吉林大学学报(医学版)  2017, Vol. 43 Issue (02): 271-275

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杨耀群, 谢淑丽, 吕国悦, 马强, 李开良, 王广义
YANG Yaoqun, XIE Shuli, LYU Guoyue, MA Qiang, LI Kailiang, WANG Guangyi
肝癌SMMC7721细胞株P27RF-Rho mRNA基因沉默对5-Fu药物敏感性的影响
Influence of P27RF-RhO mRNA gene silencing in drug sensitivity of 5-fluorouracil in liver cancer SMMC7721 cell line
吉林大学学报(医学版), 2017, 43(02): 271-275
Journal of Jilin University (Medicine Edition), 2017, 43(02): 271-275
10.13481/j.1671-587x.20170212

文章历史

收稿日期: 2016-08-30
肝癌SMMC7721细胞株P27RF-Rho mRNA基因沉默对5-Fu药物敏感性的影响
杨耀群, 谢淑丽, 吕国悦, 马强, 李开良, 王广义     
吉林大学第一医院肝胆胰外科, 吉林 长春 130021
[摘要]: 目的: 探讨肝癌SMMC7721细胞株P27RF-Rho mRNA基因沉默对5-氟脲嘧啶(5-Fu)药物敏感性的影响,为临床晚期肝癌治疗提供理论依据。 方法: 构建P27RF-Rho RNAi载体,P27RF-Rho基因沉默慢病毒感染SMMC7721肝癌细胞,Western blotting法检测基因沉默效果。SMMC7721细胞分为Scramble-siRNA阴性对照组、5-Fu组、P27RF-Rho-siRNA组和P27RF-Rho-siRNA+5-Fu组。荧光显微镜检测细胞转染效果,Western blottting法检测RNAi基因沉默效率,MTT法检测各组细胞生长曲线,划痕实验检测细胞迁移能力,Transwell小室检测细胞侵袭能力,Western blotting法检测各组细胞中肿瘤相关蛋白P27及RhoC表达。 结果: 成功构建P27RF-Rho RNAi慢病毒载体。Western blotting法,P27RF-Rho-siRNA组细胞中P27RF-Rho蛋白表达水平明显低于5-Fu组和Scramble-siRNA组(P < 0.05)。与其他3组比较,P27RF-Rho-siRNA+5-Fu组细胞生长速度降低(P < 0.05);划痕实验中P27RF-Rho-siRNA+5-Fu组细胞迁移能力明显减低(P < 0.01);P27RF-Rho-siRNA+5-Fu组穿过Transwell小室微孔滤膜的平均细胞数明显少于其他3组(P < 0.01);Western blotting法检测,P27RF-Rho-siRNA+5-Fu组细胞中癌相关蛋白P27表达水平明显高于其他3组(P < 0.05),侵袭相关蛋白RhoC表达水平低于其他3组(P < 0.05)。 结论: P27RF-Rho基因沉默能明显增强5-Fu对肝癌SMMC7721细胞的药物敏感性。
关键词: 肝肿瘤    慢病毒    P27RF-Rho    5-氟脲嘧啶    药物敏感性    
Influence of P27RF-RhO mRNA gene silencing in drug sensitivity of 5-fluorouracil in liver cancer SMMC7721 cell line
YANG Yaoqun, XIE Shuli, LYU Guoyue, MA Qiang, LI Kailiang, WANG Guangyi     
Department of Hepatobiliary and Pancreatic Surgery, First Hospital, Jilin University, Changchun 130021, China
[Abstract]: Objective: To investigate the influence of P27RF-Rho mRNA gene silencing in the drug sensitivity of 5-fluorouracil (5-Fu) to the liver cancer SMMC cell line, and to provide theoretical basis for the treatment of advanced liver cancer. Methods: The P27RF-Rho RNAi vector was constructed and the P27RF-Rho gene silencing lentivirus were used to infect the SMMC7721 cells. Western blotting method was used to detect the gene silencing effect. The SMMC7721 cells were divided into Scramble-siRNA group, 5-Fu group, P27RF-Rho siRNA group and P27RF-Rho siRNA + 5-Fu group. Western blotting was used to detect the transfection efficiency of RNAi. MTT method was used to detect the cell growth in various groups. Scratching test was used to detect the migration ability of cells in various groups. Transwell experiment were used to detect the invasion ability of cells in various groups. The expressions of P27 and RhoC protein were detected by Western blotting method. Results: P27RF-Rho RNAi lentiviral vector was successfully constructed. The Western blotting results showed that the expression of P27RF-Rho protein in P27RF-Rho siRNA group was decreased compared with 5-Fu group and Scramble-siRNA group (P < 0.05). Compared with other three groups, the growth speed of the cells in P27RF-Rho siRNA + 5-Fu group was significantly decreased (P < 0.05). The migration ability of the cells in P27RF-Rho siRNA + 5-Fu group was significantly lower than those in other three groups (P < 0.01);the average number of cells passing through the Transwell microporous membrane was significantly less than those in other three groups (P < 0.01).The Western blotting analysis results showed that the expression level of P27 protein in the cells in P27RF-Rho siRNA + 5-Fu group was significantly higher than those in other three groups (P < 0.05);the expression level of RhoC protein was significantly lower than those in other three groups (P < 0.05). Conclusion: P27RF-Rho gene silencing can significantly enhance the drug sensitivity of 5-Fu to SMMC7721 cells.
Key words: liver neoplasms     lentivirus     P27RF-Rho     5-fluorouracil     drug sensitivity    

