美国癌症学会的统计结果^[1]显示：每年约有120万女性被新诊断为乳腺癌, 其发病率居女性所有恶性肿瘤的首位, 死亡率也在逐年升高, 全世界每年有近50万名患者死于乳腺癌。大约10%乳腺癌患者为ER/PR+ HER-2+，70%为ER/PR+ HER-2-，仅7%为ER/PR-HER-2+，而其余13%由于癌细胞表面无任何受体被称为三阴性乳腺癌^[2]。由此可见，超过70%的乳腺癌患者为激素受体阳性，其通常有一个更有利的临床行为、预后以及复发模式，因此能够从内分泌治疗中获益^[3]。他莫昔芬 (tamoxifen, TAM) 主要通过与体内的雌激素竞争乳腺癌细胞 (breast cancer cells，BCC) 的雌激素受体 (estrogen receptor，ER) 而达到抑制肿瘤细胞生长的目的^[4]。TAM于1971年被首次应用于临床，1978年又经美国FDA批准应用，尽管这期间有新药不断问世，但由于其疗效肯定且经济，已被美国国家癌症网络 (National Comprehensive Cancer Network，NCCN) 指南推荐为用于绝经前乳腺癌患者辅助性内分泌治疗的药物^[5]。自然杀伤细胞 (natural killer cells，NK细胞) 作为先天性免疫系统的重要组成部分，是机体抗肿瘤、抗感染及清除非己细胞的第1道防线。NK细胞发挥作用不需要肿瘤特异性抗原识别，能够直接杀伤肿瘤细胞，进而发挥抗肿瘤作用。本研究为系列实验的一部分，前期的相关实验^[6-8]已经证实NK细胞联合表阿霉素及曲妥珠单抗体外均能够协同杀伤乳腺癌细胞，而NK细胞与TAM是否存在协同作用尚未见文献报道。本研究观察NK细胞与TAM联合对BCC是否存在协同杀伤作用，并初步探讨其作用机制。

人乳腺癌细胞系和NK细胞来自吉林大学第一医院肿瘤中心实验室，选用受体表达情况不同的3种乳腺癌细胞系，即ER+、PR+、HER-2-乳腺癌细胞系MCF-7，ER+、PR+、HER-2+乳腺癌细胞系BT-474，ER-、PR-、HER-2-乳腺癌细胞系MDA-MB-231。BCC贴壁培养于含10%胎牛血清的DMEM-F12高糖培养液中，置于5%CO₂饱和湿度的37℃培养箱中；当细胞生长密度达75%时传代1次，取对数生长期细胞用于实验。NK细胞取培养至第14天的细胞用于实验。

TAM (美国Sigma公司)，以DMSO溶解配制成浓度40 mmol·L^-1的母液，并分装避光保存于-20℃冰箱。钙黄绿素-AM染色液 (上海东仁化学科技有限公司)，以DMSO溶解成浓度1 mmol·L^-1的母液，分装避光保存于-20℃冰箱; 肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α) 和干扰素γ(interferon-γ, IFN-γ) ELISA试剂盒 (武汉博士的生物有限公司)，4℃冰箱避光保存; 流式抗体 (BD Pharmingen及R & D system)，4℃冰箱避光保存。

MTT法检测分组：设置空白对照组和各浓度/时间梯度实验组 (终浓度分别为1.25、2.50、5.00、10.00和20.00 μmol·L^-1，作用时间分别为8、16、24和48 h)。取对数生长的3种BCC接种于96孔板，贴壁后实验组分别加相应浓度梯度TAM，空白对照组则加入等体积培养液。培养相应时间后，每孔加入MTT 20 μL，继续培养4 h后吸取MTT，每孔加入DMSO溶液150 μL，自动酶标仪于570 nm波长处检测各组吸光度 (A) 值, 计算细胞增殖抑制率。每组设置6个复孔，重复3次。细胞增殖抑制率=[1-(实验组A值-空白对照组A值)/空白对照组A值]×100%。

钙黄绿素-AM释放法检测分组：共5组，即自然释放组 (空白对照)、最大释放组 (加Triton-X100)、TAM组 (终浓度5 μmol·L^-1)、NK细胞组和联合实验组 (BCC+NK细胞+TAM)，其中联合组有3种不同效靶比，即3:1、10:1和30:1。BCC经钙黄绿素-AM染色液染色后，接种于96孔板中，根据上述分组加入TAM和NK细胞，培养箱中共培养4h后，离心吸取每孔100μL细胞上清置于另一块新96孔板中，自动酶标仪检测各孔A值，计算细胞杀伤率。每组设置6个复孔，重复3次。细胞杀伤率=[(实验组A值-自然释放组A值)/(最大释放组A值-自然释放组A值)]×100%。

