吉林大学学报(医学版)  2017, Vol. 43 Issue (03): 538-542

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刘文斌, 徐岩, 李智萌, 周佳, 黄晓巍
LIU Wenbin, XU Yan, LI Zhimeng, ZHOU Jia, HUANG Xiaowei
参红补血颗粒对血虚证小鼠肾脏组织中EPO mRNA和骨髓组织中GM-CSF mRNA表达水平的影响
Effects of Shen Hong Bu Xue Granule on expressions of EPO mRNA in kidney tissue and GM-CSF mRNA in bone marrow tissue in mice with blood deficiency
吉林大学学报(医学版), 2017, 43(03): 538-542
Journal of Jilin University (Medicine Edition), 2017, 43(03): 538-542
10.13481/j.1671-587x.20170315

文章历史

收稿日期: 2017-01-10
参红补血颗粒对血虚证小鼠肾脏组织中EPO mRNA和骨髓组织中GM-CSF mRNA表达水平的影响
刘文斌1, 徐岩2, 李智萌2, 周佳2, 黄晓巍2     
1. 吉林省食品药品认证中心药品生产管理科, 吉林 长春 130062;
2. 长春中医药大学中医药与生物工程 研发中心, 吉林 长春 130117
[摘要]: 目的: 观察参红补血颗粒(SHBXG)对血虚证模型小鼠肾组织中促红细胞生成素(EPO)mRNA和骨髓组织中粒细胞集落刺激因子(GM-CSF)mRNA表达水平的影响,探讨SHBXG对血虚证小鼠的保护作用及其机制。 方法: 乙酰苯肼(APH)和环磷酰胺(CTX)联合应用复制血虚证小鼠模型。60只小鼠分为空白对照组,模型组,复方阿胶浆组,低、中和高剂量SHBXG组;每组10只。连续给药14 d后,收集小鼠血清、肾脏及骨髓组织。血液分析仪检测各组小鼠血液中红细胞(RBC)、血红蛋白(HGB)、红细胞比容(HCT)、白细胞(WBC)及血小板(PLT)水平,ELISA法检测各组小鼠血清中EPO和GM-CSF水平,RT-PCR法检测各组小鼠肾脏组织中EPOmRNA及骨髓组织中GM-CSF mRNA的表达水平。 结果: 血液分析仪检测,与模型组比较,复方阿胶浆组和各剂量SHBXG组小鼠血液中RBC、HGB、HCT和PLT水平明显升高(P < 0.05或P < 0.01),复方阿胶浆组和高剂量SHBXG组小鼠血液中WBC水平明显升高(P < 0.05)。ELISA法检测,与模型组比较,复方阿胶浆组、各剂量SHBXG组小鼠血清中EPO和GM-CSF水平明显升高(P < 0.05)。RT-PCR法检测,与模型组比较,复方阿胶浆组、中和高剂量SHBXG组小鼠肾组织中EPO mRNA和骨髓组织中GM-CSF mRNA表达水平明显升高(P < 0.05或P < 0.01)。 结论: SHBXG可以改善血虚证小鼠血虚症状,其机制可能与提高小鼠肾组织中EPO mRNA和骨髓组织中GM-CSF mRNA的表达水平有关联。
关键词: 参红补血颗粒    血虚证    促红细胞生成素    粒细胞集落刺激因子    
Effects of Shen Hong Bu Xue Granule on expressions of EPO mRNA in kidney tissue and GM-CSF mRNA in bone marrow tissue in mice with blood deficiency
LIU Wenbin1, XU Yan2, LI Zhimeng2, ZHOU Jia2, HUANG Xiaowei2     
1. Department of Production and Management, Jilin Certification Center for Food and Drug, Changchun 130062, China;
2. Center of Traditional Chinese Medicine and Bioengineering, Changchun University of Traditional Chinese Medicine, Changchun 130117, China
[Abstract]: Objective: To observe the effects of Shen Hong Bu Xue Granule(SHBXG) on the expression levels of erythropoietin(EPO)mRNA in kidney tissue and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) mRNA in bone marrow tissue of the mice with blood deficiency, and to investigate the protective effect of SHBXG on the blood deficiency mice and its mechanism. Methods: The mouse model of blood deficiency was established with acetylphenylhydrazine(APH) and cytoxan(CTX).A total of 60 mice were divided into blank control group, model group, Compound E-jiao Slurry group and low, middle, high doses of SHBXG groups(n=10).The serum, kidney and bone marrow tissues from all the mice were collected after 14 d consecutive administration.The levels of red blood cells(RBC), hemoglobin level(HGB), hematocrit(HCT), leukocytes(WBC), and platelet(PLT) in blood of the mice were detected by automatic blood analyzer; the levels of serum EPO and GM-CSF of the mice in various groups mice were detected by ELISA method; the expression levels of EPO mRNA in kidney tissue and GM-CSF mRNA in bone marrow tissue of the mice were detected by RT-PCR method. Results: The results of automatic blood analyzer showed that the levels of RBC, HGB, HCT, and PLT of the mice in Compound E-jiao Slurry group and different doses of SHBXG groups were increased significantly compared with model group (P < 0.05 or P < 0.01);the levels of WBC of mice in Compound E-jiao Slurry group and high dose of SHBXG group were increased significantly compared with model group(P < 0.05).The ELISA results showed that the levels of serum EPO and GM-CSF of the mice in Compound E-jiao Slurry group and different doses of SHBXG groups were increased significantly compared with model group(P < 0.05).The PC-PCR results showed that the expression levels of EPO mRNA in kidney tissue and GM-CSF mRNA in bone marrow tissue of the mice in Compound E-jiao Slurry group and middle and high doses of SHBXG groups were increased significantly compared with model group(P < 0.05 or P < 0.01). Conclusion: SHBXG could improve the blood deficiency symptom in the mice with blood deficiency, and its mechanism may be related to increasing the expression levels of EPO mRNA in kidney tissue and GM-CSF mRNA in bone marrow tissue of the mice.
Key words: Shen Hong Bu Xue Granule     blood deficiency     erythropoietin     granulocyte-macrophage colony-stimulating factor    