原发性肝细胞肝癌 (肝癌)(hepatic cell carcinoma,HCC) 是外科常见病、多发病,其病死率占恶性肿瘤的第2位,目前手术切除仍是根治肝癌的最佳方法[1]。但是由于肝癌具有极强的侵袭转移等恶性生物学行为,即使获得根治性切除,术后常发生转移及复发[2]。常规化疗,患者预后亦不很满意,因此寻找抑制术后复发转移的方法极其重要。5-氟脲嘧啶 (5-fluorouracil,5-Fu) 作为一种抗癌化疗药物,在肝切除术前术后均有广泛应用。5-Fu是一种常用的抗代谢药物,5-Fu在细胞内转变成5-氟脲嘧啶脱氧核苷酸 (5-FdUMP), 而抑制脱氧胸苷酸合成酶 (TS),阻止脱氧脲苷酸 (dUMP) 甲基转化为脱氧胸苷酸 (dTMP),从而影响DNA合成, 或在体内变成5-氟脲嘧啶核苷 (5-FuR) 以伪代谢物形式掺入RNA, 影响蛋白质的合成[3]。Rho即Ras相似物 (Ras homologue), 与Ras家族同属小G蛋白超家族成员, 主要包括Rho、Rac和cdc42 3个亚家族, 在细胞信号传导中具有重要的功能。目前Rho研究比较广泛的是RhoA和RhoC,两者在肿瘤发生发展过程中起重要作用[4]。5-Fu是一种重要的肝癌化疗药物,但是长期大量使用不良反应较大,并且有效剂量与中毒剂量接近,限制了其使用,因此寻找一种很好的化疗辅助用药显得格外重要[5]。本文作者应用病毒介导肝癌SMMC7721细胞P27RF-Rho基因沉默联合5-Fu,观察P27RF-Rho是否能够增强5-Fu对肝癌的杀伤效果,旨在为临床晚期肝癌的治疗提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 细胞、主要试剂和仪器

肝癌SMMC7721细胞株由吉林大学第一医院肝胆外科实验室保存,P27RF-Rho RNAi慢病毒及Scramble慢病毒由本实验室谢淑丽老师构建并赠送,各种抗体购于美国Santa Cruz公司。紫外分光光度计 (上海光学仪器厂),CO2孵箱 (日本SANYO公司), Transwell小室 (美国Sigma公司)。

1.2 SMMC7721细胞分组和慢病毒感染

实验细胞分为Scramble-siRNA阴性对照组、5-Fu组、P27RF-Rho-siRNA组和P27RF-Rho siRNA+5-Fu组。实验所用SMMC7721细胞用含10%胎牛血清、1%双抗的细胞H-DMEM培养液,于37℃、5%CO2的孵育箱培养。取对数生长期的SMMC7721细胞以每孔4×105细胞接种于6孔板中,待细胞平铺6孔板底面积为80%~90%时,按实验设计的分组分别加入RNAi慢病毒进行细胞感染,待细胞感染36~48 h后观察绿色荧光表达,并进行后续实验。

