类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是一种以关节滑膜炎症为主要特点的慢性系统性自身免疫性疾病^[1-2], 临床表现为与慢性微炎症反应直接相关的关节肿胀和疼痛，软骨损伤，关节间隙变窄，关节僵直、畸形和功能障碍^[3-4]。发达国家RA年患病率为0.5%~1.0%，在发展中国家为0.05‰~0.50‰^[5]。RA的病因尚不清楚，但是目前认为基因因素可能是其发病的主要原因，例如人类白细胞抗原DR4(human leukocyte antigen-DR4，HLA-DR4) 及其他非HLA基因，包括蛋白酪氨酸磷酸酶、非受体型22和肽基精氨酸脱亚胺酶4 ^[6-7]。Wnt信号通路是细胞增殖分化的关键调控通路之一，与器官和组织的早期发育、肿瘤的发生以及骨代谢等人体多种生理病理过程有密切联系。β-catenin可直接激活Wnt信号通路，此外，β-catenin对基因转录和细胞间黏附有双重调节作用^[8], 并作为钙黏蛋白复合体的组成成分之一，参与细胞极性的胞内信号传导，可间接作用于Wnt信号通路^[9]。Wnt/β-catenin信号通路是经典的Wnt信号传导通路，也是目前研究的最详细和最重要的Wnt信号通路，其可通过影响成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes，FLS)的增殖、调控炎症因子的分泌和调节骨代谢/骨破坏等途径影响RA的病理过程及预后^[10]。

红景天是治疗RA的常用中药，临床疗效确切，探讨红景天治疗RA的机制和作用靶点可为进一步开发该药物及缓解RA患者的症状及体征提供依据。红景天苷为红景天的主要成分之一，由于其在红景天中含量较高，常被用来评价红景天的药用价值。红景天应用于RA的治疗缺乏实验研究，因此其作用机制尚不明确。为揭示红景天苷在分子水平上对RA的影响，本实验以Wnt/β-catenin信号通路为契点，观察红景天苷对肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)诱导的人类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes with rheumatoid arthritis in human，HFLS-RA)的干预效应。

HFLS-RA(北京北纳创联生物技术研究院)。红景天苷标准品(吉林省食品药品检验所)，TNF-α(美国PEPROTECH公司)，MTT(北京鼎国昌盛生物有限公司)，DMSO(美国Sigma公司)，ELISA试剂盒(南京森贝伽生物科技有限公司)，BCA蛋白测定试剂盒(中国碧云天生物有限公司)，抗β-catenin单克隆抗体(Abcam公司)，β-actin抗体(艾美捷科技有限公司)。超净工作台(苏州净化公司)，二氧化碳恒温培养箱(日本SANYO公司)，倒置显微镜XDS-100C型(上海蔡康光学仪器有限公司)，酶标仪RT6000型(美国Rayto公司)，微量振荡器ZW-A型(江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司)，智能高速冷冻离心机(湖南赫西仪器装备有限公司)，电泳仪(美国WEALTEC有限公司)。

细胞随机分为6组。正常对照组：无血清培养基培养细胞；模型对照组：10.0μg·L^-1TNF-α；12.5μmol·L^-1红景天苷组：10.0 μg·L^-1 TNF-α+12.5μ mol·L^-1红景天苷；25.0 μmol·L^-1红景天苷组：10.0 μg·L^-1TNF-α+25.0 μmol·L^-1红景天苷；50.0 μmol·L^-1红景天苷组: 10.0 μg·L^-1TNF-α+ 50.0 μmol·L^-1红景天苷；100.0 μmol·L^-1红景天苷组：10.0 μg·L^-1 TNF-α+100.0 μmol·L^-1红景天苷。

取对数生长期细胞，采用2.5 g·L^-1胰蛋白酶消化细胞，制成浓度为1×10⁴ mL^-1细胞悬液，接种于96孔板，每孔200 μL，置于5% CO₂、37℃恒温箱培养中培养24 h，同步化24 h，药物干预后再培养48 h，弃去上清液，每孔加入浓度为5 g·L^-1MTT20μL，反应4 h，加入150 μL DMSO，于波长490 nm处测吸光度(A)值。细胞增殖活力=实验组A值/正常对照组的A值×100%。

