2017, Vol. 43扩展功能
文章信息
- 王俊瑞, 段美庆, 额尔德木图, 孙鹏, 魏常梅, 韩艳秋
- WANG Junrui, DUAN Meiqing, Erdemutu, SUN Peng, WEI Changmei, HAN Yanqiu
- 亚抑菌浓度亚胺培南对MRSA体外增殖及毒力相关基因mRNA表达水平的影响
- Effects of sub-inhibitory concentration of imipenem on proliferation in vitro and mRNA expression levels of MRSA virulence related genes
- 吉林大学学报(医学版), 2017, 43(03): 479-484
- Journal of Jilin University (Medicine Edition), 2017, 43(03): 479-484
- 10.13481/j.1671-587x.20170304
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文章历史
- 收稿日期: 2016-09-07
2. 内蒙古医科大学科技处, 内蒙古 呼和浩特 010110;
3. 内蒙古医科大学微生物与免疫研究中心, 内蒙古 呼和浩特 010059
2. Department of Science and Technolgy, Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010110, China;
3. Microbiology and Immunity Research Centre, Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010059, China
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin resistant Staphylococcus aureus, MRSA）是造成住院患者死亡的一个独立危险因素[1-2]。研究[3-4]显示：β-内酰胺类抗生素苯唑西林可对MRSA黏附相关基因、毒力基因和耐药基因的mRNA表达水平产生明显影响，影响效应与受试菌株的耐药性相关。但有关另一种目前临床常用的β内酰胺类抗生素亚胺培南对MRSA的生物学活性影响的报道甚少。亚胺培南主要用于多重耐药革兰阴性菌感染的治疗，如鲍曼不动杆菌和肠杆菌科细菌感染等。但长期住院患者MRSA和多重耐药革兰阴性菌共携带或感染的比例很高[5]。对于这些混合感染患者，如何更好使用亚胺培南进行治疗尤为重要。亚胺培南是否可通过降低MRSA毒力和（或）增殖活性来增强疗效尚未见报道。本研究以住院患者分离的优势克隆株ST239型MRSA[6-7]作为研究对象，探讨2个亚抑菌浓度亚胺培南对MRSA体外增殖及毒力相关基因（fnbA、lukD、lukE、hla、spa和sea）mRNA表达水平的影响。
1 材料与方法 1.1 菌株、主要试剂和仪器选择2012—2014年内蒙古医科大学附属医院住院患者不同部位分离的100株MRSA，菌株由该院检验科微生物室保存。羊血琼脂平板和MH平板购自天津金章科技发展有限公司，Tryptic Soy Broth(TSB)培养基和头孢西丁纸片购自英国Oxiod公司，革兰阳性菌鉴定卡（GP卡）由法国梅里埃公司生产，溶葡萄球菌素（lysostaphin）购自美国Sigma公司，细菌基因组提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司。VITEK-Ⅱ compact全自动微生物鉴定和药敏分析系统购自法国生物梅里埃公司，Sunrise型酶标仪为瑞士Tecan公司产品，Fresco17型低温高速离心机为美国Thermal Fisher公司产品，2720型PCR仪购自美国ABI公司。
1.2 菌株鉴定和药敏试验所有菌株经VITEK-Ⅱ compact全自动微生物鉴定和药敏分析系统及配套革兰阳性菌鉴定卡（GP卡）进行重新鉴定。甲氧西林耐药性采用头孢西丁纸片扩散法进行检测和复核。采用金黄色葡萄球菌ATCC25923作为质控菌株。抑菌圈直径≤21 mm判定为MRSA，抑菌圈直径＞21 mm判定为甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌（MSSA）。
采用微量肉汤稀释法检测100株MRSA对2种碳青霉烯类抗生素（亚胺培南和美罗培南）的体外敏感性。2种药物浓度梯度均设置为0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0、64.0、128.0、256.0和512.0 mg·L-1，共11个浓度。将上述不同浓度抗菌药物溶液分别加到灭菌的96孔聚苯乙烯板中，第1~11孔加入药液，每孔10 μL，第12孔不加药物作为生长对照。复核无误后菌株接种至羊血琼脂平板，35℃培养16~18 h，挑取菌落配置菌悬液浓度至0.5麦氏单位。经MH肉汤1:1 000稀释后，每孔中加入100 μL，密封后置于35℃孵箱中孵育16~20 h判读结果。
