2017, Vol. 43扩展功能
文章信息
- 赵丽晶, 康晶, 安英, 徐博, 王艳春
- ZHAO Lijing, KANG Jing, AN Ying, XU Bo, WANG Yanchun
- 鸢尾黄素对大鼠心肌纤维化的作用及其机制
- Eeffect of tectorigenin on myocardial fibrosis in rats and its mechanism
- 吉林大学学报(医学版), 2017, 43(02): 288-292
- Journal of Jilin University (Medicine Edition), 2017, 43(02): 288-292
- 10.13481/j.1671-587x.20170215
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文章历史
- 收稿日期: 2016-02-25
2. 吉林医药学院教务处, 吉林 吉林 132013
2. Office of Educational Administration, Jilin Medical College, Jilin 132013, China
心肌纤维化 (myocardial fibrosis, MF) 是心肌成纤维细胞等非心肌细胞过度增殖、导致胶原蛋白过量积聚、胶原成分发生改变的一种病理性变化，是各种心脏病的最终结果。临床上许多疾病如缺血性心脏病、高血压等均能导致MF的发生[1]。MF是心室重构的一种主要表现，可引起心肌电生理紊乱、各种心律失常、心肌僵硬、心室舒张收缩功能减退、冠状动脉储备明显下降，甚至引起心源性猝死[2]，因此预防和延缓MF的发生发展是治疗心脏疾病的重要措施。鸢尾黄素又名鸢尾苷元，主要存在于鸢尾科鸢尾属和射干属的植物根茎中，具有抗氧化、雌激素样作用、抗动脉粥样硬化、抗肝纤维化以及抗癌等作用[3-4]。王金凤等[5]发现：鸢尾黄素可使小鼠心肌梗死时心肌细胞的损伤明显减轻，使梗死面积减小，并且使血清天冬氨酸氨基转移酶 (aspartate transaminase, AST) 和乳酸脱氢酶 (lactic dehydrogenase, LDH) 的活性降低，表明鸢尾黄素对缺血心肌具有很好的保护作用。目前关于鸢尾黄素改善MF的研究报道较少。本实验采用异丙肾上腺素 (Iso) 构建大鼠MF模型，观察鸢尾黄素对大鼠MF的抑制作用，并探讨其作用机制。
1 材料与方法 1.1 实验动物和主要试剂Wistar大鼠60只，雌雄各半，体质量180~280 g，由吉林大学基础医学院实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK-2013-005。鸢尾黄素 (上海-林生物科技有限公司, 纯度98%)，卡托普利 (哈药三精制药诺捷有限公司)，Iso (西安仁红生物科技有限公司)，LDH、肌酸激酶 (CK)、超氧化物歧化酶 (SOD) 和丙二醛 (MDA) 试剂盒 (南京建成生物工程公司)，一氧化氮 (NO) 试剂盒 (碧云天试剂公司)，Ⅰ型胶原 (ColⅠ) 和Ⅲ型胶原 (Col Ⅲ) 检测试剂盒 (上海卡努生物科技有限公司)。
1.2 模型建立和给药方法Wistar大鼠60只随机分为6组：正常对照组, Iso模型组 (5 mg·kg-1·d-1)(此药品和剂量在正式实验之前已做过预实验[6-8]), 低、中、高剂量 (25、50、100 mg·kg-1·d-1) 鸢尾黄素组和阳性药卡托普利 (10 mg·kg-1·d-1) 组，每组10只。除正常对照组外，其余各组大鼠均皮下注射Iso，每日1次，连续给药7d。第2天各组大鼠灌胃给药，除正常对照组和模型组给予等剂量蒸馏水外，其余各组大鼠给予相应剂量的药物，连续灌胃给药28 d。
1.3 大鼠心功能测定各组大鼠末次给药后禁食水12h，10%水合氯醛腹腔麻醉 (3 mL·kg-1) 后，分离右侧颈总动脉，行左心室插管术，用BL-420E+生物信号采集处理系统测量大鼠心率 (HR) 和左心室收缩压 (LVSP)。