1.3 Western blotting法检测P27RF-Rho基因沉默效果及肝癌相关蛋白表达水平

刮板收集6孔板中细胞于1.5 mL EP管中,加入RIPA裂解液及蛋白酶抑制剂——苯甲基磺酰氟 (phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF),冰上孵育30 min,不断吹打,使细胞裂解彻底。然后置于低温离心机中,4℃、2 000 r·min-1离心30 min,将上清移至1个新的1.5 mL EP管中,用BCA法测定蛋白浓度,并分装。根据蛋白浓度,取相应体积的30 μg蛋白质样品,与5倍稀释的溴酚蓝上样缓冲液4:1混合,沸水浴煮5 min,行12%SDS-PAGE电泳。电泳完毕后,PAGE胶上的目的蛋白用Bio-Rad电转仪移至PVDF膜上。取出聚偏二氟乙烯 (polyvinylidene fluoride,PVDF) 膜用20 mL封闭液 (含5%脱脂奶粉的TBST溶液) 封闭20 min,弃去封闭液,加入一抗 (1:1 000稀释)4℃孵育过夜,取出过夜PVDF膜,20 mL TBST震荡洗膜3次,每次5 min,再加入二抗孵育2 h,TBST洗膜,方法同上。PVDF膜稍干后,将化学发光试剂 (ECL) 均匀涂抹于PVDF膜上表面,作用约1 min后迅速置于暗箱内曝光,曝光1 min后显影并拍照记录,β-actin为内参照。检测各组细胞中RhoC蛋白及P27蛋白表达,并以Image J图像处理软件进行蛋白条带灰度分析,以β-actin灰度值为分母,所测蛋白灰度值为分子,比值越大则相应蛋白表达水平越高。

1.4 MTT法检测各组细胞生长

按以上实验分组,以3×104mL-1的细胞浓度接种于96孔板中,每孔接种200 μL细胞悬液,每组设3个复孔。共铺7块板,并置于孵箱中培养,慢病毒感染细胞及加药后24h起,每天随机取出一块板,MTT法检测各孔细胞吸光度 (A) 值, 取各组平均值。连续7d,绘制生长曲线,比较各组间每天的A值。

1.5 划痕实验检测细胞迁移能力

胰酶消化各实验组细胞,弃去胰酶,用含10%胎牛血清、1%双抗的细胞H-DMEM培养液将细胞吹打成细胞悬液,细胞计数,于96孔板中按每孔2×104个细胞加入上述细胞悬液,待细胞生长铺满96孔板底表面时,用10 μL移液枪头在孔板底部按从上到下划“一”字形划痕。分别于划痕后0和24h观察不同实验组划痕区细胞的迁移情况,并进行比对和测量。

1.6 体外Transwell小室侵袭实验检测实验细胞侵袭能力

铺胶:将Matrigel胶按1:1稀释后,每个小室底部均匀涂布30 μL,室温风干20 min。将上述6孔板中4组细胞用胰酶处理,制成细胞悬液,离心,弃去上清,加1 mL无血清培养液吹打,制备细胞悬液。上述细胞悬液200 μL,以3×105 mL-1的细胞浓度接种到上室中,下室加入500 μL含10%胎牛血清、1%双抗的细胞H-DMEM培养液,37℃、5%CO2条件下培养24 h。用棉签擦去小室上层的细胞及胶,并用无菌PBS冲洗2~3次,4%多聚甲醛固定20 min,0.1%龙胆紫染色30 min,蒸馏水冲洗小室下表面2~3次,风干,每组小室在显微镜下选取5个视野并拍照,计数,取平均值。

1.7 统计学分析

应用SPSS13.0统计软件进行统计学分析。各组细胞中P27RF-Rho、P27和RhoC相对表达水平,Transwell细胞穿膜数和生长曲线相应A值以x±s表示;组间样本均数比较采用t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 病毒包装后感染SMMC 7721细胞的效果

慢病毒感染SMMC7721细胞48h后,荧光显微镜下观察细胞转染效果并拍照,阴性质粒对照Scramble-siRNA组和P27RF-Rho siRNA组细胞出现明显的绿色荧光蛋白表达,病毒转染效果良好。见图 1(插页三)。

A:Scramble RNAi; B:P27RF-Rho RNAi. 图 1 荧光显微镜检测基因沉默效果 Figure 1 Effect of gene silencing detected by fluorescence microscope
2.2 Western blotting法检测各组P27RF-Rho siRNA基因沉默效果