1.3 多位点序列分型（MLST）法筛选ST239型MRSA分离株采用MLST法筛选ST239型MRSA分离株。菌株经TSB培养液震荡培养16~18 h后，离心、收集菌体，按照试剂盒说明书提取DNA（北京天根生化科技有限公司）。PCR实验，PCR产物送上海生工生物工程股份有限公司进行测序分析。测序结果经http://saureus.mlst.net/网站进行比对得出菌株ST型[8]。PCR引物序列见表 1。
| Gene | Primer | Sequence(5′-3′) | Size(bp) |
| Carbamate kinase | Up Down |
TTGATTCACCAGCGCGTATTGTC AGGTATCTGCTTCAATCAGCG |
456 |
| Shikimate dehydrogenase | Up Down |
ATCGGAAATCCTATTTCACATTC GGTGTTGTATTAATAACGATATC |
456 |
| Glycerol kinase | Up Down |
CTAGGAACTGCAATCTTAATCC TGGTAAAATCGCATGTCCAATTC |
465 |
| Guanylate kinase | Up Down |
ATCGTTTTATCGGGACCATC TCATTAACTACAACGTAATCGTA |
429 |
| Phosphate acetyltransferase | Up Down |
GTTAAAATCGTATTACCTGAAGG GACCCTTTTGTTGAAAAGCTTAA |
474 |
| Triosephosphate isomerase | Up Down |
TCGTTCATTCTGAACGTCGTGAA TTTGCACCTTCTAACAATTGTAC |
402 |
| Acetyl coenzyme A acetyltransferase | Up Down |
CAGCATACAGGACACCTATTGGC CGTTGAGGAATCGATACTGGAAC |
516 |
选择5株ST239型MRSA菌株检测细菌浊度。5株菌株对亚胺培南的最小抑菌浓度(MIC)值为64 mg·L-1。分别采用2个亚抑菌浓度进行实验，分别为6.4 mg·L-1（1/10MIC）（1/10MIC组）和32 mg·L-1（1/2MIC）（1/2MIC组），并设置不加亚胺培南组作为对照组。
菌株常规复苏，TSB液体培养基中培养16~18 h，6 000 g离心取菌体，用分光光度计（600 nm波长）调整菌液浓度。参照文献[9]，采用TSB培养液调整细菌浓度，并与亚胺培南进行混合，使亚胺培南终浓度分别达到6.4 (1/10MIC)和32 mg·L-1 (1/2MIC)，菌液浊度达到2个麦氏单位。在37℃条件下震荡培养，分别于0、1.5、6.0和12.0 h 4个时间点收集菌液，在分光光度计下检测吸光度（A）值，以A值反映各组菌液的增殖活性。4个培养时间段分别表示MRSA不同生长期增殖情况，0 h为初始浓度，1.5 h表示迟缓期，6.0和12.0 h分别表示对数生长早期和对数生长晚期。
1.5 PCR法检测MRSA毒力基因mRNA相对表达水平5株MRSA菌株按照上述实验流程常规培养不同时间段后，离心、收集菌体, 按照试剂盒（北京天根公司）说明提取总RNA。采用荧光探针法进行实时荧光定量PCR，所需引物及探针见表 2。PCR反应体系:2×Hotstart Fluo-PCR mix 25 μL, Primers(25 μmol·L-1) 1 μL, Probe(25 μmol·L-1) 0.5 μL, 模板(cDNA) 1 μL，用水配至50 μL。PCR扩增条件：94℃、4 min；94℃、20 s，60℃、30 s，共循环40次。目的基因相对表达量计算方法：分别计算3个重复样品目的基因和内参基因平均Ct值，用内参基因对目的基因进行校正，计算出△△Ct，采用2－△△Ct表示目的基因的相对表达水平。△△Ct= △Ct(亚抑菌浓度亚胺培南组)－△Ct(空白组), △Ct=同一实验组中目的基因平均Ct值－内参基因平均Ct值。待检测毒力基因共6个，包括纤维黏连蛋白A（fibronectin A, fnbA）、α溶血素（α-hemoglobin, hla）、葡萄球菌蛋白A（staphylococcal protein A, spa）、白细胞毒素D (leukocidin D, luk-D)、白细胞毒素E（leukocidin E, luk-E）和肠毒素A（staphylococcal enterotoxin A, sea）。
| Primer/probe | Sequence(5′-3′) | Size（bp） |
| hlaF | AACGAAAGGTACCATTGCTGG | |
| hlaR | GCTACTTCATTATCAGGTAGTTGCA | 120 |
