柞蚕蛹虫草又被称为北冬虫夏草(Cordyceps militaris)，其主要生长在吉林、辽宁、河北、四川、湖北和广东等地区，与冬虫夏草均属于虫草属麦角菌科真菌。冬虫夏草含有多糖、核苷、氨基酸、糖醇和甾醇等多种药理活性物质^[1-4]。研究^[5-7]表明：冬虫夏草有抗炎抑菌、促造血和抗肿瘤等多种药理作用以及补肺益肾等功效。冬虫夏草的生物学效应主要是通过调节机体的免疫功能来实现的。目前，对于冬虫夏草的研究^[8-10]广泛，但由于其资源缺乏、采集困难、产量不高和价格昂贵等原因，致使人们不断地寻找其他物质代替冬虫夏草。在柞蚕蛹体上接种北冬虫夏草菌生长出来的子实体即为柞蚕蛹虫草。柞蚕蛹虫草的药理作用与冬虫夏草相似，主要为镇静、抗炎、降低血清胆固醇、抗氧化、延缓衰老和抑制肿瘤细胞生长等^[11-14]。近年来，有关柞蚕蛹虫草的营养成分分析、生物学特性以及药理学等方面的研究^[15-16]成为热点，但对于柞蚕蛹虫草培育方法的改进和干燥制粉方法的加工鲜有报道。本实验采用的柞蚕蛹虫草为野生北冬虫夏草，经单株分离、纯化，培养成为液体的菌种，接种入病毒率低、脂肪饱满的活柞蚕蛹体中，在近于药品生产质量管理规范(good manufacturing practice，GMP)所规定的车间体系内培育成柞蚕蛹虫草，利用超细粉碎技术制备出粉体均匀、营养成分含量高的柞蚕蛹虫草超微粉。所制备的柞蚕蛹虫草超细粉与天然冬虫夏草粉的化学成分基本一致, 其主要活性成分虫草素、腺苷和多糖水平均高于天然冬虫夏草粉。本研究以小鼠为实验对象，经口给予柞蚕蛹虫草超微粉30 d后，检测小鼠体质量、胸腺/体质量比值、脾脏/体质量比值、刀豆蛋白(ConA)诱导的小鼠淋巴细胞转化能力、迟发型变态反应、抗体生成细胞数和小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力等指标^[17]，探讨柞蚕蛹虫草超微粉是否具有增强小鼠免疫力的作用。

昆明种雄性ICR小鼠40只，清洁级，体质量18~22 g，由吉林大学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK(京)2014-0004。RPMI-1640细胞培养液和ConA均为美国Sigma公司产品，Hank’s液和SA缓冲液为南京森贝伽生物科技有限公司产品，豚鼠血清、绵羊红细胞(SRBC)、鸡红细胞和小牛血清均为广州蕊特生物科技有限公司产品，MTT和琼脂糖为郑州金利生物科技有限公司产品。RT6000型酶联免疫检测仪为深圳市雷杜公司产品，MCO-18AIC二氧化碳培养箱为日本三洋公司产品，37 ℃孵箱为上海光学仪器厂产品，LD4-2型离心机由北京医用离心机厂产品，721分光光度计为上海书培实验设备有限公司产品，ZFJ-2000型中草药粉碎机由广州市元达制药设备有限公司产品，JFM-6J型超细粉碎机为济南健辰机械有限公司产品。

柞蚕蛹虫草由吉林省敦化市蚕业科技发展有限责任公司提供。将新鲜柞蚕蛹虫草洗净，将杂质挑出，用粉碎机粉碎(粗碎，40目)，用热风循环烘箱干燥12h(温度60℃)，干燥后水分控制在2%~3%，干燥后的药粉用超微粉碎机进行超微粉碎至500目，即为柞蚕蛹虫草超微粉。

将40只小鼠随机分为阴性对照组，低、中、高剂量柞蚕蛹虫草超微粉组；每组10只。低、中和高剂量柞蚕蛹虫草超微粉组小鼠给药剂量分别为人体推荐量(2.0 g·60 kg^-1，即0.0333 g·kg^-1)的5倍(0.1665 g·kg^-1)、10倍(0.3333 g·kg^-1)和30倍(0.9999 g·kg^-1)。对照组小鼠用相同方式给予相同体积等量蒸馏水。经口灌胃，每天1次，灌胃容积为0.1 mL·10 g^-1。每3 d称1次体质量，持续给药30 d。