ELISA检测分组：共4组，即空白对照组 (NK细胞)、NK细胞+TAM组、NK细胞+BCC组、联合实验组 (BCC+NK细胞+TAM)，其中效靶比为1:1，TAM终浓度为5 μmol·L^-1。取对数生长的靶细胞接种于96孔板，相应组加入终浓度5 μmol·L^-1的TAM和NK细胞，共培养24h后，离心收集上清行ELISA检测。实验步骤按照ELISA试剂盒说明书操作，每次实验均做出标准曲线，计算每组对应细胞因子浓度。

流式细胞术检测分组：由于抑制性受体和活化性受体表达于NK细胞表面，所以实验分为空白对照组 (NK细胞)、NK细胞+TAM组、NK细胞+BCC组和联合实验组 (NK细胞+BCC+TAM)；活化性配体则表达于乳腺癌细胞表面，所以实验分为空白对照组 (BCC)、BCC+TAM组、BCC+NK组和联合实验组 (BCC+NK细胞+TAM)。将细胞接种于6孔板中，效靶比为1:1，TAM终浓度为5 μmol·L^-1，培养24 h后，收集细胞行流式抗体染色，上机检测。每组均设置6个复孔，重复3次。实验结果使用Flowjo 7.6.1软件处理后进行统计分析。

采用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析。各组实验数据以x±s表示，组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析，组内两两比较采用Dunnett-t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

TAM在低浓度时对3种细胞的抑制作用比较弱，当浓度≥5 μmol·L^-1时，增殖抑制作用明显增加, 并且细胞系间差异也明显增大。20 μmol·L^-1TAM作用24 h后，MCF-7细胞增殖抑制率为 (54.73±2.47)%，BT-474细胞增殖抑制率为 (50.83±1.57)%，MDA-MB-231细胞增殖抑制率为 (26.26±1.58)%。不同浓度TAM作用不同时间后，3种BCC的增殖抑制率明显升高，具有时间和浓度依赖性 (P < 0.05)。见图 1。

A:MCF-7;B:BT-474;C:MDA-MB-231. 图 1 不同浓度TAM作用不同时间后3种BCC的增殖抑制率 Figure 1 Inhibitory rates of proliferation of three kinds of BCC after trated with different concentrations of TAM for different time

图选项

实验中选择TAM终浓度5 μmol·L^-1作为最终作用浓度。随着效靶比的增加，NK组较TAM组BCC杀伤率明显升高，差异具有统计学意义 (P < 0.01)；且NK细胞与TAM联合组BCC杀伤率均明显高于NK细胞组和TAM组 (P < 0.01)。见表 1。

ELISA检测结果：与空白对照组比较，各实验组无论有无BCC存在，NK细胞中TNF-α和IFN-γ水平均不同程度升高 (P < 0.05或P < 0.01)；并且与TAM联合后，TNF-α和IFN-γ水平明显升高，组间比较差异具有统计学意义 (P < 0.01)。见表 2。

与空白对照组比较，NK细胞+TAM组、NK细胞+BCC组和联合实验组NK细胞中NKp46表达水平均升高，组间比较差异有统计学意义 (P < 0.05)。见图 2。

图 2 各组NK细胞中活化性受体NKp46表达流式细胞图 (A) 和条形图 (B) Figure 2 Flow cytometry figure (A) and histogram (B) of expressions of activating receptor NKp46 in NK cells in various groups

图选项

与BCC组比较，各联合实验组BCC中MICA和ULBP1表达水平均明显升高 (P < 0.05或P < 0.01)，而ULBP2升高程度相对较小，但组间比较差异仍有统计学意义 (P < 0.05或P < 0.01)。见图 3。

A:MICA; B:ULBP1;C:ULBP2.*P < 0.05, **P < 0.01 vs BCC group. 图 3 各组BCC中活化性配体表达水平 Figure 3 Expression levels of activating ligands in BCC in various groups

图选项

与空白对照组比较，NK细胞+TAM组NK细胞中D158a、CD158b、CD158b2和CD158e表达水平下降，组间比较差异有统计学意义 (P < 0.05或P < 0.01);与空白对照组比较，各联合实验组抑制性受体表达水平均明显下降 (P < 0.01)。见表 3。

乳腺癌被认为是目前全球女性最常见的恶性肿瘤之一, 也是发展中国家居首位死亡原因的恶性肿瘤, 严重影响着女性的健康^[5]。TAM作为一种选择性雌激素受体调节剂 (selective estrogen receptor molecular，SERM), 是激素受体阳性乳腺癌患者内分泌治疗的首选药物^[9]。TAM不仅能够改善患者预后及延长生存期，而且由于其副作用相对较轻、费用较低等优势，使其被广泛应用于各期乳腺癌的治疗及乳腺癌高危人群的预防^[10]。TAM作用机制主要是通过与ER竞争性结合形成稳定的复合物，阻断雌激素与受体结合，进而阻断雌激素的生物学效应，从而抑制肿瘤细胞的增殖，使肿瘤细胞停滞于G₁期，减少S期细胞比例^[4]。