| hla probe | FAM+CCTTCTTCGCTATAAACTCTA+MGB | |
| spaF | CATGCAGATGCTAACAAAGCTC | |
| spaR | GCTAATGATAATCCACCAAATACAG | 92 |
| spa probe | FAM+CTGGTGAAGAAAATCCATTC+MGB | |
| LukDF | TTATGAATAATGGTTGGGGACC | |
| LukDR | CAGCATTTGAACTACTTTGTCTACC | 99 |
| LukD probe | FAM+CCCAACATATGGTAATGAAC+MGB | |
| LukEF | ATGCGACTTTATTCCCTAGAACTG | |
| LukER | GTCCTTTCACTTTAATTTCGTGTG | 123 |
| LukE probe | FAM+ATAATGCATTTGTAAATAGAAAC+MGB | |
| fnbAF | ACCGTCAAACGCAACACAAG | |
| fnbAR | CGCTTCTTCCTTAACTACCTCTTC | 118 |
| fnbA probe | FAM+CAAACTGCACAACCAGC+MGB | |
| seaF | CATGATAATAATCGATTGACCGA | |
| seaR | TGCTTGAAGATCCAACTCCTG | 138 |
| sea probe | FAM+CGGTAAACAAAATACAGTACC+MGB | |
| gyrAF | GGTTCAATTCAAATGCGTTCTC | |
| gyrAR | TCATACGAGCCTTATTCACTTGG | 106 |
| gyrA probe | FAM+CGTCAACGTATTGTTGTCA+MGB |
采用SPSS 20.0统计软件进行统计学分析。各组细菌增殖活性和毒力基因相对表达水平以x±s表示，组间比较采用t检验。以α=0.05为检验水准。
2 结果 2.1 100株MRSA对亚胺培南和美罗培南体外敏感性100株MRSA对2种抗生素亚胺培南和美罗培南的MIC值中位数分别为64和32 mg·L-1。见图 1。
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| 图 1 100株MRSA对亚胺培南和美罗培南体外药敏试验结果示意图 Figure 1 Schematic diagram of susceptibility test results of 100 strains of MRSA to imipenem and meropenem in vitro |
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不同浓度亚胺培南作用1.5 h时，MRSA增殖活性未出现明显差异。对照组、1/10MIC组和1/2MIC组MRSA体外增殖活性比较差异均无统计学意义(t=0.489, P=0.645;t=0.346, P=0.744)。不同浓度亚胺培南作用6.0h时，对照组与1/10MIC组MRSA体外增殖活性比较差异无统计学意义(t=0.929，P=0.396)，但对照组与1/2MIC组比较，差异有统计学意义(t=6.716，P=0.001)。不同浓度亚胺培南作用12.0h时，对照组与1/10MIC组MRSA体外增殖活性比较差异无统计学意义(t=0.643，P=0.549);但对照组与1/2MIC组MRSA体外增殖活性比较差异有统计学意义(t=8.640，P=0.000)。见表 3。
| (n=5, x±s) | ||||
| Group | Proliferation activity | |||
| (t/h) | 1.5 | 6.0 | 12.0 | |
| Control | 0.152 9±0.022 2 | 0.555 7±0.022 8 | 0.605 7±0.018 3 | |
| 1/10MIC | 0.159 1±0.020 2 | 0.544 0±0.014 0 | 0.596 0±0.051 0 | |
| 1/2MIC | 0.155 6±0.017 6 | 0.519 4±0.019 2** | 0.547 0±0.008 7* | |
| * P < 0.05 vs control group. | ||||
在培养1.5和6.0 h时，毒力相关基因(fnbA、hlα、spa、lukD、lukE和sea)mRNA相对表达水平均明显下降，且各基因mRNA相对表达水平随亚胺培南浓度的增加而明显降低。见表 4和5。培养12.0 h时，各组MRSA毒力相关基因mRNA表达水平均未检测到，所以未列出检测结果。
| (n=5, x±s) | ||||||
| Group | Expression level | |||||
| hla | spa | lukD | lukE | sea | fnbA | |
