吉林大学学报(医学版)  2017, Vol. 43 Issue (03): 507-511

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孙敏英, 刘果木, 接晶, 谢飞, 翟瑞萍, 陈潭秀, 袁红艳, 台桂香
SUN Minying, LIU Guomu, JIE Jing, XIE Fei, ZHAI Ruiping, CHEN Tanxiu, YUAN Hongyan, TAI Guixiang
重组MUC1-MBP融合蛋白联合R848对小鼠T细胞免疫活性的诱导作用
Inductive effect of recombinant MUC1-MBP fusion protein combined with R848 on immune activity of T cells in mice
吉林大学学报(医学版), 2017, 43(03): 507-511
Journal of Jilin University (Medicine Edition), 2017, 43(03): 507-511
10.13481/j.1671-587x.20170309

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收稿日期: 2016-09-19
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孙敏英, 刘果木, 接晶, 谢飞, 翟瑞萍, 陈潭秀, 袁红艳, 台桂香. 重组MUC1-MBP融合蛋白联合R848对小鼠T细胞免疫活性的诱导作用[J]. 吉林大学学报(医学版), 2017, 43(03): 507-511.
SUN Minying, LIU Guomu, JIE Jing, XIE Fei, ZHAI Ruiping, CHEN Tanxiu, YUAN Hongyan, TAI Guixiang. Inductive effect of recombinant MUC1-MBP fusion protein combined with R848 on immune activity of T cells in mice[J]. Journal of Jilin University (Medicine Edition), 2017, 43(03): 507-511.
重组MUC1-MBP融合蛋白联合R848对小鼠T细胞免疫活性的诱导作用
孙敏英1, 刘果木2, 接晶2, 谢飞2, 翟瑞萍2, 陈潭秀2, 袁红艳2, 台桂香2     
1. 吉林大学基础医学院医学生物学实验中心, 吉林 长春 130021;
2. 吉林大学基础医学院免疫学教研室, 吉林 长春 130021
收稿日期: 2016-09-19
基金项目: 吉林省科技厅科技攻关双十工程项目资助课题（20140201012YY）；吉林省长春市科技局科技项目资助课题（201622010100025）
作者简介: 孙敏英(1987-), 女, 吉林省长春市人, 助理工程师, 理学硕士, 主要从事医学生物学方面的研究。
通信作者: 台桂香, 教授, 博士研究生导师(Tel:0431-85619476, E-mail:taiguixiang@163.com)
[摘要]: 目的: 研究MUC1-MBP联合TLR7/8激动剂R848对小鼠T细胞免疫活性的诱导作用，为寻找重组MUC1-MBP融合蛋白的合适佐剂提供实验依据。 方法: 21只C57BL/6小鼠随机分为对照组（注射生理盐水）、MUC1-MBP+ R848组（注射MUC1-MBP+ R848）和MUC1-MBP+卡介苗（BCG）组（注射MUC1-MBP+ BCG），每组7只。第2次免疫后第4~7天无菌取脾脏组织，测定脾指数；淋巴细胞增殖反应测定各组小鼠的刺激指数（SI）；ELISA法测定小鼠脾细胞培养上清中肿瘤坏死因子γ（TNF-γ）和白细胞介素4（IL-4）水平；流式细胞术检测小鼠脾细胞中T淋巴细胞亚群比例。 结果: 与对照组比较，MUC1-MBP+R848组和MUC1-MBP+BCG组小鼠脾指数均升高（P＜0.01），SI升高（P＜0.05），TNF-γ水平升高（P＜0.05或P＜0.01）；且MUC1-MBP+R848组小鼠上述指标高于MUC1-MBP+BCG组（P＜0.05或P＜0.01）；IL-4水平略微升高，但差异无统计学意义（P＞0.05）。与对照组比较，MUC1-MBP+ R848组和MUC1-MBP+ BCG小鼠脾细胞中CD3+细胞、CD4+细胞和CD8+细胞比例明显升高（P＜0.05或P＜0.01）。 结论: MUC1-MBP融合蛋白联合R848或BCG均能诱导小鼠倾向于Th1的细胞免疫应答反应，R848是良好的MUC1-MBP候选佐剂分子。
关键词: MUC1-MBP    R848    肿瘤疫苗    佐剂    
Inductive effect of recombinant MUC1-MBP fusion protein combined with R848 on immune activity of T cells in mice
SUN Minying1, LIU Guomu2, JIE Jing2, XIE Fei2, ZHAI Ruiping2, CHEN Tanxiu2, YUAN Hongyan2, TAI Guixiang2     
1. Experimental Center of Medical Biology, School of Basic Medical Sciences, Jilin University, Changchun 130021, China;
2. Department of Immunology, School of Basic Medical Sciences, Jilin University, Changchun 130021, China
[Abstract]: Objective: To study the inductive effect of recombinant MUC1-MBP fusion protein combined with R848 on the immune activity of T cells in the mice, and to provide experimental basis for searching the suitable adjuvants of recombinant MUC1-MBP fusion protein. Methods: A total of 21 C57BL/6 mice were randomly divided into control group(treat with normal saline), MUC1-MBP+R848 group (treated with MUC1-MBP+R848), and MUC1-MBP+baillus calmette guerin(BCG) group(treated with MUC1-MBP+BCG)(n=7).After immunized for 4-7 d, the spleen tissue was taken and the spleen indexes of the mice in various groups were measured; the stimmulus index(SI) of the mice was detected by lymphocyte proliferation response; the levels of tumor necrosis factor-γ(TNF-γ) and interleukin-4(IL-4) were detected by ELISA method; the proprotions of T lymphocyte subsets in spleen cells were analyzed by flow cytometry. Results: Compared with control group, the spleen indexes, SI, and TNF-γ levels of the mice in MUC1-MBP+ R848 and MUC1-MBP+BCG groups were significantly increased (P < 0.05 orP < 0.01);the indexes metioned above of the mice in MUC1-MBP+ R848 were higher than those in MUC1-MBP+BCG group; the IL-4 levels had no significant difference(P > 0.05).Compared with control group, the proprotions of CD3+T, CD4+T, and CD8+ T cells of the mice in MUC1-MBP+ R848 group and MUC1-MBP+BCG group were significantly increased(P < 0.05 or P < 0.01). Conclusion: Both MUC1-MBP fusion protein combined with R848 and BCG can induce the Th1 type of immune activity in the mice, and R848 is the potential candidate adjuvant for MUC1-MBP.
Key words: MUC1-MBP     R848     cancer vaccine     adjuvant    

