吉林大学学报(医学版)  2017, Vol. 43 Issue (02): 236-240

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王思涵, 姜欢, 于航, 刘少伟, 李梦红, 王六一, 杨军星, 胡敏
WANG Sihan, JIANG Huan, YU Hang, LIU Shaowei, LI Menghong, WANG Liuyi, YANG Junxing, HU Min
不同浓度熊果酸对破骨细胞增殖分化的作用及其意义
Effects of ursolic acid at different concentrations on proliferation and differentiation of osteoclasts and their significances
吉林大学学报(医学版), 2017, 43(02): 236-240
Journal of Jilin University (Medicine Edition), 2017, 43(02): 236-240
10.13481/j.1671-587x.20170205

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收稿日期: 2016-12-21
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王思涵, 姜欢, 于航, 刘少伟, 李梦红, 王六一, 杨军星, 胡敏. 不同浓度熊果酸对破骨细胞增殖分化的作用及其意义[J]. 吉林大学学报(医学版), 2017, 43(02): 236-240.
WANG Sihan, JIANG Huan, YU Hang, LIU Shaowei, LI Menghong, WANG Liuyi, YANG Junxing, HU Min. Effects of ursolic acid at different concentrations on proliferation and differentiation of osteoclasts and their significances[J]. Journal of Jilin University (Medicine Edition), 2017, 43(02): 236-240.
不同浓度熊果酸对破骨细胞增殖分化的作用及其意义
王思涵1,2, 姜欢1, 于航1, 刘少伟1, 李梦红1, 王六一1, 杨军星1, 胡敏1     
1. 吉林大学口腔医院正畸科, 吉林 长春 130021;
2. 吉林省牙发育及颌骨重塑与再生重点实验室, 吉林 长春 130021
收稿日期: 2016-12-21
基金项目: 国家自然科学基金资助课题（81600898）；吉林省卫生厅科研基金资助课题（2014Z073）
作者简介: 王思涵 (1989-), 女, 黑龙江省牡丹江市人, 在读医学硕士, 主要从事正畸与牙根吸收方面的研究。
通信作者: 胡敏, 教授, 博士研究生导师 (Tel:0431-88796023, E-mail:humin@jlu.edu.cn)
[摘要]: 目的: 研究熊果酸（UA）对破骨细胞（OC）增殖分化的影响，探讨其在正畸力致牙根吸收过程中的作用以及与OC间的关系。 方法: 对小鼠单核/巨噬系细胞RAW264.7进行OC诱导，采用抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色法及骨吸收陷窝观察鉴定诱导是否成功。采用CCK-8法选取对RAW264.7无细胞生物毒性适宜浓度的UA，观察其对RAW264.7增殖分化的影响。实验组在培养液中加入梯度浓度为1.0、2.5、5.0、10.0、20.0和40.0μmol·L-1 UA，对照组不加UA。 结果: TRAP染色及骨吸收陷窝观察，诱导培养RAW264.7细胞5 d后，可见TRAP染色阳性细胞；扫描电镜下吸收陷窝呈圆形和椭圆形等，底壁较粗糙，边界较清晰。表明RAW264.7细胞成功向OC分化。CCK-8检测，高浓度UA（> 10.0μmol·L-1）显著抑制OC的增殖；适宜浓度UA（5.0μmol·L-1）既在生物安全浓度范围内，又抑制OC的增殖；低浓度UA（< 2.5μmol·L-1）无作用。 结论: RANKL可诱导RAW264.7细胞分化成熟。UA与OC增殖分化有关联，其在适宜浓度（5.0μmol·L-1）时对OC增殖有抑制作用，且呈时间依赖性。
关键词: 熊果酸    破骨细胞    RAW264.7细胞    牙根吸收    
Effects of ursolic acid at different concentrations on proliferation and differentiation of osteoclasts and their significances
WANG Sihan1,2, JIANG Huan1, YU Hang1, LIU Shaowei1, LI Menghong1, WANG Liuyi1, YANG Junxing1, HU Min1     
1. Department of Orthodontics, StomatologyHospital, Jilin University, Changchun 130021, China;
2. Jilin Provincial Kay Laboratory of Tooth Development and Bone Remodeling, Changchun 130021, China
[Abstract]: Objective: To investigate the effects of ursolic acid (UA) on the proliferation and differentiation of osteoclasts (OC), and to explore its role in orthodontic force-induced root resorption and its relationship with OC. Methods: The mononuclear/macrophage cells RAW264.7 were induced to the OC.Tacrolimus acid phosphatase (TRAP) staining and bone resorption lacunae observation were used to identify the induction. CCK-8 method was used to select the appropriate concentration of UA for RAW264.7 cell-free biotoxicity and to observe its effect on the proliferation and differentiation of RAW264.7.In experimental groups, UA with gradient concentrations (1.0, 2.5, 5.0, 10.0, 20.0and 40.0 μmol·L-1) were added.UA was not added in control group. Results: The TRAP staining and bone resorption lacunae observation showed that after the RAW264.7 cells were induced for 5 d, the TRAP staining positive cells were found; the resorption lacunae were rounded, and oval, etc, the bottom wall was coarser, and the boundary was clear, which indicated that the RAW264.7 cells were successfully differentiated into the osteoclasts.The CCK-8 detection results showed that high concentration of UA (> 10.0 μmol·L-1) significantly inhibited the proliferation of OC; the appropriate concentration of UA (5.0 μmol·L-1) was in the biological safety concentration range and could inhibit the OC proliferation; low concentration of UA (< 2.5 μmol·L-1) had no effect. Conclusion: RANKL can induce the differentiation and maturation of RAW264.7 cells. UA is correlated with the proliferation and differentiation of OC; UA has inhibitory effect on OC at the appropriate concentration (5.0 μmol·L-1) in a time-dependent manner.
Key words: ursolic acid     osteoclasts     RAW264.7 cells     root resorption    

