2017, Vol. 43扩展功能
文章信息
- 杨耀群, 谢淑丽, 吕国悦, 马强, 李开良, 王广义
- YANG Yaoqun, XIE Shuli, LYU Guoyue, MA Qiang, LI Kailiang, WANG Guangyi
- 肝癌SMMC7721细胞株P27RF-Rho mRNA基因沉默对5-Fu药物敏感性的影响
- Influence of P27RF-RhO mRNA gene silencing in drug sensitivity of 5-fluorouracil in liver cancer SMMC7721 cell line
- 吉林大学学报(医学版), 2017, 43(02): 271-275
- Journal of Jilin University (Medicine Edition), 2017, 43(02): 271-275
- 10.13481/j.1671-587x.20170212
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文章历史
- 收稿日期: 2016-08-30
原发性肝细胞肝癌 (肝癌)(hepatic cell carcinoma，HCC) 是外科常见病、多发病，其病死率占恶性肿瘤的第2位，目前手术切除仍是根治肝癌的最佳方法[1]。但是由于肝癌具有极强的侵袭转移等恶性生物学行为，即使获得根治性切除，术后常发生转移及复发[2]。常规化疗，患者预后亦不很满意，因此寻找抑制术后复发转移的方法极其重要。5-氟脲嘧啶 (5-fluorouracil，5-Fu) 作为一种抗癌化疗药物，在肝切除术前术后均有广泛应用。5-Fu是一种常用的抗代谢药物，5-Fu在细胞内转变成5-氟脲嘧啶脱氧核苷酸 (5-FdUMP), 而抑制脱氧胸苷酸合成酶 (TS)，阻止脱氧脲苷酸 (dUMP) 甲基转化为脱氧胸苷酸 (dTMP)，从而影响DNA合成, 或在体内变成5-氟脲嘧啶核苷 (5-FuR) 以伪代谢物形式掺入RNA, 影响蛋白质的合成[3]。Rho即Ras相似物 (Ras homologue), 与Ras家族同属小G蛋白超家族成员, 主要包括Rho、Rac和cdc42 3个亚家族, 在细胞信号传导中具有重要的功能。目前Rho研究比较广泛的是RhoA和RhoC，两者在肿瘤发生发展过程中起重要作用[4]。5-Fu是一种重要的肝癌化疗药物，但是长期大量使用不良反应较大，并且有效剂量与中毒剂量接近，限制了其使用，因此寻找一种很好的化疗辅助用药显得格外重要[5]。本文作者应用病毒介导肝癌SMMC7721细胞P27RF-Rho基因沉默联合5-Fu，观察P27RF-Rho是否能够增强5-Fu对肝癌的杀伤效果，旨在为临床晚期肝癌的治疗提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 细胞、主要试剂和仪器肝癌SMMC7721细胞株由吉林大学第一医院肝胆外科实验室保存，P27RF-Rho RNAi慢病毒及Scramble慢病毒由本实验室谢淑丽老师构建并赠送，各种抗体购于美国Santa Cruz公司。紫外分光光度计 (上海光学仪器厂)，CO2孵箱 (日本SANYO公司), Transwell小室 (美国Sigma公司)。
1.2 SMMC7721细胞分组和慢病毒感染实验细胞分为Scramble-siRNA阴性对照组、5-Fu组、P27RF-Rho-siRNA组和P27RF-Rho siRNA+5-Fu组。实验所用SMMC7721细胞用含10%胎牛血清、1%双抗的细胞H-DMEM培养液，于37℃、5%CO2的孵育箱培养。取对数生长期的SMMC7721细胞以每孔4×105细胞接种于6孔板中，待细胞平铺6孔板底面积为80%~90%时，按实验设计的分组分别加入RNAi慢病毒进行细胞感染，待细胞感染36~48 h后观察绿色荧光表达，并进行后续实验。
1.3 Western blotting法检测P27RF-Rho基因沉默效果及肝癌相关蛋白表达水平刮板收集6孔板中细胞于1.5 mL EP管中，加入RIPA裂解液及蛋白酶抑制剂——苯甲基磺酰氟 (phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)，冰上孵育30 min，不断吹打，使细胞裂解彻底。然后置于低温离心机中，4℃、2 000 r·min-1离心30 min，将上清移至1个新的1.5 mL EP管中，用BCA法测定蛋白浓度，并分装。根据蛋白浓度，取相应体积的30 μg蛋白质样品，与5倍稀释的溴酚蓝上样缓冲液4:1混合，沸水浴煮5 min，行12%SDS-PAGE电泳。