① 收集样品：将HFLS-RA以1×10⁵mL^-1密度接种至6孔板中，细胞达到约80%融合后，同步化24 h，再培养48 h，吸取各组上清液，3 000 r·min^-1离心10 min，分装到无菌管中，置于－20℃保存，避免反复冻融。② 标准品的稀释与加样：在酶标板上设标准孔10孔，在第1和2孔分别加入标准品100 μL，再加入标准品稀释液50μL，混匀；然后从第1和2孔各取100μL分别加入到第3和4孔，同上操作后，从第3和4孔各取50 μL弃掉，再各取50 μL加入到第5和6孔；在第5和6孔加标准品稀释液50 μL标准品稀释液，混匀；第7~10孔操作同第5和6孔，第9和10孔加毕标准品稀释液混匀后，各取50 μL弃掉。③ 加样：分别设空白孔和待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔先加样品稀释液40 μL，再加待测样品10 μL。将样品加于酶标板底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。④ 温育和洗涤：用封板膜封板后置37℃温育30 min。将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释；小心揭去封板膜，弃掉液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30 s后弃去，如此反复洗涤5次，拍干。⑤ 加酶：每孔加入酶标试剂50 μL，空白孔除外。温育和洗涤：同上述④ 和⑤。⑥ 显色：每孔先加入50 μL显色剂A，再加50 μL显色剂B，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15 min。⑦ 终止：每孔加入50 μL终止液，终止反应。⑧ 测定A值：以空白孔调零，450 nm波长处测量各孔的A值。测定应在加终止液15 min内进行。⑨ 计算样品中蛋白表达水平。

① 蛋白提取:胰酶消化制成细胞悬液，转移到离心管中，2 000 r·min^-1离心5 min收集细胞。然后轻轻吸去液体，加入4℃预冷的PBS，轻轻吹打清洗细胞，再按前法离心。重复以上操作2次，共洗涤细胞3次以洗去培养液。每个离心管加入100 μL含PMSF的裂解液，于4℃冰箱裂解30 min(为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动)。裂解完后，于4℃、12 000 r·min^-1离心5 min。② 蛋白变性：在每个离心管中加入等体积的5×SDS上样缓冲液(按照上样缓冲液与蛋白提取液1:4的体积比例)，小心吹打混匀，沸水中加热5 min使蛋白变性，然后将其分装，保存于－20℃冰箱。③ 蛋白浓度测定：具体方法见BCA蛋白浓度测定试剂盒。④ SDS-PAGE电泳：浓缩胶浓度5%，电压80 V、30 min，分离胶浓度12%，电压120 V、100 min。⑤ 转膜：湿转法将蛋白转移到PVDF膜上，条件为70 V、120 min。⑥ 封闭:5%脱脂奶粉室温封闭2h, 用TBST洗膜3次，每次10 min。⑦ 免疫反应：加入β-actin(1:2 000)、β-catenin(1:2 000) 稀释液，4℃冰箱孵育过夜，TBST洗膜，加入二抗(1:2 000)，室温下孵育2 h。⑧ 化学发光、显影、定影:取出膜后洗涤3次，加入超敏ECL发光液并置于暗盒中压片，再将X光片置于显影液和定影液中显色。自来水清洗后晾干，扫描仪扫描成像。⑨ 凝胶图像分析：采用Image J软件对蛋白进行灰度分析。以β-actin作为对照，计算各组β-catenin蛋白的表达水平。蛋白表达水平＝待测蛋白灰度值/β-actin灰度值。

采用SPSS19.0统计软件进行统计学分析。各组HFLS-RA的增殖活力、细胞上清液中β-catenin、MMP-7和Cyclin-D1的表达水平和细胞中β-catenin蛋白的表达水平以x±s表示，多组定量资料的比较采用单因素方差分析，组间均数比较采用LSD法。以α=0.05为检验水准。

设正常对照组HFLS-RA增殖活力为100%，模型对照组细胞增殖活力为(111.40±5.12)%；12.5、25.0、50.0和100.0 μmol·L^-1红景天苷组细胞增殖活力分别为(108.60±4.65)%、(107.21±8.84)%、(105.58± 7.44)%和(104.65±6.51)%。与正常对照组比较，模型对照组细胞增殖活力明显上升(P＜0.05)。与模型对照组比较，12.5和25.0 μmol·L^-1红景天苷组细胞增殖活力虽下降，但差异无统计学意义(P＞0.05)；50.0和100.0 μmol·L^-1红景天苷组细胞增殖活力下降(P＜0.05)。但50.0 μmol·L^-1红景天苷组与100.0μmol·L^-1红景天苷组细胞增殖活力比较差异无统计学意义(P＞0.05)。

与正常对照组比较，模型对照组细胞上清液中β-catenin、MMP-7和Cyclin-D1表达水平明显升高(P＜0.05)。与模型对照组比较，12.5和25.0μmol·L^-1红景天苷组细胞上清液中β-catenin、MMP-7和Cyclin-D1表达水平虽降低，但组间比较差异无统计学意义(P＞0.05)；50.0和100.0μmol·L^-1红景天苷组细胞上清液中β-catenin、MMP-7和Cyclin-D1表达水平明显降低(P＜0.05)。见表 1。