MUC1是Mucins黏蛋白家族成员, 存在于正常腺管上皮细胞及其来源的肿瘤细胞表面, 由多肽核芯(核芯肽)和侧枝糖链构成，其核芯肽胞外段为20个氨基酸(SAPD TRPAP GSTAPPA HGVT)的串联重复序列(vriable numbers tandem repeats, VNTRs)。正常组织的MUC1与肿瘤组织不同, 前者分布于腺管上皮细胞分泌极, 与免疫细胞相对隔离, 糖基化丰富; 而后者广泛分布并异常丰富地表达于癌细胞表面, 糖基化不完全, 因此暴露出正常情况下隐蔽的表位, 成为免疫细胞攻击的靶点[1-2]，是制备肿瘤疫苗的理想分子。目前研制的以MUC1为靶点的疫苗包括糖疫苗、蛋白或多肽疫苗和DNA疫苗[3-5], 其中蛋白疫苗具有一定的临床应用前景。本课题组前期研究[6-7]成功构建、表达并纯化了MUC1-MBP融合蛋白，联合卡介苗(BCG)佐剂后，MUC1-MBP+BCG疫苗在药效学方面取得良好效果。BCG是减毒活疫苗，活菌对于诱导Th1应答非常重要，但是活菌数较难控制，导致疫苗稳定性较差，且高剂量BCG的不良反应较大。因此，寻找更加安全、质量可控的佐剂十分必要。随着肿瘤疫苗的深入研究，疫苗佐剂的研究也得到了发展，在众多的佐剂中，Toll样受体(Toll like receptors, TLRs)激动剂备受关注。R848是TLR7/8激动剂，能识别单链RNA(ssRNA)序列，具有抗病毒活性。研究[8]证实：TLR7/8激动剂与人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV-1) 的Gag抗原能诱导抗原特异的IgG和细胞毒性T细胞(cytotoxic lymphocyte, CTL)反应。R848和NY-ESO-1蛋白抗原对于恶性黑色素瘤作用的研究处于Ⅰ期临床阶段，作为前列腺特异性肿瘤抗原的佐剂治疗前列腺癌的研究处于Ⅰ~Ⅱ期临床阶段[9]，作为HPV16 E6E7L2融合蛋白的佐剂治疗外阴癌的研究处于Ⅱ期临床阶段[10]。本研究通过MUC1-MBP联合R848免疫小鼠，探讨其在诱导MUC1特异的T细胞应答中的作用，为重组MUC1-MBP肿瘤疫苗研究提供依据。

