基底样乳腺癌因其雌激素受体(estrogen receptor, ER)、孕激素受体(progesterone, receptor, PgR)和人表皮生长因子受体2(HER2)表达阴性而被称为三阴性乳腺癌。三阴性乳腺癌细胞分化程度差，易出现早期复发和转移，并缺乏有效的治疗措施，患者预后较差。上皮间质转化(epithelial-mensenchymal transition, EMT)为其主要的细胞转移形式，主要表现为上皮细胞的极性丢失，细胞间失去黏附能力并获得间充质细胞特性，伴有迁移能力的增强^[1-2]。EMT的发生发展来源于多个趋化因子和信号通路的共同作用，其中趋化因子vimentin和Wnt信号通路关键蛋白β-catenin常在三阴性乳腺癌中高表达，其蛋白的表达异常增高常被认为是EMT发生的标志性变化^[3-4]。miR-200c为短小核苷酸编码序列，已被证明与肿瘤发生密切相关，主要通过结合相应靶基因3′非编码(3′UTR)区，抑制靶基因转录从而调节肿瘤生长，其在结直肠癌中可以降低vimentin的表达从而抑制EMT^[5]，在乳腺癌相关miRNA的基因分析中，miR-200c也常作为β-catenin的目标基因，起到肿瘤抑制的作用^[3]。然而，miR-200c在三阴性乳腺癌中是否与vimentin和β-catenin表达有关联，尚未见相关报道。本课题组研究^[6]证实：miR-200c能够结合EMT相应转录因子(slug)从而抑制三阴性乳腺癌EMT。本文作者在此基础上，探讨miR-200c是否可以通过调节β-catenin和vimentin表达水平，从而降低细胞的迁移和增殖能力，最终抑制三阴性乳腺癌EMT。

三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231和BT-549均购于上海ATCC细胞库。miR-200c质粒和negative control由广州锐博生物科技公司合成，转染用试剂Lipo2000购自美国Invitrogen公司，RNA柱式提取试剂盒和荧光定量试剂盒购自上海生工生物工程公司，逆转录试剂盒购自日本东洋纺公司，vimentin和β-catenin单克隆抗体购自美国Cell-Signing-Technology公司，CCK8试剂盒购自日本同仁科技有限公司。

MDA-MB-231和BT-549细胞均采用含有双抗的PRMI1640完全培养基放置于37℃、5%CO₂培养箱中进行培养，取对数生长期的细胞进行消化传代以及后续实验。所有实验均为3复孔，结果取均值，并重复3次。

取对数生长期的细胞接种于6孔板，每孔接种2×10⁵个细胞并进行培养，待细胞生长至孔面积的70%~80%时进行转染操作。根据转染物将其分为空白对照组、阴性对照组组(转染nagtive control/Lipo2000)、试剂对照组(转染Lipo2000)和实验组(转染miR-200c mimic/Lipo2000)。

细胞中β-catenin和vimentin mRNA表达水平根据生工柱式提取说明书要求，待6孔板中的细胞融合之后，进行总RNA提取，并根据各组RNA的相对浓度和纯度将其逆转录为cDNA，采用RT-PCR法检测相应组别的Ct值。采用2^－ΔΔt法计算vimentin和β-catenin mRNA相对表达水平。

取转染后48h的各组细胞系，加入120μL细胞裂解液裂解细胞并收集至EP管中充分震荡30 min，12000r·min^-1离心6 min得到蛋白提取液，并进行电泳，电泳结束后将胶内蛋白电泳转移至PVDF膜上。用TBS 1:1000稀释一抗，室温孵育后4℃过夜。用脱脂奶粉稀释二抗，室温避光2h，用TBST溶液充分洗涤，放入扫描仪扫描PVDF膜并拍照，计算相应条带的灰度值，以GAPDH为内参，用vimentin/GAPDH和β-catenin/GAPDH比值表示各组细胞中vimentin和β-catenin蛋白相对表达水平。

将对数生长期的细胞按5000个/孔均匀接种至96孔板中，待细胞覆盖孔底面积70%时进行转染，终浓度为50 nmol·L^-1。分别在转染后24、48和72 h取出细胞并加入CCK8试剂，检测不同时间段细胞的吸光度(A)值，表示细胞的增殖情况。以空白组作为运算基准计算细胞增殖率，细胞增殖率=(实验组A值－试剂对照组A值) /(空白组A值－试剂对照组A值)。

将转染24 h后的6孔板中细胞更换无血清培养基并进行划痕实验，用高压消毒后的枪头对各组细胞划平行直线，用PBS缓冲液清洗3遍之后加入不含血清的培养基进行培养，分别于0和24 h观察细胞划痕相对宽度，采用Image Pro Plus 6.0软件计算划痕宽度。划痕宽度恢复率= (0h划痕宽度－24 h划痕宽度)/ 0 h划痕宽度×100%。