血虚证主要是指人体血液减少,不能濡养滋润脏腑经脉,四肢百骸,而出现一系列的虚弱性表现的症候总称[1]。血虚证是临床上许多疾病的伴随症状之一,重者多见于再生障碍性贫血、肿瘤放化疗后,轻者可见于妇女生产、引产、流产、刮产、放环、月经过多及崩漏等。血虚证临床常见面色淡白或萎黄、毛发不泽、唇舌和爪甲淡白、头晕、视物昏花、心悸、健忘、失眠及乏力等虚弱症候[2]。参红补血颗粒(Shen Hong Bu Xue Granule, SHBXG)以红景天和红参为君,红色入心,以助心主血;黄精、白术和麦冬三味药健脾益肺,培土生金。SHBXG处方精练,功能明确,具有益气生血和养血安神的功效。研究[3-5]表明:血虚证往往伴随免疫功能的降低。目前临床上治疗血虚证的药物品种较多,中药多数以阿胶和当归为主,西药主要有复方硫酸亚铁颗粒、叶酸和维生素B12等,少有关于红景天及红参治疗血虚证的报道。本研究以复方阿胶浆为阳性药物,观察SHBXG对血虚证小鼠造血和免疫功能的影响。

1 材料与方法 1.1 实验动物

健康ICR小鼠60只,雌雄各半,体质量(20±2) g,购于长春市亿斯实验动物技术有限责任公司,动物许可证号码:SCXK(吉)-2016-0003。

1.2 药品、主要试剂和仪器

SHBXG(长春中医药大学制备,含生药量1.39 g·g-1),复方阿胶浆(山东东阿阿胶股份有限公司,批号:1407014)。注射用环磷酰胺(CTX,江苏盛迪医药有限公司,批号:15072825),乙酰苯肼(APH,国药集团化学试剂有限公司,批号:20121107),促红细胞生成素(erythropoietin, EPO) Elisa kit和粒细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF) Elisa kit(武汉博士德生物工程有限公司,货号:EK0333、EK0365),DNA Ladder(上海生工生物工程有限公司,货号:B600109),AxyPrep总RNA小量制备试剂盒(美国Axygen公司,货号AP-UN-MS-RNA-50),PrimeScriptTM RT Master Mix和SYBR® Premix Ex TaqTM Ⅱ(大连宝生物工程有限公司,货号:RR036A、RR82LR),琼脂糖和DNA上样缓冲液(上海碧云天公司,货号:ST004L、D0071)。全自动血液分析仪(中国Mindray公司,型号:BC-5300Vet),酶标仪(美国Thermo公司,型号:Multiskan FC),紫外分光光度计(美国Thermo公司,型号:NanoDrop 2000),荧光定量PCR仪(美国Stratagene公司,型号:Mx3000),凝胶成像仪(美国Aplegen公司,型号:OmegaLum C),高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司,型号:5424R)。

