血虚证主要是指人体血液减少，不能濡养滋润脏腑经脉，四肢百骸，而出现一系列的虚弱性表现的症候总称^[1]。血虚证是临床上许多疾病的伴随症状之一，重者多见于再生障碍性贫血、肿瘤放化疗后，轻者可见于妇女生产、引产、流产、刮产、放环、月经过多及崩漏等。血虚证临床常见面色淡白或萎黄、毛发不泽、唇舌和爪甲淡白、头晕、视物昏花、心悸、健忘、失眠及乏力等虚弱症候^[2]。参红补血颗粒(Shen Hong Bu Xue Granule, SHBXG)以红景天和红参为君，红色入心，以助心主血；黄精、白术和麦冬三味药健脾益肺，培土生金。SHBXG处方精练，功能明确，具有益气生血和养血安神的功效。研究^[3-5]表明：血虚证往往伴随免疫功能的降低。目前临床上治疗血虚证的药物品种较多，中药多数以阿胶和当归为主，西药主要有复方硫酸亚铁颗粒、叶酸和维生素B12等，少有关于红景天及红参治疗血虚证的报道。本研究以复方阿胶浆为阳性药物，观察SHBXG对血虚证小鼠造血和免疫功能的影响。

健康ICR小鼠60只，雌雄各半，体质量(20±2) g，购于长春市亿斯实验动物技术有限责任公司，动物许可证号码：SCXK(吉)-2016-0003。

SHBXG(长春中医药大学制备，含生药量1.39 g·g^-1)，复方阿胶浆(山东东阿阿胶股份有限公司，批号：1407014)。注射用环磷酰胺(CTX，江苏盛迪医药有限公司，批号：15072825)，乙酰苯肼(APH，国药集团化学试剂有限公司，批号：20121107)，促红细胞生成素(erythropoietin, EPO) Elisa kit和粒细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF) Elisa kit(武汉博士德生物工程有限公司，货号：EK0333、EK0365)，DNA Ladder(上海生工生物工程有限公司，货号：B600109)，AxyPrep总RNA小量制备试剂盒(美国Axygen公司，货号AP-UN-MS-RNA-50)，PrimeScript^TM RT Master Mix和SYBR^® Premix Ex Taq^TM Ⅱ(大连宝生物工程有限公司，货号:RR036A、RR82LR)，琼脂糖和DNA上样缓冲液(上海碧云天公司，货号：ST004L、D0071)。全自动血液分析仪(中国Mindray公司，型号：BC-5300Vet)，酶标仪(美国Thermo公司，型号：Multiskan FC)，紫外分光光度计(美国Thermo公司，型号：NanoDrop 2000)，荧光定量PCR仪(美国Stratagene公司，型号：Mx3000)，凝胶成像仪(美国Aplegen公司，型号：OmegaLum C)，高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司，型号：5424R)。

小鼠适应性喂养3 d，给予充足的水和食物，60只小鼠随机分为空白对照组，模型组，复方阿胶浆组，低、中、高剂量SHBXG组；每组10只。除空白对照组外，其他各组小鼠于实验第2天皮下注射APH(20 mg·kg^-1)，于第4天再次皮下注射APH(40 mg·kg^-1)，同时从第4天起小鼠腹腔注射CTX(40 mg·kg^-1)，每日1次，连续4 d；空白对照组小鼠皮下注射等容量生理盐水^[6]。血虚证评定指标：造模成功小鼠红细胞(red blood cell，RBC)、白细胞(white blood cell，WBC)、血红蛋白(hemoglobin，HGB)、红细胞比容(hematocrit，HCT)及血小板(blood platelet，PLT)水平均明显下降^[7]。各组小鼠给药剂量：低剂量SHBXG组为3 g·kg^-1，中剂量SHBXG组为6 g·kg^-1，高剂量SHBXG组为9 g·kg^-1，复方阿胶浆组小鼠给予复方阿胶浆11 mL·kg^-1，空白对照组和模型组小鼠每天给予等容量蒸馏水灌胃。每天1次，连续给药14 d。末次给药30 min后，眶静脉取血，脱颈椎处死后取骨髓^[8]和肾脏。