5-Fu组、Scramble-siRNA组和P27RF-Rho-siRNA组P27RF-Rho蛋白表达水平分别为0.879±0.150、0.906±0.120和0.476±0.170,P27RF-Rho-siRNA组P27RF-Rho蛋白表达水平明显低于其他2组,差异有统计学意义 (P < 0.05)。5-Fu组与Scramble-siRNA组P27RF-Rho蛋白表达水平比较差异无统计学意义 (P > 0.05)。见图 2

Lane 1:5-Fu group; Lane 2:Scramble-siRNA group; Lane 3:P27RF-Rho siRNA group. 图 2 Western blotting法检测基因沉默效果 Figure 2 Gene silencing effect detected by Western blotting method
2.3 Western blotting法检测慢病毒感染细胞后肿瘤相关蛋白的表达水平

P27RF-Rho siRNA+5-Fu组P27蛋白表达水平 (0.849±0.140) 明显高于5-Fu组、P27RF-Rho siRNA组和Scramble-siRNA组 (0.614±0.130、0.621±0.160和0.340±0.090,P < 0.05)。与5-Fu组、P27RF-Rho siRNA组和Scramble-siRNA组 (0.519±0.230、0.516±0.170和0.818±0.110) 比较,P27RF-Rho siRNA+5-Fu组RhoC蛋白表达水平 (0.206±0.110) 明显降低 (P < 0.05)。5-Fu组与P27RF-Rho siRNA组P27、RhoC蛋白表达水平比较差异无统计学意义 (P > 0.05)。见图 3表 1

Lane 1:Scramble-siRNA group; Lane 2: 5-Fu group; Lane 3:P27RF-Rho siRNA group; Lane 4: P27RF-Rho siRNA+5-Fu group. 图 3 各组细胞中P27和RhoC蛋白表达电泳图 Figure 3 Electrophoregram of expressions of P27 and RhoC in cells in various groups
表 1 各组细胞中P27蛋白和RhoC蛋白表达水平 Table 1 Expression levels of P27 protein and RhoC protein in cells in various groups
(n=3, x±s)
Group P27 RhoC
Scramble-siRNA 0.34±0.09 0.818±0.11
5-Fu 0.614±0.13 0.519±0.08
P27RF-Rho siRNA 0.621±0.16 0.516±0.12
P27RF-Rho siRNA+5-Fu 0.849±0.14*# 0.206±0.11*#
*P < 0.05 compared with Scramble-siRNA group; P < 0.05 compared with 5-Fu group; #P < 0.05 compared with P27RF-Rho siRNA group.
2.4 各组细胞生长速度

实验前2d,各组细胞生长速度无明显差异; 第3天开始,P27RF-Rho siRNA+5-Fu组细胞生长速度 (0.437±0.070) 逐渐低于5-Fu组、P27RF-Rho siRNA和Scramble-siRNA组; 第4天P27RF-Rho siRNA+5-Fu组细胞生长速度明显低于其他3组 (0.646±0.100、0.634±0.090和0.997±0.050),组间比较差异有统计学意义 (P < 0.05);第5~7天P27RF-Rho siRNA+5-Fu组细胞生长速度明显低于5-Fu组、P27RF-Rho siRNA组和Scramble-siRNA组 (P < 0.05)。见图 4

图 4 各组细胞生长曲线 Figure 4 Growth curves of cells in various groups
2.5 各组细胞迁移能力

划痕实验中P27RF-Rho siRNA+5-Fu组细胞迁移距离最小,小于5-Fu组、P27RF-Rho siRNA组和Scramble-siRNA组,组间比较差异有统计学意义 (P<0.01)。见图 5(插页三)。

A:Scramble-siRNA group; B:5-Fu group; C:P27RF-Rho siRNA group; D:P27RF-Rho siRNA+5-Fu group. A-D:0 h; E-H:24 h. 图 5 各组细胞划痕距离 Figure 5 Scratching distances of cells in various groups
2.6 各组细胞穿膜能力

Transwell小室实验显示:P27RF-Rho siRNA+5-Fu联合用药组穿过基底膜的细胞数 (41±4) 明显少于5-Fu组、P27RF-Rho siRNA组和Scramble-siRNA组 (81±6、78±5、127±4),组间比较差异有统计学意义 (P < 0.01)。见图 6(插页三)。