电泳完毕后，PAGE胶上的目的蛋白用Bio-Rad电转仪移至PVDF膜上。取出聚偏二氟乙烯 (polyvinylidene fluoride，PVDF) 膜用20 mL封闭液 (含5%脱脂奶粉的TBST溶液) 封闭20 min，弃去封闭液，加入一抗 (1:1 000稀释)4℃孵育过夜，取出过夜PVDF膜，20 mL TBST震荡洗膜3次，每次5 min，再加入二抗孵育2 h，TBST洗膜，方法同上。PVDF膜稍干后，将化学发光试剂 (ECL) 均匀涂抹于PVDF膜上表面，作用约1 min后迅速置于暗箱内曝光，曝光1 min后显影并拍照记录，β-actin为内参照。检测各组细胞中RhoC蛋白及P27蛋白表达，并以Image J图像处理软件进行蛋白条带灰度分析，以β-actin灰度值为分母，所测蛋白灰度值为分子，比值越大则相应蛋白表达水平越高。
1.4 MTT法检测各组细胞生长按以上实验分组，以3×104mL-1的细胞浓度接种于96孔板中，每孔接种200 μL细胞悬液，每组设3个复孔。共铺7块板，并置于孵箱中培养，慢病毒感染细胞及加药后24h起，每天随机取出一块板，MTT法检测各孔细胞吸光度 (A) 值, 取各组平均值。连续7d，绘制生长曲线，比较各组间每天的A值。
1.5 划痕实验检测细胞迁移能力胰酶消化各实验组细胞，弃去胰酶，用含10%胎牛血清、1%双抗的细胞H-DMEM培养液将细胞吹打成细胞悬液，细胞计数，于96孔板中按每孔2×104个细胞加入上述细胞悬液，待细胞生长铺满96孔板底表面时，用10 μL移液枪头在孔板底部按从上到下划“一”字形划痕。分别于划痕后0和24h观察不同实验组划痕区细胞的迁移情况，并进行比对和测量。
1.6 体外Transwell小室侵袭实验检测实验细胞侵袭能力铺胶：将Matrigel胶按1:1稀释后，每个小室底部均匀涂布30 μL，室温风干20 min。将上述6孔板中4组细胞用胰酶处理，制成细胞悬液，离心，弃去上清，加1 mL无血清培养液吹打，制备细胞悬液。上述细胞悬液200 μL，以3×105 mL-1的细胞浓度接种到上室中，下室加入500 μL含10%胎牛血清、1%双抗的细胞H-DMEM培养液，37℃、5%CO2条件下培养24 h。用棉签擦去小室上层的细胞及胶，并用无菌PBS冲洗2~3次，4%多聚甲醛固定20 min，0.1%龙胆紫染色30 min，蒸馏水冲洗小室下表面2~3次，风干，每组小室在显微镜下选取5个视野并拍照，计数，取平均值。
1.7 统计学分析应用SPSS13.0统计软件进行统计学分析。各组细胞中P27RF-Rho、P27和RhoC相对表达水平，Transwell细胞穿膜数和生长曲线相应A值以x±s表示；组间样本均数比较采用t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 病毒包装后感染SMMC 7721细胞的效果慢病毒感染SMMC7721细胞48h后，荧光显微镜下观察细胞转染效果并拍照，阴性质粒对照Scramble-siRNA组和P27RF-Rho siRNA组细胞出现明显的绿色荧光蛋白表达，病毒转染效果良好。见图 1(插页三)。
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| A:Scramble RNAi; B:P27RF-Rho RNAi. 图 1 荧光显微镜检测基因沉默效果 Figure 1 Effect of gene silencing detected by fluorescence microscope |
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5-Fu组、Scramble-siRNA组和P27RF-Rho-siRNA组P27RF-Rho蛋白表达水平分别为0.879±0.150、0.906±0.120和0.476±0.170，P27RF-Rho-siRNA组P27RF-Rho蛋白表达水平明显低于其他2组，差异有统计学意义 (P < 0.05)。5-Fu组与Scramble-siRNA组P27RF-Rho蛋白表达水平比较差异无统计学意义 (P > 0.05)。见图 2。
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| Lane 1:5-Fu group; Lane 2:Scramble-siRNA group; Lane 3:P27RF-Rho siRNA group. 图 2 Western blotting法检测基因沉默效果 Figure 2 Gene silencing effect detected by Western blotting method |