1.4 心脏质量参数测定腹主动脉取血后取出心脏，剥离血管、心外膜及脂肪组织，用预冷的生理盐水清洗心肌，滤纸吸干后称量全心湿重 (HW) 和左心室湿重 (LVW)，计算心质量指数 (HMI，mg·g-1) 和左心室质量指数 (LVMI，mg·g-1)。
1.5 心肌组织中MDA水平和SOD活性测定取部分心肌组织，研磨制备10%组织匀浆，离心，取上清液。稀释至5%的组织匀浆，采用硫代巴比妥酸法测定MDA水平；稀释至1%心肌组织匀浆，采用黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性 (各项指标检测严格按试剂盒说明操作)。
1.6 血清中ColⅠ、Col Ⅲ和NO水平及LDH、CK活性检测按照ELISA法试剂盒说明，应用酶标仪检测血清中ColⅠ、Col Ⅲ和NO水平以及LDH、CK活性。
1.7 心肌组织HE染色取心尖部心肌组织，用4%多聚甲醛固定48h后，石蜡包埋，切片，经HE染色，光镜下观察心肌组织病理表现。
1.8 统计学分析采用SPSS17.0统计软件进行统计分析。各组大鼠心脏质量参数、HR、LVSP、心肌组织中MDA水平、SOD活性，血清中ColⅠ、Col Ⅲ和NO水平、LDH和CK活性均以x±s表示，组间均数比较采用单因素方差分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 各组大鼠心功能和心质量参数与正常对照组比较，模型组大鼠HR增快 (P < 0.01)，LVSP降低；HMI和LVMI呈现升高趋势 (P < 0.05或P < 0.01)。与模型组比较，各鸢尾黄素组大鼠HR降低 (P < 0.05或P < 0.01)，LVSP升高 (P < 0.05或P < 0.01)，以中和高剂量鸢尾黄素组效果明显，且HMI和LVMI均降低 (P < 0.01)；与模型组比较，卡托普利组大鼠各项指标差异有统计学意义 (P < 0.05或P < 0.01)。见表 1。
| (n=10, x±s) | ||||
| Group | HR (min-1) |
LVSP [(P/mmHg)] |
HMI [wB/(mg·g-1)] |
LVMI [wB/(mg·g-1)] |
| Normal control | 305.13±22.64 | 144.91±7.01 | 4.08±0.56 | 3.36±0.48 |
| Model | 378.75±29.10** | 96.37±15.94** | 9.32±0.53* | 7.34±0.62* |
| Tectorigenin (mg·kg-1) | ||||
| 25 | 347.88±27.67△ | 116.55±20.83△ | 8.63±0.75△ | 5.89±0.48△ |
| 50 | 325.88±29.08△△ | 129.61±12.58△△ | 7.65±0.42△△ | 4.36±0.53△△ |
| 100 | 290.13±35.04△△ | 135.37±9.24△△ | 6.57±0.73△△ | 5.68±0.36△△ |
| Captopril (10 mg·kg-1) | 341.37±45.19△ | 136.36±10.14△△ | 5.09±0.31△△ | 3.87±0.34△△ |
| * P < 0.05, ** P < 0.01 vs normal control group；△P < 0.05, △△P < 0.01 vs model group | ||||
与正常对照组比较，模型组大鼠血清中ColⅠ和Col Ⅲ水平明显升高 (P < 0.01)。与模型组比较，卡托普利组大鼠血清中ColⅠ和Col Ⅲ水平降低 (P < 0.01)；各剂量鸢尾黄素组大鼠血清中ColⅠ和Col Ⅲ水平降低 (P < 0.05或P < 0.01)。见表 2。
| (n=10, x±s) | ||||
| Group | ColⅠ [ρB/(μg·L-1)] |
Col Ⅲ [ρB/(μg·L-1)] |
MDA [mB/ (nmol·mg-1prot)] |