1 材料与方法 1.1 实验动物、主要试剂和仪器

21只雌性C57BL/6小鼠, 18~20 g，6~8周龄, 动物合格证号为SCXK(京)2014-0004，购自北京阜康生物科技股份有限公司。B16-MUC1由吉林大学基础医学院医学生物学实验中心建立并保存，重组MUC1-MBP由吉林大学基础医学院医学生物学实验中心重组构建及纯化[6]。BCG购自石家庄开创生化公司，R848购自上海浩然生物技术有限公司。伊思柯夫改良培养液(Iscove’s modified Dubecco’s medium，IMDM)和G418购自美国Gibco公司, FBS和小鼠淋巴细胞分层液购自天津市灏洋生物制品有限公司，白细胞介素2(IL-2) 购自美国Peprotech公司，刀豆蛋白(ConA)购自美国Sigma公司，小鼠抗人MUC1购自美国Abcam公司，FITC-山羊抗小鼠IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司，APC-CD3、PECy-7-CD4和PE-CD8荧光抗体均购自天津三箭生物技术有限公司，小鼠肿瘤坏死因子γ(TNF-γ)和白细胞介素4 (IL-4) ELISA检测试剂盒购自美国eBioscience公司。低温冰箱和二氧化碳孵箱购自日本SANYO公司，酶标仪购自美国BIOTEK公司，紫外分光光度计购自日本岛津公司，Accuri C6流式细胞仪购自美国BD公司。

1.2 动物分组和免疫方案

将21只C57BL/6小鼠随机分为3组，每组7只，分别为对照组(注射生理盐水)、MUC1-MBP+ R848组(注射MUC1-MBP+R848) 和MUC1-MBP+BCG组(注射MUC1-MBP+BCG)，其中MUC1-MBP+ BCG组作为阳性对照组。免疫方案：小鼠颈背部皮下多点注射MUC1-MBP 50 μg，BCG作为佐剂1 mg/只, R848剂量为20 μg/只，隔周1次，共注射2次。

1.3 各组小鼠脾指数测定

第2次免疫后第4~7天，先称每只小鼠体质量，杀鼠，无菌取脾脏，称脾脏质量。脾指数=小鼠脾质量/体质量。

1.4 各组小鼠的刺激指数(stimulus index，SI)测定

在第2次免疫后第4~7天杀鼠，无菌取脾脏、研磨、细胞计数, 制备脾细胞悬液，采用小鼠淋巴细胞分层液分离小鼠脾脏单个核细胞，采用IMDM调整细胞浓度至1×107 mL-1，每孔100μL，加入96孔板中。非特异性淋巴细胞增殖反应：实验分为阴性对照组和ConA刺激组(终浓度5mg·L-1)，每组设3复孔，37 ℃、CO2培养箱中培养48 h后，加入WST-1检测试剂，每孔10 μL，继续反应1 h，通过酶标仪检测450 nm处吸光度(A)值。MUC1特异淋巴细胞增殖反应：实验分为阴性对照组、IL-2单独刺激组(终浓度100 U·mL-1)和MUC1多肽刺激组(20mg·L-1MUC1多肽+100 U·mL-1IL-2)。置于37 ℃、CO2培养箱培养3 d，半量换液，继续培养5 d后，吸取每孔细胞培养上清100μL用于细胞因子的检测，加入WST-1检测试剂(每孔10 μL)，继续反应1 h，通过酶标仪检测450 nm波长处A值，SI=实验孔A值/对照孔A值。