| Control | 0.648±0.068 | 0.149±0.024 | 0.382±0.043 | 0.257±0.015 | 0.006±0.002 | 0.037±0.008 |
| 1/10MIC | 0.039±0.057* | 0.076±0.014* | 0.178±0.028* | 0.175±0.026* | 0.008±0.002* | 0.007±0.002* |
| 1/2MIC | 0.108±0.027* | 0.046±0.010* | 0.102±0.022* | 0.123±0.013* | 0±0* | 0±0* |
| * P < 0.05 vs contr ol group. | ||||||
| (n=5, x±s) | ||||||
| Group | Expression level | |||||
| hla | spa | lukD | lukE | sea | fnbA | |
| Control | 1.154±0.108 | 0.236±0.026 | 0.701±0.086 | 0.449±0.037 | 0.011±0.001 | 0.066±0.015 |
| 1/10MIC | 0.286±0.089* | 0.057±0.016* | 0.151±0.046* | 0.130±0.049* | 0±0* | 0±0* |
| 1/2MIC | 0.066±0.017* | 0.026±0.003* | 0.040±0.007* | 0.052±0.006* | 0±0* | 0±0* |
| * P < 0.05 vs control group. | ||||||
本研究选用2个亚抑菌浓度(1/2MIC和1/10MIC)亚胺培南对5株MRSA临床株的毒力相关基因mRNA相对表达水平影响的结果显示：6个毒力相关基因(fnbA、hla、spa、luk-D、luk-E和sea)的mRNA相对表达水平均受到明显抑制。Otto等[3]的研究显示：亚抑菌浓度亚胺培南可明显促进MRSA α溶血素基因的表达，但对其他毒力基因表达水平及增殖活性的影响尚不明确。另一种β内酰胺类抗生素苯唑西林也能改变MRSA毒力相关基因表达水平[9-10]，并能通过降低MRSA毒力，与万古霉素联合使用可明显提高MRSA感染小鼠的生存率[11]。苯唑西林可能作为一种抗MRSA感染的辅助手段用于难治性MRSA感染患者的治疗。本研究所得结果可能为今后更好使用亚胺培南治疗MRSA感染特别是MRSA并发多重耐药革兰阴性菌感染患者提供新的思路。
本文作者同时发现：1/2MIC亚胺培南可对MRSA临床株的体外增殖活性产生抑制效应，这一结果尚未见类似报道。关于亚胺培南对MRSA增殖活性的影响，Cheng等[12]发现：亚胺培南能促进住院患者获得MRSA并能增加患者鼻腔黏膜中MRSA的载量。研究[13-14]显示：亚胺培南具有促进MRSA某些菌体蛋白(如LTA和PG)释放的效应，这2种蛋白成分具有调控细胞分裂的作用，这些成分在菌体周围出现是金黄色葡萄球菌细胞分裂过程启动的一个必须条件。因此，包括亚胺培南在内的β内酰胺类抗生素可能通过促进金黄色葡萄球菌释放LTA和(或)PG进一步促进MRSA的分裂和增殖。但不同研究所得结果不同是否因测试菌株遗传背景差异及抗生素浓度变化所致尚不明确，值得进一步研究。
对β-内酰胺类抗生素调控金黄色葡萄球菌毒力机制的相关研究[15]显示：不同MRSA菌株对环境因素的应答存在明显差异并与其耐药机制有密切关联。院内获得性MRSA株(HA-MRSA)由于高水平表达青霉素结合蛋白2a(penicilin-binding protein 2a，PBP2a)，对其细胞壁结构产生影响，进而减弱其agr群体感应系统对苯唑西林的应答能力，降低多种毒力基因的表达。agr调控系统是目前了解最为清楚的金黄色葡萄球菌双组分调控系统，也是细菌群体感应系统调控研究中研究最深入的一个系统[16-17]。agr调控系统可以通过感应金黄色葡萄球菌生长过程中的细胞密度，在感染人体的不同阶段，针对性调整黏附或侵袭等不同生物学活性。但不同遗传背景MRSA株是否可通过其他机制对β内酰胺类抗生素的刺激产生不同的应答特征尚不明确。本研究不足之处在于所检测的毒力基因只集中于常见金黄色葡萄球菌毒力基因(hla、spa、fnbA、lukD、lukE和sea)，亚抑菌浓度亚胺培南对其他毒力基因表达水平的影响尚需进一步检测和确认。此外，亚抑菌浓度亚胺培南通过活化何种途径或基因表达调控系统调控相关基因的表达来实现其对毒力基因表达的调控有待进一步研究。
综上所述，亚抑菌浓度亚胺培南可明显抑制ST239型MRSA临床分离株多种毒力基因的mRNA表达水平，高浓度亚胺培南也可抑制MRSA体外增殖活性，提示对于MRSA感染患者及MRSA并发多重耐药革兰阴性菌混合感染患者，亚胺培南可能具有更好的临床应用价值，但其体内抗菌活性值得进一步研究。
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