SOD [λB/(U·mg-1prot)] |
| Normal control | 5.92±0.54 | 20.61±1.86 | 3.78±0.45 | 68.25±5.53 |
| Model | 7.27±0.33** | 24.86±1.88** | 8.33±1.24** | 30.32±0.53** |
| Tectorigenin (mg·kg-1) | ||||
| 25 | 6.42±0.71△ | 21.69±2.48△ | 6.89±1.46△ | 32.63±6.25△ |
| 50 | 6.41±0.64△△ | 21.34±1.35△△ | 5.36±0.82△△ | 47.74±2.42△△ |
| 100 | 5.98±0.52△△ | 20.97±1.52△△ | 4.86±0.96△△ | 56.57±2.37△△ |
| Captopril (10 mg·kg-1) | 6.12±0.59△△ | 20.83±1.86△△ | 6.87±0.36△ | 35.09±0.37△ |
| P < 0.05, ** P < 0.01 vs normal control group；△P < 0.05, △△P < 0.01 vs model group. | ||||
与正常对照组比较，模型组大鼠心肌组织中MDA水平升高 (P < 0.01)，SOD活性降低 (P < 0.01)。与模型组比较，卡托普利组大鼠心肌组织中MDA水平降低 (P < 0.05)，SOD活性升高 (P < 0.05)；中和高剂量鸢尾黄素组MDA水平明显下降 (P < 0.01)，SOD活性明显升高 (P < 0.01)。见表 2。
2.4 各组大鼠血清中NO水平和LDH及CK活性与正常对照组比较，模型组NO水平明显降低 (P < 0.01)，而LDH和CK活性明显增加 (P < 0.01)。与模型组比较，各剂量鸢尾黄素组NO水平明显升高 (P < 0.05或P < 0.01)，CK活性明显降低 (P < 0.01)；中和高剂量组大鼠血清中LDH活性明显降低 (P < 0.01)。见表 3。
| (n=10, x±s) | |||
| Group | NO[cB/(μmol·L-1)] | LDH[λB/(U·L-1)] | CK[λB/(U·L-1)] |
| Normal control | 20.25±5.53 | 258.14±0.45 | 127.00±25.46 |
| Model | 3.32±0.53** | 795.11±1.24** | 454.73±17.83** |
| Tectorigenin (mg·kg-1) | |||
| 25 | 6.63±6.25△ | 739.14±1.46 | 361.34±45.35△ |
| 50 | 16.74±2.42△△ | 466.81±0.82△△ | 284.14±27.69△△ |
| 100 | 18.57±2.37△△ | 424.54±0.96△△ | 203.28±56.13△△ |
| Captopril (10 mg·kg-1) | 8.09±0.37△ | 587.32±0.36△ | 307.38±16.06△ |
| ** P < 0.01 vs normal control group；△P < 0.05, △△P < 0.01 vs model group. | |||
正常对照组大鼠心肌细胞之间界限清楚，横纹清晰可见，胞核结构明显，心肌纤维排列整齐而心肌间质无炎性细胞浸润；模型组大鼠心肌组织结构损伤严重，表现为肌纤维排列紊乱，胞核肿胀聚积，间质出现大量炎性细胞浸润，可见局灶性坏死区域；低剂量鸢尾黄素组和卡托普利组大鼠心肌细胞排列略整齐，胞膜尚完整，可见炎性细胞浸润。中和高剂量鸢尾黄素组大鼠细胞间排列整齐，横纹尚清晰，无炎性细胞，Iso引起的心肌损伤明显减轻。见图 1(插页三)。