采用SPSS23.0统计软件进行统计学分析。各组细胞中vimentin和β-catenin mRNA和蛋白表达水平、细胞增殖率、划痕宽度恢复率均以x±s表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P < 0.05表示差异有统计学意义。

与空白对照组、阴性对照组和试剂对照组比较，实验组细胞中vimentin和β-catenin mRNA表达水平明显降低(P < 0.05)。见表 1。

与空白对照组、阴性对照组和试剂对照组比较，实验组细胞中vimentin和β-catenin蛋白表达水平明显降低(P < 0.05)。见表 2和图 1。

Lane 1:Experimental group; Lane 2:Negative control group; Lane 3:Reagent control group; Lane 4:Blank control group. 图 1 Western blotting法检测各组细胞中vimentin和β-catenin蛋白表达电泳图 Figure 1 Electrophoregram of expressions of vimentin protein and β-catenin protein in cells in various groups detected by Western blotting method

图选项

与阴性对照组和试剂对照组比较，在48和72 h时实验组细胞增殖率明显降低(P < 0.05)。见表 3。

与空白对照组、阴性对照组和试剂对照组比较，实验组细胞划痕宽度恢复率明显减低(P < 0.05)。见表 4。

EMT的发生是一个多步骤多因素的渐进过程，主要表现为E-cadherin表达缺失，导致组成细胞骨架的角蛋白转化为波形蛋白，从而启动EMT，而其调控因子和相关蛋白则成为了治疗三阴性乳腺癌的重要靶标^[7-8]。

miR-200c为内源性非编码单链RNA，参与肿瘤细胞生长、增殖、凋亡、转移和侵袭，作为miR-200家族的一员，参与了乳腺癌EMT的基因调控^[9]。而目前关于miR-200c调节EMT的研究大多集中在miR-200c靶向结合于E-cadherin转录抑制子(zeb1和slug)从而导致间质标志物vimentin的降低进而抑制EMT^[10]。vimentin作为一类中间丝蛋白，广泛地存在于间充质细胞中，能调节黏附因子之间的相互作用导致细胞失去黏附，与细胞黏附因子E-cadherin表达相反，其表达增高常被认为是EMT的标志性改变^{[1, 11]}。本研究结果表明：miR-200c在三阴性乳腺癌细胞中可下调vimentin表达水平，与Gao等^[12]在肺癌中的研究结果一致，该研究表明miR-200c可以靶向结合于ZEB1，使其不能够抑制E-cadherin转录，导致vimentin表达降低，最终抑制EMT。

肿瘤细胞发生EMT受到多种调控机制与信号通路的作用，诱导EMT的信号通路通常导致vimentin等关键因子的表达变化以及细胞黏附能力和骨架结构的改变。Wnt信号通路是诱导细胞发生EMT的重要信号通路，β-catenin作为Wnt信号通路的关键蛋白，也是细胞内的一种多功能蛋白，与细胞黏附因子E-cadherin形成稳点复合物维持细胞间的稳定结构。当Wnt信号通路激活之后，β-catenin大量增高并解离与E-cadherin的稳定连接，导致细胞失去彼此间的黏附从而启动EMT^{[3, 13]}。本研究结果显示：转染miR-200c的三阴性乳腺癌细胞中的β-catenin和vimentin表达水平均明显降低。β-catenin作为Wnt信号通路关键蛋白，常与EMT间质标志物vimentin和EMT转录因子slug协同变化。研究^[14-16]结果表明：slug可通过激活β-catenin启动乳腺癌EMT，同时被激活的β-catenin又上调了slug的相对表达量，在EMT的发生过程中二者起着相互促进的作用，从而建立了Wnt信号通路与EMT之间的正反馈效应。因此本文作者推测：mirR-200c可能通过下调β-catenin和vimentin，进而调节Wnt信号通路相关基因最终抑制三阴性乳腺癌EMT。

本研究对转染后细胞迁移能力和增殖能力的检测结果显示：转染miR-200c的三阴性乳腺癌细胞迁移与增殖能力均明显减弱；本研究结果进一步表明：在三阴性乳腺癌中，miR-200c可能通过降低β-catenin和vimentin的表达水平，并削弱细胞的迁移能力与增殖能力，最终抑制三阴性乳腺癌EMT。本研究将Wnt信号通路中关键蛋白β-catenin和vimentin作为miR-200c调节EMT的切入点，结合迁移能力与增殖能力实验，进一步完善了miR-200c抑制三阴性乳腺癌EMT的机制。β-catenin作为wnt信号通路与EMT之间的连接桥梁，与EMT相关因子vimentin协同表达的同时，也调节着Wnt信号的活性，其与vimentin均可被miR-200c抑制，表明miR-200c可以通过调节β-catenin活性，从而抑制三阴性乳腺癌EMT，也为寻找三阴性乳腺癌的个体化治疗方案提供了有力依据。