末次给药30 min后，眶静脉取血，全自动血液分析仪立即测定各组小鼠血液中RBC、HGB、HCT、WBC和PLT水平。剩余血液样品置于37℃水浴30 min后，2 500 r·min^-1离心10 min，分离出血清，－80℃超低温冰箱保存备用。

从－80℃超低温冰箱取出血清，按武汉博士德生物工程有限公司提供的EPO Elisa kit和GM-CSF Elisa kit说明书检测各组小鼠血清中EPO和GM-CSF水平。

提取总RNA：从-80℃超低温冰箱取出肾脏以及骨髓组织样品，液氮下研磨成粉末; 按AxyPrep总RNA小量制备试剂盒说明书提取各组小鼠肾及骨髓组织总RNA，紫外分光光度计测定总RNA浓度；按照Reverse transcriptase逆转录试剂盒说明书操作规程逆转录合成cDNA第一链，20 μL反应体系：5×PrimeScript RT Master Mix 4 μL、Total RNA4 μL、RNA free H₂O 12 μL，反应条件：37℃、15 min，85℃、5 s。合成的cDNA于－20℃储存备用。以cDNA链作为模板，进行PCR扩增反应，30 μL反应体系：模板cDNA 3 μL、上游引物1.2 μL、下游引物1.2 μL、SYBR Premix Ex TaqⅡ(2×)15 μL、灭菌水9.6 μL，反应条件：95℃预变性30 s，95℃变性5 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，40循环扩增反应后，72℃、10 min，4℃保存。EPO基因引物：正义链为5′-TGTCACGATGGGTT-3′，反义链为5′-TCGGAGTGGAGCAGGT-3′(326 bp)；GM-CSF基因引物：正义链为5′-CAAAGAAGCCCTGAAC-3′，反义链为5′-AATCCGCATAGGTGGT-3′(251 bp)；18S引物：正义链为5′-ACGGCTACCACATCC-3′，反义链为5′-CAGACTTGCCCTCC-3′(162 bp)。取5 μL PCR反应产物加入1 μL 6×Loading Buffer混匀，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，电压90 V，凝胶成像系统观察、拍照，记录结果。Quantity One软件分析目的条带灰度值，EPO/GM-CSF mRNA表达水平=目的条带灰度值/18s条带灰度值。

采用SPSS13.0统计软件进行统计学分析。小鼠血清中EPO和GM-CSF水平、肾组织中EPO和骨髓组织中GM-CSF mRNA表达水平以x±s表示，组间样本均数比较采用单因素方差分析。以α=0.05为检验水准。

与空白对照组比较，模型组小鼠RBC、HGB、HCT、WBC和PLT水平明显降低(P < 0.05或P < 0.01)，表明造模成功；与模型组比较，复方阿胶浆组和各剂量SHBXG组小鼠血液中RBC、HGB和HCT和PLT水平明显升高(P < 0.05或P < 0.01)，复方阿胶浆组和高剂量SHBXG组小鼠血液中WBC水平明显升高(P < 0.05)。见表 1。

与空白对照组比较，模型组小鼠血清中EPO和GM-CSF水平明显降低(P < 0.05)；与模型组比较，复方阿胶浆组、中和高剂量SHBXG组小鼠血清中EPO和GM-CSF水平明显升高(P < 0.05)。见表 2。

与空白对照组比较，模型组小鼠肾组织中EPOmRNA和骨髓组织中GM-CSF mRNA表达水平明显降低(P < 0.05或P < 0.01)；与模型组比较，复方阿胶浆组和各剂量SHBXG组小鼠肾组织中EPOmRNA和骨髓组织中GM-CSF mRNA表达水平明显升高(P < 0.05或P < 0.01)。见图 1和表 3。