A:Scramble-siRNA group; B:5-Fu group; C:P27RF-Rho siRNA group; D:P27RF-Rho siRNA+5-Fu group. 图 6 各组细胞Transwell实验结果 Figure 6 Results of Transwell test of cells in various groups
3 讨论

5-Fu是一种常见的抗肿瘤药物,于1950年开发后最常应用于治疗胃肠道肿瘤,5-Fu主要是通过抑制细胞生长以及合成伪代谢物、掺入DNA及RNA中进而影响胸苷酸合酶 (TS) 的合成[6]。5-Fu耐药机制包括TS高表达、细胞内药物富集减少、凋亡相关蛋白表达异常,细胞凋亡减少、DNA损伤修复和细胞周期相关蛋白表达异常等[7-8]。然而,其耐药性限制了使用效果,许多晚期肝癌患者均对5-Fu天然耐药,或者是治疗过程中产生耐药,这也是目前临床上未单用5-Fu治疗而是多药联合治疗晚期肝癌的原因[9]。因此,从这些方面着手,寻找增加5-Fu药效的方法,提高肝癌治疗效果,显得尤为重要。

P27RF-Rho是目前新发现的Rho上游调控因子,其能通过抑制P27kip1从而释放RhoA, P27kip1是一种细胞周期相关蛋白[10],在黑色素瘤小鼠B16中P27RF-Rho和RhoC高表达[11]。研究[12]表明:P27RF-Rho基因沉默能够增加抑癌基因P53、Pten以及降低侵袭相关蛋白RhoC、RhoA表达,因此P27RF-Rho在细胞的侵袭及转移中起重要作用,也可能是一种新的促癌因子,与抑癌基因发挥拮抗作用。另外,基因沉默也可以使CyclinE及CDK5等细胞周期相关基因表达异常,细胞阻滞于G1期,从而降低癌细胞增殖能力[13]。本实验中通过慢病毒介导P27RF-Rho基因沉默,同时联合应用5-Fu,显著降低细胞增殖、迁移和侵袭能力,增强了5-Fu的药物敏感性。

RhoC是RhoGTPase家族重要组成部分,参与了细胞侵袭转移、细胞骨架形成、细胞凋亡和生长增殖等过程[14]。研究[15]显示:RhoC基因沉默能够使Cyclin D1、CDK4表达减少,P16、P21表达增加,从而发生G1-S期阻滞,另外RhoC基因沉默能够下调凋亡抑制基因Bcl-2,并且上调凋亡基因Bax,使细胞色素C从线粒体释放,促进细胞凋亡。本实验结果显示:P27RF-Rho siRNA+5-Fu组细胞中RhoC蛋白表达水平明显低于其他3组,说明P27RF-Rho siRNA联合5-Fu可以明显地减少RhoC表达,可能引起细胞凋亡增加、细胞周期阻滞。Transwell小室实验和细胞划痕实验结果显示:P27RF-Rho siRNA+5-Fu组细胞穿膜数少于其他3组,划痕距离明显多于其他对照组,进一步说明联合用药能够明显降低肝癌细胞迁移和侵袭能力,增强药效。

P27是1994年发现的调控细胞周期、抑制细胞分裂的重要基因, P27蛋白水平与肿瘤恶性程度呈负相关关系, 其是一种广谱的cyclin/CDK抑制剂,可以抑制多种cyclin/CDK激酶活性[16-17]。P27通过与CyclinE-CDK2复合体结合,从而限制细胞由G1期向S期转变[18],因此P27过表达会引起细胞G1期阻滞,细胞增殖减少。本实验结果显示:P27RF-Rho siRNA+5-Fu组P27蛋白条带明显强于其他3组,说明P27RF-Rho联合5-Fu能够增加P27蛋白表达,从而抑制细胞增殖,增强5-Fu杀伤肝癌细胞的敏感性。

综上所述,P2RF-Rho基因沉默能够明显增加5-Fu的药物敏感性,可从细胞增殖与凋亡、侵袭迁移等方面对肝癌5-Fu的耐药性进行逆转,因此,P27RF-Rho可能是增强5-Fu耐药性的新靶点,本研究为临床晚期肝癌治疗提供了新的思路和可能。

