选项
3 讨论

胰高血糖素样肽1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)是肠道分泌的一种肠促胰岛素[8]，能够刺激胰岛β细胞分化，改善细胞的胰岛素敏感性，降低血糖，但其半衰期较短，作为临床药物常受到制约[9-11]。作为第一个临床使用的GLP-1类似物药物，Ex-4的特点是可模拟人体内自然分泌的激素，调节血糖水平，且与GLP-1有相似的生物学作用，Ex-4具有半衰期长的优点，在研究中更具有优势[12-13]。

IR与脂代谢异常有密切关联，所以研究脂代谢的变化是寻找改善IR的一个重要途径。本文作者主要是通过观察Ex-4调节脂代谢的相关因子来探讨Ex-4对IR的影响。脂代谢相关因子ACC和FAS是脂肪酸合成限速酶[14]，ACC、FAS等因子表达水平明显增加，可引起肝脏内脂肪酸合成增加、积累，导致肝细胞脂代谢异常，从而进一步加重IR；FAS还在结合与转运脂质和调节脂蛋白代谢等方面具有重要作用，其表达水平的升高能够明显增加TG在体内的沉积从而使糖尿病的脂代谢紊乱[15-16]。本研究结果显示：IR形成后，脂肪酸合成增加，脂类物质聚集，ACC和FAS表达水平升高。

SREBP-1c是核转录因子，在脂肪酸的合成中发挥重要作用，SREBP-1c活性升高引起摄入游离脂肪酸增加[17]。本研究显示：HepG2-IR细胞经Ex-4处理后，SREBP-1c表达水平降低，提示Ex-4能够减少游离脂肪酸的生成，改善脂肪酸合成异常的现象，使脂肪酸合成减少。apoB100在肝脏中合成，是低密度脂蛋白的载脂蛋白，参与低密度脂蛋白的转运[18-19]。本研究结果显示：Ex-4处理HepG2-IR细胞后，apoB100 mRNA表达水平升高，说明Ex-4通过影响apoB100表达使其能够加剧游离脂肪酸的转运。

研究[20]表明：Ex-4可提高诱导的3T3-L1脂肪细胞IR模型的葡萄糖摄取量，从而改善脂肪细胞的IR。Ex-4在抑制人或动物体质量增长、促进胆固醇代谢和改善胰岛素敏感性方面具有重要作用，可防止高脂诱导的IR[21-22]。本研究结果显示：Ex-4能够增加HepG2-IR细胞的葡萄糖消耗量，降低TG的水平，与上述文献报道一致。

综上所述，Ex-4可调节脂代谢的过程，改善脂肪酸合成异常，进而改善IR。本研究结果为Ex-4成为临床一线抗糖尿病药物提供了理论依据。

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