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P27RF-Rho siRNA+5-Fu组P27蛋白表达水平 (0.849±0.140) 明显高于5-Fu组、P27RF-Rho siRNA组和Scramble-siRNA组 (0.614±0.130、0.621±0.160和0.340±0.090，P < 0.05)。与5-Fu组、P27RF-Rho siRNA组和Scramble-siRNA组 (0.519±0.230、0.516±0.170和0.818±0.110) 比较，P27RF-Rho siRNA+5-Fu组RhoC蛋白表达水平 (0.206±0.110) 明显降低 (P < 0.05)。5-Fu组与P27RF-Rho siRNA组P27、RhoC蛋白表达水平比较差异无统计学意义 (P > 0.05)。见图 3和表 1。
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| Lane 1:Scramble-siRNA group; Lane 2: 5-Fu group; Lane 3:P27RF-Rho siRNA group; Lane 4: P27RF-Rho siRNA+5-Fu group. 图 3 各组细胞中P27和RhoC蛋白表达电泳图 Figure 3 Electrophoregram of expressions of P27 and RhoC in cells in various groups |
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| (n=3, x±s) | ||
| Group | P27 | RhoC |
| Scramble-siRNA | 0.34±0.09 | 0.818±0.11 |
| 5-Fu | 0.614±0.13 | 0.519±0.08 |
| P27RF-Rho siRNA | 0.621±0.16 | 0.516±0.12 |
| P27RF-Rho siRNA+5-Fu | 0.849±0.14*△# | 0.206±0.11*△# |
| *P < 0.05 compared with Scramble-siRNA group; △P < 0.05 compared with 5-Fu group; #P < 0.05 compared with P27RF-Rho siRNA group. | ||
实验前2d，各组细胞生长速度无明显差异; 第3天开始，P27RF-Rho siRNA+5-Fu组细胞生长速度 (0.437±0.070) 逐渐低于5-Fu组、P27RF-Rho siRNA和Scramble-siRNA组; 第4天P27RF-Rho siRNA+5-Fu组细胞生长速度明显低于其他3组 (0.646±0.100、0.634±0.090和0.997±0.050)，组间比较差异有统计学意义 (P < 0.05)；第5~7天P27RF-Rho siRNA+5-Fu组细胞生长速度明显低于5-Fu组、P27RF-Rho siRNA组和Scramble-siRNA组 (P < 0.05)。见图 4。
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| 图 4 各组细胞生长曲线 Figure 4 Growth curves of cells in various groups |
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划痕实验中P27RF-Rho siRNA+5-Fu组细胞迁移距离最小，小于5-Fu组、P27RF-Rho siRNA组和Scramble-siRNA组，组间比较差异有统计学意义 (P＜0.01)。见图 5(插页三)。
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| A:Scramble-siRNA group; B:5-Fu group; C:P27RF-Rho siRNA group; D:P27RF-Rho siRNA+5-Fu group. A-D:0 h; E-H:24 h. 图 5 各组细胞划痕距离 Figure 5 Scratching distances of cells in various groups |