1.3 模型制备、动物分组和给药方式

小鼠适应性喂养3 d,给予充足的水和食物,60只小鼠随机分为空白对照组,模型组,复方阿胶浆组,低、中、高剂量SHBXG组;每组10只。除空白对照组外,其他各组小鼠于实验第2天皮下注射APH(20 mg·kg-1),于第4天再次皮下注射APH(40 mg·kg-1),同时从第4天起小鼠腹腔注射CTX(40 mg·kg-1),每日1次,连续4 d;空白对照组小鼠皮下注射等容量生理盐水[6]。血虚证评定指标:造模成功小鼠红细胞(red blood cell,RBC)、白细胞(white blood cell,WBC)、血红蛋白(hemoglobin,HGB)、红细胞比容(hematocrit,HCT)及血小板(blood platelet,PLT)水平均明显下降[7]。各组小鼠给药剂量:低剂量SHBXG组为3 g·kg-1,中剂量SHBXG组为6 g·kg-1,高剂量SHBXG组为9 g·kg-1,复方阿胶浆组小鼠给予复方阿胶浆11 mL·kg-1,空白对照组和模型组小鼠每天给予等容量蒸馏水灌胃。每天1次,连续给药14 d。末次给药30 min后,眶静脉取血,脱颈椎处死后取骨髓[8]和肾脏。

1.4 血液分析仪检测小鼠血液中RBC、HGB、HCT、WBC和PLT水平

末次给药30 min后,眶静脉取血,全自动血液分析仪立即测定各组小鼠血液中RBC、HGB、HCT、WBC和PLT水平。剩余血液样品置于37℃水浴30 min后,2 500 r·min-1离心10 min,分离出血清,-80℃超低温冰箱保存备用。

1.5 ELISA法检测小鼠血清中EPO和GM-CSF水平

从-80℃超低温冰箱取出血清,按武汉博士德生物工程有限公司提供的EPO Elisa kit和GM-CSF Elisa kit说明书检测各组小鼠血清中EPO和GM-CSF水平。

1.6 RT-PCR法检测小鼠肾组织中EPOmRNA和骨髓组织中GM-CSF mRNA的表达水平

提取总RNA:从-80℃超低温冰箱取出肾脏以及骨髓组织样品,液氮下研磨成粉末; 按AxyPrep总RNA小量制备试剂盒说明书提取各组小鼠肾及骨髓组织总RNA,紫外分光光度计测定总RNA浓度;按照Reverse transcriptase逆转录试剂盒说明书操作规程逆转录合成cDNA第一链,20 μL反应体系:5×PrimeScript RT Master Mix 4 μL、Total RNA4 μL、RNA free H2O 12 μL,反应条件:37℃、15 min,85℃、5 s。合成的cDNA于-20℃储存备用。以cDNA链作为模板,进行PCR扩增反应,30 μL反应体系:模板cDNA 3 μL、上游引物1.2 μL、下游引物1.2 μL、SYBR Premix Ex TaqⅡ(2×)15 μL、灭菌水9.6 μL,反应条件:95℃预变性30 s,95℃变性5 s,55℃退火30 s,72℃延伸30 s,40循环扩增反应后,72℃、10 min,4℃保存。EPO基因引物:正义链为5′-TGTCACGATGGGTT-3′,反义链为5′-TCGGAGTGGAGCAGGT-3′(326 bp);GM-CSF基因引物:正义链为5′-CAAAGAAGCCCTGAAC-3′,反义链为5′-AATCCGCATAGGTGGT-3′(251 bp);18S引物:正义链为5′-ACGGCTACCACATCC-3′,反义链为5′-CAGACTTGCCCTCC-3′(162 bp)。取5 μL PCR反应产物加入1 μL 6×Loading Buffer混匀,1.5%琼脂糖凝胶电泳检测,电压90 V,凝胶成像系统观察、拍照,记录结果。Quantity One软件分析目的条带灰度值,EPO/GM-CSF mRNA表达水平=目的条带灰度值/18s条带灰度值。