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| A:Normal control group; B:Model group; C:Captopril group; D-F:Low, middle, and high doses of Tectorigenin groups. 图 1 各组大鼠心肌组织病理学变化 (HE，×100) Figure 1 Pathological changes of myocardium tissue of rats in various groups (HE, ×100) |
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心脏主要由心肌细胞、心肌成纤维细胞以及细胞外基质 (ECM) 等构成，主要以心肌成纤维细胞为主，占大多数。当各种因素 (生理或病理) 刺激心肌成纤维细胞，使其大量增殖、合成和分泌基质蛋白、ColⅠ和Col Ⅲ，使ECM结构遭到破坏，这种结果又促进心肌成纤维细胞进一步活化、增殖、修复损伤的心肌细胞，当这种修复过度过强时，胶原合成显著增加[9]，将引起MF。本研究采用皮下多点注射Iso诱发建立大鼠MF模型，检测显示HMI和LVMI明显增加，血清中ColⅠ和Col Ⅲ水平显著升高，与正常对照组比较差异具有统计学意义，表明MF模型成立。在复制模型的同时给予低、中、高剂量鸢尾黄素和卡托普利，观察显示治疗组和卡托普利组大鼠HMI和LVMI显著降低，血清中ColⅠ和Col Ⅲ水平明显下降，说明鸢尾黄素具有抑制MF作用。
本研究结果显示：与正常对照组比较，模型组大鼠烦躁、易激惹、HR明显加快、LVSP降低，结合症状和体征可知大鼠处于心力衰竭的代偿期，病理观察显示发生了MF。鸢尾黄素给药后，大鼠易激惹等症状消失，HR降低到接近正常，同时LVSP升高，以中和高剂量组效果明显，表明大鼠给予鸢尾黄素后症状缓解，心功能基本恢复正常，与病理结果显示相符合，表明鸢尾黄素对MF具有明显的改善作用。
大量氧自由基生成及脂质过氧化反应是促进MF发展的重要因素。SOD是氧自由基的特异性降解酶，其活性变化直接反映氧自由基的生成情况。MF导致氧自由基生成增加、SOD活性降低，引起氧自由基大量堆积，对心肌细胞膜产生脂质过氧化作用[10]。而MDA是脂质过氧化产物，其水平高低可直接反映心肌细胞膜过氧化的速度，在一定程度上可间接反应心肌损伤情况[11]。通过对脂质过氧化产物MDA水平的测定以及清除氧自由基重要酶SOD活性的检测得知：与正常对照组比较，模型组MDA水平升高、SOD活性明显下降，表明模型组大鼠心肌损伤严重；与模型组比较，鸢尾黄素组心肌组织中MDA水平降低而SOD活性升高，中和高剂量组效果明显。LDH和CK是临床诊断心血管疾病的2个重要的心肌酶，此2种酶可作为心肌缺血缺氧性损伤的参考指标，当心肌损伤时，其释放入血液中，酶活性增加[12-13]。本研究结果显示：模型组大鼠血清中LDH和CK活性显著高于正常对照组，说明出现心肌损伤；与模型组比较，鸢尾黄素组LDH和CK的活性明显降低，说明鸢尾黄素对缺血心肌具有改善作用。NO是一种重要的免疫和炎性介质，血管内皮细胞产生的NO渗透出细胞膜扩散进入平滑肌细胞，使平滑肌细胞松弛，扩张血管和抑制内皮细胞增殖等多种生理功能。在心血管系统中，NO通过抑制心肌细胞凋亡、阻止心室肥厚的发生、调节血压和改善血管内皮功能等作用[14-15]，改善心肌供血。同时NO能呈剂量依赖性抑制心肌细胞内胶原的合成，使ColⅠ和Col Ⅲ基因的表达减弱[16]。本研究结果显示：与正常组对照组比较，模型组大鼠NO水平降低；与模型组比较，鸢尾黄素组NO水平升高，说明鸢尾黄素可通过调节NO的水平从而对心肌损伤发挥保护作用。
综上所述，鸢尾黄素对Iso导致大鼠MF有明显的改善作用，其主要通过改善心功能，降低MDA水平、LDH和CK活性，提高SOD活性和NO水平，从而对心肌损伤起到延缓和保护作用，以预防和减慢MF的发生发展。其作用机制可能与其抗氧化损伤、清除氧自由基、扩张血管和减少胶原的生成等因素有关。
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