1.5 ELISA法检测各组小鼠脾细胞培养上清中细胞因子TNF-γ和IL-4水平

收集ConA刺激2 d和MUC1刺激5 d的淋巴细胞培养上清，按照TNF-γ和IL-4检测试剂盒说明书操作。以包被抗体(抗TNF-γ和IL-4的抗体)包被96孔酶标板，每个样本设双复孔，4 ℃过夜。采用PBS-0.05%Tween-20洗板5次，加入封闭液封闭1 h后，洗涤2次，加入标准品(TNF-γ：2000.000、1000.000、500.000、250.000、125.000、62.500、32.500和15.625 ng·L-1；IL-4标准品配制：500.0、250.0、125.0、62.5、32.5、15.6、7.8和3.9 ng·L-1)和样品，每孔100μL，4 ℃过夜。洗涤5次，加入检测抗体室温孵育1 h，洗涤5次，加入酶标抗体Avindin-HRP, 室温孵育30 min。洗涤7次，加入TMB，室温15 min。加入硫酸终止后，采用酶标仪于450nm波长处测定A值。

1.6 流式细胞术检测各组小鼠脾细胞中T淋巴细胞亚群比例

取脾淋巴细胞1×106个加入1.5 mLEP管中，加入1 mL PBS，1500 r·min-1离心5 min，4 ℃离心，弃上清，以1:100的稀释度在各管中加入CD3-APC、CD4-PECy7和CD8-PE，并设抗体单独补偿管，冰上避光孵育，每隔15 min轻弹几次，30 min后加入1 mL PBS，1500 r·min-1离心5 min，4 ℃离心，洗涤2次后，各管加入200 μL PBS, 将细胞团吹打开成单细胞悬液，300目滤网过滤后，采用流式细胞术检测T淋巴细胞亚群的比例。

1.7 统计学分析

采用Graphpad Prism 5统计软件进行统计学分析。各组小鼠脾指数，SI，脾细胞培养上清中TNF-γ、IL-4水平和脾细胞中T淋巴细胞亚群比例以x±s表示；组间样本均数比较采用t检验。以α=0.05为检验水准。

2 结果 2.1 各组小鼠脾指数和SI

MUC1-MBP+R848组和MUC1-MBP+BCG组小鼠脾指数明显高于对照组(P＜0.01)。非特异性淋巴细胞增殖反应：MUC1-MBP+R848组和MUC1-MBP+BCG组小鼠SI高于对照组(P＜0.05)，以MUC1-MBP+BCG组升高更为明显。MUC1特异淋巴增殖反应：MUC1-MBP+R848组SI接近MUC1-MBP+BCG组，且均高于对照组(P＜0.05)。见表 1。

表 1 各组小鼠脾指数和刺激指数 Table 1 Spleen indexes and stimulus index of mice in various groups
(n=7, x±s)
Group Spleen index Stimulus index Specific spleen index
Control 0.0033±0.0010 1.4000±0.1630 31.5000±0.0816
MUC1-MBP+BCG 0.0052±0.0009** 2.2000±0.3266* 1.9860±0.3761*
MUC1-MBP+R848 0.0056±0.0065** 1.6400±0.3593* 1.9710±0.7521*
* P < 0.05, ** P < 0.01 vs control group.
表选项
2.2 各组小鼠脾细胞培养上清中TNF-γ和IL-4水平

MUC1-MBP+R848组和MUC1-MBP+BCG组小鼠脾细胞培养上清中TNF-γ水平高于对照组(P＜0.01)；IL-4水平组间比较差异均无统计学意义(P＞0.05)。见表 2。

表 2 各组小鼠脾细胞培养上清中TNF-γ和IL-4水平 Table 2 Levels of TNF-γand IL-4 in culture supernatant of mice in various groups
[n=7, x±s, ρB/(ng·L-1)]
Group IFN-γ IL-4
Control 245.00±36.74 56.29±10.03
MUC1-MBP+ BCG 447.90±40.91* 65.00±12.25
MUC1-MBP+ R848 776.40±126.00** 81.00±8.98
* P < 0.05, ** P < 0.01 vs control group.
表选项
2.3 各组小鼠脾细胞中T淋巴细胞亚群的比例