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Transwell小室实验显示：P27RF-Rho siRNA+5-Fu联合用药组穿过基底膜的细胞数 (41±4) 明显少于5-Fu组、P27RF-Rho siRNA组和Scramble-siRNA组 (81±6、78±5、127±4)，组间比较差异有统计学意义 (P < 0.01)。见图 6(插页三)。
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| A:Scramble-siRNA group; B:5-Fu group; C:P27RF-Rho siRNA group; D:P27RF-Rho siRNA+5-Fu group. 图 6 各组细胞Transwell实验结果 Figure 6 Results of Transwell test of cells in various groups |
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5-Fu是一种常见的抗肿瘤药物，于1950年开发后最常应用于治疗胃肠道肿瘤，5-Fu主要是通过抑制细胞生长以及合成伪代谢物、掺入DNA及RNA中进而影响胸苷酸合酶 (TS) 的合成[6]。5-Fu耐药机制包括TS高表达、细胞内药物富集减少、凋亡相关蛋白表达异常，细胞凋亡减少、DNA损伤修复和细胞周期相关蛋白表达异常等[7-8]。然而，其耐药性限制了使用效果，许多晚期肝癌患者均对5-Fu天然耐药，或者是治疗过程中产生耐药，这也是目前临床上未单用5-Fu治疗而是多药联合治疗晚期肝癌的原因[9]。因此，从这些方面着手，寻找增加5-Fu药效的方法，提高肝癌治疗效果，显得尤为重要。
P27RF-Rho是目前新发现的Rho上游调控因子，其能通过抑制P27kip1从而释放RhoA, P27kip1是一种细胞周期相关蛋白[10]，在黑色素瘤小鼠B16中P27RF-Rho和RhoC高表达[11]。研究[12]表明：P27RF-Rho基因沉默能够增加抑癌基因P53、Pten以及降低侵袭相关蛋白RhoC、RhoA表达，因此P27RF-Rho在细胞的侵袭及转移中起重要作用，也可能是一种新的促癌因子，与抑癌基因发挥拮抗作用。另外，基因沉默也可以使CyclinE及CDK5等细胞周期相关基因表达异常，细胞阻滞于G1期，从而降低癌细胞增殖能力[13]。本实验中通过慢病毒介导P27RF-Rho基因沉默，同时联合应用5-Fu，显著降低细胞增殖、迁移和侵袭能力，增强了5-Fu的药物敏感性。
RhoC是RhoGTPase家族重要组成部分，参与了细胞侵袭转移、细胞骨架形成、细胞凋亡和生长增殖等过程[14]。研究[15]显示：RhoC基因沉默能够使Cyclin D1、CDK4表达减少，P16、P21表达增加，从而发生G1-S期阻滞，另外RhoC基因沉默能够下调凋亡抑制基因Bcl-2，并且上调凋亡基因Bax，使细胞色素C从线粒体释放，促进细胞凋亡。本实验结果显示：P27RF-Rho siRNA+5-Fu组细胞中RhoC蛋白表达水平明显低于其他3组，说明P27RF-Rho siRNA联合5-Fu可以明显地减少RhoC表达，可能引起细胞凋亡增加、细胞周期阻滞。Transwell小室实验和细胞划痕实验结果显示：P27RF-Rho siRNA+5-Fu组细胞穿膜数少于其他3组，划痕距离明显多于其他对照组，进一步说明联合用药能够明显降低肝癌细胞迁移和侵袭能力，增强药效。
P27是1994年发现的调控细胞周期、抑制细胞分裂的重要基因, P27蛋白水平与肿瘤恶性程度呈负相关关系, 其是一种广谱的cyclin/CDK抑制剂，可以抑制多种cyclin/CDK激酶活性[16-17]。P27通过与CyclinE-CDK2复合体结合，从而限制细胞由G1期向S期转变[18]，因此P27过表达会引起细胞G1期阻滞，细胞增殖减少。本实验结果显示：P27RF-Rho siRNA+5-Fu组P27蛋白条带明显强于其他3组，说明P27RF-Rho联合5-Fu能够增加P27蛋白表达，从而抑制细胞增殖，增强5-Fu杀伤肝癌细胞的敏感性。
综上所述，P2RF-Rho基因沉默能够明显增加5-Fu的药物敏感性，可从细胞增殖与凋亡、侵袭迁移等方面对肝癌5-Fu的耐药性进行逆转，因此，P27RF-Rho可能是增强5-Fu耐药性的新靶点，本研究为临床晚期肝癌治疗提供了新的思路和可能。
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