Lane 1: DNA Ladder; Lane2: Blank control group; Lane3:Model group; Lane4: Compound E-jiao Slurry group; Lane5-7: High, middle and low doses of SHBXG groups. 图 1 RT-PCR法检测各组小鼠肾组织中EPO和骨髓组织中GM-CSF mRNA表达的电泳图 Figure 1 Electrophoregram of expressions of EPO mRNA in kidney tissue and GM-CSF mRNA in bone marrow tissue of mice in various groups detected by RT-PCR method

图选项

血虚证是一种临床常见疾病，与现代医学中的贫血相似，二者之间有密切的联系^[9]。贫血通常是指一个症状或状态，而并非某一独立的疾病，身体的各个脏器发生病变均可诱发贫血。贫血在本质上可反映机体气与血的关系，由于血虚，使气失去血的充养及依附进而导致气虚，最终出现气血两虚^[10]。血虚证的发生往往伴随着机体免疫功能的下降，霍超等^[11]采用综合放血法复制小鼠血虚模型，血虚模型为小鼠淋巴细胞增殖受到抑制，导致机体免疫功能受损。朱映黎等^[12]采用CTX法复制小鼠血虚模型，引起血虚小鼠免疫功能紊乱，出现精神萎靡和行动迟缓等症状。

本研究采用CTX和APH联合应用的方法复制小鼠血虚模型，APH对红细胞有缓慢性的进行性损伤作用，造成血液中红细胞数量明显减少，CTX是细胞毒制剂，其作用机制是抑制骨髓功能，对增殖周期中各期细胞均有杀灭作用, 同时可损伤机体的免疫器官^[13]。本研究结果表明：与空白对照组比较，模型组小鼠血液中RBC、HGB、HCT、WBC和PLT水平均明显降低；各剂量SHBXG组血虚小鼠血液中RBC、HGB、HCT、WBC和PLT水平较模型组升高，表明SHBXG对血虚证有明显的改善作用，且CTX和APH联合应用可以较好地复制中医理论指导下的血虚动物模型。

EPO是一种特异性作用于红系祖细胞的激素糖蛋白，主要由肾球旁细胞产生，其生物学作用主要是促进红系祖细胞的增殖、分化和成熟^[14]。本研究结果表明：与空白对照组比较，模型组小鼠肾组织中EPOmRNA的表达及血清中EPO水平均明显降低，这可能是由于CTX产生了明显的细胞毒性作用，抑制了小鼠肾组织中EPOmRNA的表达，同时由于APH的溶血作用，大量破坏了红系祖细胞，造成血清中EPO水平明显降低。不同剂量SHBXG组小鼠肾组织中EPO mRNA表达水平明显高于模型组，且中和高剂量SHBXG组小鼠血清中EPO水平也明显升高，表明SHBXG可以诱导小鼠肾组织中EPO mRNA表达，促使肾脏大量合成EP O进入血清，同时可以在一定程度上抑制APH的溶血作用。GM-CSF是一种具有广谱效应的多肽生长因子，能促进多种造血细胞的存活、增殖和分化，并通过提高中性粒细胞、单核细胞及树突状细胞等的数量发挥免疫调节作用，骨髓基质细胞是分泌GM-CSF的重要部位^[15-16]。

本研究结果表明：不同剂量SHBXG组小鼠骨髓组织中GM-CSF mRNA表达水平明显高于模型组，且中和高剂量SHBXG组小鼠血清GM-CSF水平也明显升高，表明SHBXG可以在一定程度上抑制CTX的细胞毒性，诱导小鼠骨髓基质细胞分泌GM-CSF，使血清中GM-CSF水平升高，促进免疫相关细胞增加，增强血虚小鼠的免疫能力。

综上所述，SHBXG可以明显改善APH联合CTX所致的小鼠血虚症状，同时增强血虚小鼠免疫能力，这与其提高小鼠肾组织中EPO mRNA和骨髓组织中GM-CSF mRNA表达水平密切相关，也可能是SHBXG治疗血虚证的机制之一。