本研究结果显示：TAM对ER+及ER-BCC均有不同程度的生长抑制作用，并且存在明显的时间及浓度依赖性。上述结果与Samali等^[11]研究结果相一致，TAM能够诱导BCC凋亡, 较小剂量时就能诱导ER+细胞凋亡，而诱导ER-细胞的凋亡则需要较大剂量。随着浓度增加及作用时间的延长，TAM对3种BCC的抑制作用也相对增强。在相同浓度TAM作用下，ER+BCC的抑制作用远远强于ER-细胞。且2种ER+的细胞系对TAM的敏感性也存在差异，这可能由于HER-2通路与雌激素通路存在相互影响有关^[12]。大量临床试验^[13-15]也已证实：无论早期或者晚期乳腺癌患者的内分泌治疗，激素受体阳性伴HER-2+相较于伴HER-2-患者存在治疗抵抗。这在一定程度上也说明:HER-2的表达影响乳腺癌内分泌治疗的预后。

最近几年随着分子生物学及免疫学的发展，生物免疫治疗已经越来越受到人们的关注。免疫治疗也被陆续应用于肿瘤的治疗中，其中研究较多的为NK细胞。特别是NK细胞新受体的发现, 使得对其研究重新成为热点, 既往研究^[16-18]显示：NK细胞的活化主要是活化性受体和抑制性受体双重作用的结果。NK细胞作为人体免疫细胞之一，其不同于B细胞及T细胞，不需要体细胞基因重组产生高度特异受体而能够直接识别靶细胞。成熟的NK细胞中储备了大量富含穿孔素及颗粒酶的细胞毒颗粒，同时还储备了大量在受到刺激时能够翻译INF-γ的信使RNA^[19]。闫振北等^[20]发现：在人体内TAM能够促进白细胞介素2(interleukin-2, IL-2) 的生成，提高一些机体免疫细胞 (如NK细胞、巨噬细胞等) 的细胞毒作用，进而诱导癌细胞凋亡。与此同时，一些临床研究^[21]也肯定了IL-2激活的免疫细胞的治疗作用，研究者给转移癌患者输入IL-2激活的NK细胞或输入在体外经过扩增的自身或供者来源的NK细胞, 能够达到治疗肿瘤的目的。

前期实验^[6-8]已经证实：NK细胞联合表阿霉素及曲妥珠单抗体外均能够协同杀伤BCC。本研究为了探讨NK细胞与TAM联合对BCC的杀伤是否存在协同作用，采用钙黄绿素-AM释放法检测，结果显示：在TAM浓度为5 μmol·L^-1时，随着效靶比的增加，NK组与TAM组比较杀伤率明显升高; 并且各联合组的杀伤率均明显高于NK组及单用TAM组，说明两者存在协同杀伤作用。两者协同作用机制：第一，在有或无靶细胞存在的情况下，TAM均能够增加NK细胞分泌TNF-α和IFN-γ水平。与空白对照组比较，各实验组无论有无BCC存在，NK细胞分泌2种细胞因子的水平均存在不同程度升高，联合TAM组TNF-α和IFN-γ水平明显升高。TAM作用后TNF-α水平升高程度大于IFN-γ。研究者^[22-23]发现：IFN-γ与TAM联合作用时对ER+的BCC和ER-的BCC均具有协同抗增殖作用, 而且IFN-γ能增强TAM的抗肿瘤作用，其作用机制是通过影响细胞周期和诱导细胞凋亡。第二，在联合作用下，TAM能够明显上调NK细胞表达活化性受体NKp46及BCC表达NK细胞活化性配体MICA、ULBP1和ULBP2的水平，同时下调NK细胞表达抑制性受体CD158a、CD158b、CD158b2和CD158e的水平。与NK细胞组比较，联合实验组NK细胞活化性受体NKp46的表达水平升高，且各联合实验组BCC中MICA、ULBP1和ULBP2表达水平较NK组明显升高；且在3种乳腺癌细胞系中，MCF-7及BT-474增加程度明显大于MDA-MB-231。与空白对照组比较，NK细胞+TAM组NK细胞中抑制性受体表达水平下降；与空白对照组比较各联合实验组抑制性受体表达水平均明显降低。

综上所述，本文作者推测TAM作用后刺激NK细胞分泌更多TNF-α和IFN-γ，同时增加NK细胞活化性受配体并降低其抑制性受体的表达水平，进而使得NK细胞活化性受体与活化性配体结合增多，活化信号增强，使其活化增多，最终增强其对人BCC的杀伤能力。