1.7 统计学分析

采用SPSS13.0统计软件进行统计学分析。小鼠血清中EPO和GM-CSF水平、肾组织中EPO和骨髓组织中GM-CSF mRNA表达水平以x±s表示,组间样本均数比较采用单因素方差分析。以α=0.05为检验水准。

2 结果 2.1 各组小鼠血液中RBC、HGB、HCT、WBC和PLT水平

与空白对照组比较,模型组小鼠RBC、HGB、HCT、WBC和PLT水平明显降低(P < 0.05或P < 0.01),表明造模成功;与模型组比较,复方阿胶浆组和各剂量SHBXG组小鼠血液中RBC、HGB和HCT和PLT水平明显升高(P < 0.05或P < 0.01),复方阿胶浆组和高剂量SHBXG组小鼠血液中WBC水平明显升高(P < 0.05)。见表 1

表 1 各组小鼠血液中RBC、HGB、HCT、WBC和PLT水平 Table 1 Levels of RBC, HGB, HCT, WBC, and PLT in blood of mice in various groups
(n=10, x±s)
Group RBC(×1012 L-1) HGB [ρβ/(g·L-1)] HCT(η/%) WBC(×109 L-1) PLT(×109 L-1)
Blank control 8.21±0.51 10.53±2.05 38.02±3.07 8.09±1.50 530.85±138.25
Model 4.09±0.34** 6.78±1.42* 26.80±3.66* 5.01±1.95* 420.12±98.87*
Compound E-jiao Slurry 5.69±0.48 8.85±1.76 31.17±3.88 6.21±0.89 480.87±120.09
TAOCO
 Low dose 5.02±0.92 8.92±1.85 28.09±2.39 5.26±1.54 462.37±107.50
 Middle dose 5.40±0.55 10.01±2.26△△ 34.18±3.84 5.30±1.87 491.14±130.06
 High dose 5.32±0.68 9.02±1.80 33.95±4.20 6.38±1.32 502.24±108.87
  *P < 0.05, **P < 0.01 compared with blank control group; P < 0.05, △△ P < 0.01 compared with model group.
2.2 各组小鼠血清中EPO和GM-CSF水平

与空白对照组比较,模型组小鼠血清中EPO和GM-CSF水平明显降低(P < 0.05);与模型组比较,复方阿胶浆组、中和高剂量SHBXG组小鼠血清中EPO和GM-CSF水平明显升高(P < 0.05)。见表 2

表 2 各组小鼠血清中EPO和GM-CSF水平 Table 2 Levels of serum EPO and GM-CSF of mice in various groups
(n=10, x±s)
Group EPO
[λβ/(U·L-1)]
GM-CSF
[ρβ/(ng·L-1)]
Blank control 39.85±4.21 60.26±8.29
Model 32.26±4.19* 52.80±6.32*
Compound E-jiao
  Slurry
38.76±4.87 62.15±7.75
SHBXG
 Low dose 34.21±5.27 52.93±8.38
 Middle dose 37.21±4.08 58.60±8.04
 High dose 37.65±3.85 59.96±6.93
  *P < 0.05compared with blank control group;P < 0.05 compared with model group.
2.3 各组小鼠肾组织中EPOmRNA和骨髓组织中GM-CSF mRNA表达水平

与空白对照组比较,模型组小鼠肾组织中EPOmRNA和骨髓组织中GM-CSF mRNA表达水平明显降低(P < 0.05或P < 0.01);与模型组比较,复方阿胶浆组和各剂量SHBXG组小鼠肾组织中EPOmRNA和骨髓组织中GM-CSF mRNA表达水平明显升高(P < 0.05或P < 0.01)。见图 1表 3