TNF-α作用于HFLS-RA后，β-catenin蛋白表达水平明显升高，用红景天苷再处理后，随着红景天苷浓度的增加，β-catenin蛋白表达水平呈降低趋势，见图 1A。与正常对照组比较，模型对照组细胞中β-catenin蛋白表达水平明显升高(P＜0.01)。与模型对照组比较，12.5和25.0μmol·L^-1红景天苷组细胞中β-catenin蛋白表达水平虽降低，但组间比较差异无统计学意义(P＞0.05)；50.0和100.0μmol·L^-1红景天苷组细胞中β-catenin蛋白表达水平明显降低(P＜0.05)。见图 1B。

Lane 1:Normal control group; Lane 2:Model control group; Lane 3-6:12.5, 25.0, 50.0, and 100.0 μmol·L-1 salidroside groups.*P < 0.01 vs normal control group; △P < 0.05 vs model control group. 图 1 各组HFLS-RA中β-catenin蛋白表达电泳图(A)和相对表达水平(B) Figure 1 Electrophoregram(A)and relative expression levels(B)of β-catenin protein in HFLS-RA in various groups

图选项

红景天为景天科红景天属多年生草本植物, 始载于公元8世纪藏文医籍《月王药珍》, 藏医药经典《四部医典》也有记载，具有润肺、补肾、扶正固本、理气养血、健脑益智和滋补强身的功效。现代研究^[11]表明：红景天具有抗衰老、抗缺氧、抗疲劳、抗病毒、抗肿瘤、保护心肌、均衡调节中枢神经、抗应激和增强机体免疫功能等作用。红景天苷作为其最重要的成分之一，具有类似的生物活性。此外，药理学研究^[12]显示：红景天水和醇提取物属于无毒或低毒制剂。红景天及其制剂为RA的常用药。研究^[13]显示：大株红景天联合益赛普治疗老年性RA时其改善关节疼痛数、关节肿胀数、晨僵时间、双手平均握力、血沉、类风湿因子、C-反应蛋白水平等方面均明显优于单纯注射益赛普。

RA的病理发展受以下因素的影响，如环境、细胞通路的激活、病毒感染、基因、激素和心理状态等^[14]，RA产生的严重并发症、关节破坏甚至功能丧失可导致患者病死率的增加。滑膜组织增生是RA的主要特点之一，尽管滑膜内层组织中出现了炎症细胞的浸润，但是RA患者FLS的增殖和凋亡平衡失调，使FLS不断地“肿瘤样”增生，是造成滑膜组织增生和关节结构破坏的主要原因^[15]。本研究采用TNF-α处理HFLS-RA，给予红景天苷干预结果表明：经TNF-α诱导后，HFLS-RA增殖活力明显升高，随着红景天苷浓度的增加，HFLS-RA增殖活力逐渐降低，红景天苷作用浓度与细胞增殖活力之间存在依赖关系。

研究^[16]显示：RA患者FLS中β-catenin的表达水平升高，激活Wnt信号通路，从而使FLS激活；此外β-catenin在胞核内大量累积，启动了靶基因MMP-7和Cyclin-D1等转录。Cyclin-D1在许多细胞系中可以作为多种转录因子的辅助因子调节细胞由G₁期向S期过渡，进而完成细胞周期及功能。正常细胞中Cyclin-D1受到严格的控制，Cyclin-D1通过与其配体(CDK4) 结合发挥生物学效应，Cyclin-D1过度表达则会缩短G₁期间隔，降低细胞对促细胞分裂剂的依赖性，从而促进细胞增殖。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)广泛存在于各种结缔组织中, 能降解大多数的细胞外基质(excetral cellular matrix，ECM)成分。ECM是维持骨组织结构完整的重要成分，MMPs对ECM的降解是RA患者关节破坏的必要环节。正常情况下, 金属蛋白酶组织抑制剂(tissue inhibitors of MMPs, TIMPs)和MMPs以1:1不可逆结合, 对MMPs起抑制作用, 使ECM始终处于降解速度低于更新速度的状态，调节关节重塑和软骨表型，对骨软骨生长、关节软骨的形成和出生后软骨成熟起着重要调节作用。MMP-7是MMPs家族中重要的成员，缺少其他成员共有的c-末端血红素样结构，对TIMPs几乎不起作用；另外，MMP-7能激活其他成员，有广谱的降解底物作用^[17-18]。本研究结果显示：经TNF-α处理后，HFLS-RA中β-catenin、MMP-7和Cyclin-D1的分泌增加，细胞中β-catenin蛋白的表达水平升高，随着红景天苷浓度的增加，β-catenin、MMP-7和Cyclin-D1的分泌减少，β-catenin蛋白表达水平降低。

综上所述，红景天苷可抑制TNF-α诱导的HFLS-RA增殖，通过调控Wnt/β-catenin信号通路，从而明显下调HFLS-RA中Cyclin-D1和MMP-7的表达水平，这可能是其控制RA的机制之一。本研究结果为红景天治疗RA初步提供了理论依据，但其具体作用机制仍需进一步深入和全面的探索。