参考文献
[1] 院存珍, 樊晨. 原发性肝癌的外科治疗进展[J]. 中国现代普通外科进展, 2016, 19(2): 155–157.
[2] Center MM, Jemal A. International trends in liver cancer incidence rates[J]. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 2011, 20(11): 2362–2368. DOI:10.1158/1055-9965.EPI-11-0643
[3] Zhang H, Ozaki I, Hamajima H, et al. Vitamin K2 augments 5-fluorouracil-induced growth inhibition of human hepatocellular carcinoma cells by inhibiting NF-κB activation[J]. Oncol Rep, 2011, 25(1): 159–166.
[4] Hanna S, El-Sibai M. Signaling networks of Rho GTPases in cell motility[J]. Cell Signal, 2013, 25(10): 1955–1961. DOI:10.1016/j.cellsig.2013.04.009
[5] Zhou S, Ye W, Zhang Y, et al. miR-144 reverses chemoresistance of hepatocellular carcinoma cell lines by targeting Nrf2-dependent antioxidant pathway[J]. Am J Transl Res, 2016, 8(7): 2992–3002.
[6] Longley DB, Harkin DP, Johnston PG. 5-Fluorouracil:mechanisms of action and clinical strategies[J]. Nat Rev Cancer, 2003, 3(5): 330–338. DOI:10.1038/nrc1074
[7] Guo X, Goessl E, Jin G, et al. Cell cycle perturbation and acquired 5-fluorouracil chemoresistance[J]. Anticancer Res, 2008, 28(1A): 9–14.
[8] Zhang N, Yin Y, Xu SJ, et al. 5-Fluorouracil:mechanisms of resistance and reversal strategies[J]. Molecules, 2008, 13(8): 1551–1569. DOI:10.3390/molecules13081551
[9] Cao LQ, Wang XL, Wang Q, et al. Rosiglitazone sensitizes hepatocellular carcinoma cell lines to 5-fluorouracil antitumor activity through activation of the PPARgamma signaling pathway[J]. Acta Pharmacol Sin, 2009, 30(9): 1316–1322. DOI:10.1038/aps.2009.119
[10] Sharma SS, Pledger WJ. The non-canonical functions of p27(Kip1) in normal and tumor biology[J]. Cell Cycle, 2016, 15(9): 1189–1201. DOI:10.1080/15384101.2016.1157238
[11] Hoshino D, Koshikawa N, Seiki M. A p27(kip1)-binding protein, p27RF-Rho, promotes cancer metastasis via activation of RhoA and RhoC[J]. J Biol Chem, 2011, 286(4): 3139–3148. DOI:10.1074/jbc.M110.159715
[12] 马强, 谢淑丽, 王广义, 等. 慢病毒介导靶向P27RF-Rho基因沉默对肝癌细胞侵袭性的影响[J]. 吉林大学学报:医学版, 2016, 42(2): 260–265.
[13] 邢光远, 谢淑丽, 邱伟, 等. P27RF-Rho基因沉默对肝癌Bel7402细胞增殖的影响[J]. 吉林大学学报:医学版, 2015, 41(3): 542–547.
[14] Tseliou M, Al-Qahtani A, Alarifi S, et al. The role of RhoA, RhoB and RhoC GTPases in cell morphology, proliferation and migration in human cytomegalovirus (HCMV) infected glioblastoma cells[J]. Cell Physiol Biochem, 2016, 38(1): 94–109. DOI:10.1159/000438612
[15] Xie S, Zhu M, Lv G, et al. The role of RhoC in the proliferation and apoptosis of hepatocellular carcinoma cells[J]. Med Oncol, 2012, 29(3): 1802–1809. DOI:10.1007/s12032-011-0003-0
[16] Toyoshima H, Hunter T. p27, a novel inhibitor of G1 cyclin-Cdk protein kinase activity, is related to p21[J]. Cell, 1994, 78(1): 67–74. DOI:10.1016/0092-8674(94)90573-8
[17] 谢启超, 胡义德. p27研究进展[J]. 国外医学:肿瘤学分册, 2003, 30(1): 48–50.
[18] Satoh T, Kaida D. Upregulation of p27 cyclin-dependent kinase inhibitor and a C-terminus truncated form of p27 contributes to G1 phase arrest[J]. Sci Rep, 2016, 6: 27829. DOI:10.1038/srep27829