Lane 1: DNA Ladder; Lane2: Blank control group; Lane3:Model group; Lane4: Compound E-jiao Slurry group; Lane5-7: High, middle and low doses of SHBXG groups. 图 1 RT-PCR法检测各组小鼠肾组织中EPO和骨髓组织中GM-CSF mRNA表达的电泳图 Figure 1 Electrophoregram of expressions of EPO mRNA in kidney tissue and GM-CSF mRNA in bone marrow tissue of mice in various groups detected by RT-PCR method
表 3 各组小鼠肾脏组织中EPO mRNA和骨髓组织中GM-CSF mRNA表达水平 Table 3 Expression levels of EPO mRNA in kidney tissue and GM-CSF mRNA in bone marrow tissue of mice in various groups
(n=10, x±s)
Group EPO mRNA GM-CSF mRNA
Blank control 1.35±0.28 1.28±0.24
Model 0.88±0.22* 0.70±0.18**
Compound
  E-jiao Slurry
1.39±0.35 1.23±0.20△△
SHBXG
 Low dose 1.00±0.17 0.93±0.19
 Middle dose 1.18±0.21 1.15±0.32
 High dose 1.22±0.30 1.07±0.28
  *P < 0.05, **P < 0.01 compared with blank control group; P < 0.05, P < 0.01 compared with model group.
3 讨论

血虚证是一种临床常见疾病,与现代医学中的贫血相似,二者之间有密切的联系[9]。贫血通常是指一个症状或状态,而并非某一独立的疾病,身体的各个脏器发生病变均可诱发贫血。贫血在本质上可反映机体气与血的关系,由于血虚,使气失去血的充养及依附进而导致气虚,最终出现气血两虚[10]。血虚证的发生往往伴随着机体免疫功能的下降,霍超等[11]采用综合放血法复制小鼠血虚模型,血虚模型为小鼠淋巴细胞增殖受到抑制,导致机体免疫功能受损。朱映黎等[12]采用CTX法复制小鼠血虚模型,引起血虚小鼠免疫功能紊乱,出现精神萎靡和行动迟缓等症状。

本研究采用CTX和APH联合应用的方法复制小鼠血虚模型,APH对红细胞有缓慢性的进行性损伤作用,造成血液中红细胞数量明显减少,CTX是细胞毒制剂,其作用机制是抑制骨髓功能,对增殖周期中各期细胞均有杀灭作用, 同时可损伤机体的免疫器官[13]。本研究结果表明:与空白对照组比较,模型组小鼠血液中RBC、HGB、HCT、WBC和PLT水平均明显降低;各剂量SHBXG组血虚小鼠血液中RBC、HGB、HCT、WBC和PLT水平较模型组升高,表明SHBXG对血虚证有明显的改善作用,且CTX和APH联合应用可以较好地复制中医理论指导下的血虚动物模型。

EPO是一种特异性作用于红系祖细胞的激素糖蛋白,主要由肾球旁细胞产生,其生物学作用主要是促进红系祖细胞的增殖、分化和成熟[14]。本研究结果表明:与空白对照组比较,模型组小鼠肾组织中EPOmRNA的表达及血清中EPO水平均明显降低,这可能是由于CTX产生了明显的细胞毒性作用,抑制了小鼠肾组织中EPOmRNA的表达,同时由于APH的溶血作用,大量破坏了红系祖细胞,造成血清中EPO水平明显降低。不同剂量SHBXG组小鼠肾组织中EPO mRNA表达水平明显高于模型组,且中和高剂量SHBXG组小鼠血清中EPO水平也明显升高,表明SHBXG可以诱导小鼠肾组织中EPO mRNA表达,促使肾脏大量合成EP O进入血清,同时可以在一定程度上抑制APH的溶血作用。GM-CSF是一种具有广谱效应的多肽生长因子,能促进多种造血细胞的存活、增殖和分化,并通过提高中性粒细胞、单核细胞及树突状细胞等的数量发挥免疫调节作用,骨髓基质细胞是分泌GM-CSF的重要部位[15-16]

本研究结果表明:不同剂量SHBXG组小鼠骨髓组织中GM-CSF mRNA表达水平明显高于模型组,且中和高剂量SHBXG组小鼠血清GM-CSF水平也明显升高,表明SHBXG可以在一定程度上抑制CTX的细胞毒性,诱导小鼠骨髓基质细胞分泌GM-CSF,使血清中GM-CSF水平升高,促进免疫相关细胞增加,增强血虚小鼠的免疫能力。

综上所述,SHBXG可以明显改善APH联合CTX所致的小鼠血虚症状,同时增强血虚小鼠免疫能力,这与其提高小鼠肾组织中EPO mRNA和骨髓组织中GM-CSF mRNA表达水平密切相关,也可能是SHBXG治疗血虚证的机制之一。

参考文献
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