称量各组小鼠体质量，脱颈椎处死小鼠。取其胸腺和脾脏，称量胸腺和脾脏质量，计算脏器指数，脏器指数＝脏器质量/体质量。

在平皿中加入Hank’s液，放入小鼠的脾脏，用镊子将脾脏研磨碎，得到单细胞悬液，整个操作在无菌环境中进行。经200目筛网过滤，洗涤，计数。调整细胞浓度为3×10⁶mL^-1，取1 mL脾细胞悬浮液装入24孔培养板中，每只小鼠分装2孔。其中1孔加入75 μL ConA，另1个对照孔加入75 μL培养液。置于5 % CO₂、37 ℃孵箱中培养72 h。孵育68 h后，去除上清液，每孔去除0.7 mL，滴入0.7 mL RPMI-1640培养液(不含小牛血清)和50 μL MTT，继续培养。终止培养后，加入酸性异丙醇，每孔加入1 mL，混匀，直到无紫色结晶。每孔设3个平行样，分至96孔培养板中。采用酶标仪测定波长570 nm处的吸光度(A)值。记录加入ConA孔和不加入ConA孔的A值。淋巴细胞的转化能力=加入ConA孔的A值—不加入ConA孔的A值。

采用体积分数为2%的SRBC腹腔免疫小鼠，每只注射0.2 mL(约为1×10⁸个SRBC)。第4天时，测量小鼠足跖部厚度(左后)，给每只小鼠注入2% SRBC 20 μL(约为1×10⁸个SRBC)，注射位置为测量位置，注射方式为皮下注射。注射后1 d，再次测量该部位厚度，重复测量3次，取平均值。计算前后测量厚度的差值，用差值反映小鼠迟发型变态反应的水平。小鼠迟发型变态反应的水平=末次注射SRBC后小鼠足跖部厚度－首次注射SRBC后小鼠足跖部厚度。

在5 mL豚鼠血清中加入1 mL压积SRBC，于4℃环境中放置30 min。在该过程中持续振荡，离心取上清分装，置于－70℃保留。使用时以SA缓冲液按1:8的比例稀释，在干净玻片上轻轻刷一层琼脂粉，干燥后保留备用。配制细胞悬浮液时，采用0.9%氯化钠水溶液做溶液将压积SRBC配成体积比为2%。以腹腔注射的方式给每只小鼠接种0.2 mL SRBC。结束前5 d，在平皿内备好Hank’s液，小鼠脱臼取脾脏放入平皿中，磨碎，获得细胞悬液。200目筛网过滤，离心，Hank’s液洗涤2次。将细胞悬浮在5 mL RPMI-1640培养液中，计数。调整细胞浓度为5×10⁶mL^-1，制成脾细胞悬液。加热溶解事先备好的表层培养基，放在水浴中保存，温度控制在45 ℃。与体积相当但浓度为其2倍的Hank’s液(pH 7.2) 混在一起，分装到小试管(每管0.5 mL)。加入50 μL体积比为10%的SRBC(用SA缓冲液配制)和20 μL脾细胞悬液(5×10⁶mL^-1)，急速振荡均匀。缓缓地倒在刷满琼脂糖薄层的玻片上，每个样品同时做2个平行对照。凝固后，置于CO₂培养箱中1.5 h并保持玻片水平的扣在片架上。将SA缓冲液稀释的补体(1:8) 缓缓地滴在玻片槽内，再培养1.5 h，计数溶血空斑数。

采用腹腔注射的方法给每只小鼠注入2%压积羊红细胞0.2 mL。4 d后开始实验，采用颈椎脱臼法处死小鼠，每只小鼠注射加入小牛血清的Hank’s液4 mL，为保证腹腔巨噬细胞能够充分流出，轻轻按摩腹部20次；在腹部的皮肤处剪开1个小口，抽取腹腔洗液2 mL于试管内备用。取0.5 mL洗液，与等量1%鸡红细胞悬液在试管中混匀。取0.5 mL混合液，加入载玻片的琼脂圈内。37 ℃孵育箱孵育20 min，孵育完毕立刻用生理盐水冲掉未贴壁的细胞。在甲醇中固定1 min，采用Giemsa液染色15 min。蒸馏水冲洗干净后，晾干，在40倍显微镜下观察。吞噬率=吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数/计算的巨噬细胞数×100%，吞噬指数=被吞噬的鸡红细胞总数/计算的巨噬细胞数。

采用SPSS 21.0统计软件进行统计学分析。小鼠体质量、脏器指数、小鼠脾淋巴细胞转化实验A值、足跖厚度、溶血空斑数、小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞吞噬率及吞噬指数以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析。以α=0.05为检验水准。

各组小鼠体质量比较差异均无统计学意义(P＞0.05)；各组小鼠脾脏指数比较差异无统计学意义(P＞0.05)；各组小鼠胸腺指数比较差异无统计学意义(P＞0.05)。见表 1。