与对照组(31.8%)比较，其他2组小鼠脾脏总CD3+T淋巴细胞在脾细胞中的比例升高(P＜0.05或P＜0.01)；MUC1-MBP+R848组为37.3%，MUC1-MBP+BCG组为42.8%。与对照组比较，其他2组小鼠脾脏总CD3+CD4+T细胞、CD3+CD8+T细胞比例有所升高(P＜0.05)。CD4+T细胞：对照组为18.7%，MUC1-MBP+R848组为23.8%，MUC1-MBP+BCG组为26.7%；CD8+T细胞：对照组为12.9%，MUC1-MBP+R848组为14.4%，MUC1-MBP+BCG组为17.5%。见图 1和2。

A: CD3+cells; B:CD4+CD3+cells; C:CD8+CD3+cells; * P < 0.05; ** P < 0.01 vs control group. 图 1 各组小鼠脾细胞中T淋巴细胞亚群比例 Figure 1 Proprotions of T lymphocyte subsets in spleen cells of mice in various groups
图选项
A, B:Control group; C, D:MUC1-MBP+R848 group; E, F:MUC1-MBP+BCG group; A, C, E:CD3-APC; B, D, F:CD4-PECy7, CD8-PE. 图 2 流式细胞术检测各组小鼠脾细胞中T淋巴细胞亚群比例流式图 Figure 2 Flow diagram of proprotions of T lymphocyte subsets in spleen cells of mice in various groups detected by flow cytometry
图选项
3 讨论

为了研究重组MUC1-MBP融合蛋白联合R848诱导小鼠T细胞免疫活性，本课题组采用重组MUC1-MBP+R848和MUC1-MBP+BCG分别免疫C57BL/6小鼠，本研究结果显示：MUC1-MBP+R848组和MUC1-MBP+BCG组小鼠的脾指数和SI升高，说明MUC1-MBP联合R848和联合BCG均可诱导非特异性淋巴细胞增殖和特异性淋巴细胞增殖。

ELISA法检测细胞培养上清中TNF-γ和IL-4水平的结果显示：MUC1-MBP+R848组和MUC1-MBP+BCG组小鼠脾细胞培养上清中TNF-γ水平高于对照组，而且以MUC1-MBP+R848组小鼠脾细胞培养上清中IFN-γ水平升高更加明显，IL-4水平变化不大，提示MUC1-MBP联合R848后强烈诱导MUC1特异性Th1型细胞活化，且效果略优于联合BCG组, 即二者不同程度诱导低水平Th2活化。为进一步分析MUC1-MBP联合R848免疫小鼠对T淋巴细胞亚群的影响，本研究采用流式细胞术检测T淋巴细胞亚群比例变化的结果显示：MUC1-MBP联合R848免疫小鼠可提高T淋巴细胞亚群的比例，其程度与MUC1-MBP联合BCG相当。

本课题组前期研究[11-12]结果显示：BCG并非是联合MUC1-MBP的最佳佐剂，其活性不易控制。随着BCG使用剂量的增加，其在动物体内产生的细胞毒性也增大，表现为体质量下降和注射部位出现坏死结节等[7]。R848是一种相对分子质量较小的咪唑喹啉类化合物，可通过TLR7/8发挥作用，目前在临床上主要用于治疗病毒感染性疾病和肿瘤[13-15]。研究[16-17]显示：R848能够促进人CD56 bright NK细胞亚群TNF-γ的产生, 并且经过R848活化的NK细胞具有杀伤功能，因此R848具有抗感染、抗肿瘤和调节免疫应答等作用。本研究结果也提示：R848诱导MUC1特异性Th1的免疫活性明显优于BCG，提示R848可作为MUC1-MBP佐剂来替代BCG。后续研究可利用荷瘤鼠模型来研究MUC1-MBP联合R848的抗肿瘤作用。

综上所述，R848能够增强抗原特异性的Th1型免疫活性。本研究结果为进一步研究人用抗肿瘤疫苗提供了实验依据，R848作为抗肿瘤疫苗佐剂具有更广阔的临床研究价值。

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