ConA诱导的各组小鼠淋巴细胞转化能力检测结果显示：低剂量柞蚕蛹虫草超微粉组与阴性对照组加入ConA孔与不加入ConA孔A值的差值比较差异无统计学意义(P＞0.05)，中和高剂量柞蚕蛹虫草超微粉组加入ConA孔与不加入ConA孔A值的差值高于阴性对照组(P＜0.05)，低、中和高剂量柞蚕蛹虫草超微粉组加入ConA孔与不加入ConA孔A值的差值比较差异无统计学意义(P＞0.05)，即经口给予0.3333和0.9999 g·kg^-1柞蚕蛹虫草超微粉的小鼠其淋巴细胞的转化能力高于阴性对照组(P＜0.05)。足跖增厚法检测结果显示：中和高剂量柞蚕蛹虫草超微粉组小鼠足跖厚度差值高于阴性对照组和低剂量柞蚕蛹虫草超微粉组(P＜0.05)；低剂量柞蚕蛹虫草超微粉组与阴性对照组小鼠足跖厚度差值比较差异无统计学意义(P＞0.05)；中和高剂量柞蚕蛹虫草超微粉组小鼠足跖厚度差值比较差异无统计学意义(P＞0.05)。见表 2。

与阴性对照组比较, 低、中和高剂量柞蚕蛹虫草超微粉组小鼠抗体生成细胞数有明显上升趋势(P＜0.05)；低、中和高剂量柞蚕蛹虫草超微粉组间小鼠抗体生成细胞数比较差异无统计学意义(P＞0.05)。见表 3。

与阴性对照组比较，各剂量柞蚕蛹虫草超微粉组小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞的吞噬率和吞噬指数升高(P＜0.05)；低、中和高剂量柞蚕蛹虫草超微粉组间小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞的吞噬率和吞噬指数比较差异无统计学意义(P＞0.05)，实验中3个剂量柞蚕蛹虫草超微粉组小鼠的巨噬细胞吞噬鸡红细胞结果均为阳性。见表 4。

超细粉碎是将原材料加工成微米甚至是纳米级的新型高新粉碎技术。柞蚕蛹虫草粉碎后其超微粉的粉末颗粒大小分布较均匀，比表面积显著提高，能够增加药材中有效成分的溶出速度和溶出量。与食用普通粉碎方法得到的粗粉比较，人体在单位时间内吸收药物有效成分的含量提高，药物释出的有效成分的种类也更多。

细胞免疫、体液免疫和非特异性免疫是机体免疫系统的重要组成部分。细胞免疫的作用机制包括2个方面:① 致敏T淋巴细胞的直接杀伤作用；② 通过淋巴因子相互配合、协同杀伤靶细胞。在抗感染免疫中，细胞免疫主要参与对胞内寄生的病原微生物的免疫应答及对肿瘤细胞的免疫应答，参与迟发型变态反应和自身免疫病的形成，参与移植排斥反应及对体液免疫的调节。因此，淋巴细胞转化能力和迟发型变态反应能够反映细胞免疫功能的强弱。病原微生物入侵机体后, 体液免疫在抗感染和免疫调节等方面起重要作用, 其通过促使机体产生抗体，并与对应的抗原特异性结合，产生各种生物学效应, 所以抗体生成细胞的数量体现了体液免疫功能的强度。单核巨噬细胞的吞噬能力是衡量机体非特异免疫功能的标志之一。当抗原性物质侵入机体后, 可迅速被单核巨噬系统吞噬和清除, 因而巨噬细胞廓清指数可以反映其吞噬功能的强弱^[18]。

本研究采用0.1665、0.3333和0.9999 g·kg^-13种不同剂量柞蚕蛹虫草超微粉对小鼠进行灌胃，干预时间为30 d，测定小鼠的细胞免疫功能、体液免疫功能和非特异性免疫功能，本研究结果显示：3种剂量对小鼠体质量、脾脏指数和胸腺指数均无影响，说明柞蚕蛹虫草超微粉对小鼠免疫器官未造成影响。当柞蚕蛹虫草超微粉剂量为0.3333和0.9999 g·kg^-1时，其能够增强ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化能力以及迟发型变态反应；3种剂量柞蚕蛹虫草超微粉均能使小鼠的抗体生成细胞数和巨噬细胞吞噬鸡红细胞的能力提高。按照《保健食品检验与评价技术规范》的实验结果判定规则中关于“增强免疫力功能”判定标准：在细胞免疫功能、体液免疫功能、单核-巨噬细胞功能和NK细胞活性4个方面中任意2方面结果为阳性即可判定该受试样品具有增强免疫功能作用。柞蚕蛹虫草超微粉在小鼠的细胞免疫、体液免疫和非特异性免疫实验中皆呈阳性结果。

综上所述，柞蚕蛹虫草超微粉对小鼠免疫功能有增强作用。本研究结果为提高柞蚕蛹虫草的利用率、开发新剂型提供了科学依据。