牙根外吸收 (external resorption) 是指牙根表面发生的进行性病理性吸收，其病因有很多，如创伤、不适当的正畸力及根尖周牙周炎[1]。在正畸临床治疗中，牙根吸收是常见的并发症之一[2]，在炎症或刺激的条件下，牙根表面发生一系列生理或病理变化，干扰牙骨质形成和再吸收之间的平衡[3]。破骨细胞 (osteoclasts, OC) 是唯一一种参与骨和软骨再吸收的细胞，细胞核因子κB (NF-κB) 受体活化因子配基 (RANKL) 是OC存活、增殖和分化的重要细胞因子，与其相应受体活化剂NF-κB (RANK) 相结合从而发挥生物学作用，RANKL和RANK相结合，激活MAPK、NF-κB及Ca2+等信号通路引起OC内一系列酶促级联反应，使OC前体分化、存活和融合为成熟OC[4-5]。

熊果酸 (ursolic acid, UA) 是一种五环三萜类化合物，在植物界分布极为广泛，如希腊鼠尾草、夹竹桃[6]，其毒性低、不良反应少，具有增强免疫力、抗肝炎、抗肿瘤、抗菌抗病毒和降血糖等效果[7-12]。研究[10, 13-16]表明：UA可通过调控信号传导及激活STAT3、MAPKs、PPARs和TGF-b/Smad信号及NF-κB发挥作用。目前，对于UA药理学机制的研究主要集中在抗癌、保肝、抗高血脂和抗抑郁作用方面，在骨代谢方面少有报道。本研究以RAW264.7细胞为模型，观察UA对RANKL诱导成功的OC增殖和分化的影响，旨在探讨UA对正畸力致牙根吸收过程中的保护作用，为今后进一步开发和利用UA防治牙根吸收提供实验依据。

1 材料与方法 1.1 细胞和主要试剂

小鼠单核/巨噬系细胞RAW264.7细胞株 (本实验室传代保存ATCC细胞库)，RPMI1640培养液 (Hyclone公司，美国)，胎牛血清 (Gibco公司，美国)，磷酸盐缓冲液 (phosphate buffer solution，PBS, Gibco公司，美国)，RANKL (Pepro Tech公司，美国)，抗酒石酸酸性磷酸酶 (tartrate resistant acid phosphatase，TRAP) 染色试剂盒 (Sigma-Aldrich公司，美国)，熊果酸 (Sigma公司，美国)，CCK-8试剂盒 (贝博公司，中国)。

1.2 RAW264.7细胞培养

将装有RAW264.7细胞的冻存管从-80℃中取出，投入37℃水浴锅中迅速溶化细胞，吸出细胞移至离心管内，1000 r·min-1离心5 min，弃上清，加入含10%胎牛血清及1%双抗的RPMI1640培养液，将细胞团块吹打均匀，再将培养液移入培养皿中，置于37℃、体积分数5% CO2培养箱中培养，隔天换液1次。

1.3 OC的诱导

诱导液的配制为10% FBS和1%双抗的RPMI1640培养液中加入60 μg·L-1 RANKL。选择生长状态良好的RAW264.7单核/巨噬细胞细胞株，使用无菌细胞刮将培养皿中的细胞轻轻刮下，重悬细胞。经细胞计数板计数，以每孔1×104的细胞密度接种于24孔板，待细胞贴壁后加入1 mL诱导液，置于37℃、体积分数5% CO2培养箱中，培养5 d，并隔天更换破骨细胞诱导液。

1.4 OC的TRAP染色

TRAP是特异性表达于OC的酶，其表达和分泌均与OC功能密切相关，是识别OC的重要标志。从37℃、5% CO2恒温孵育箱中取出已加入60 μg·L-1 RANKL的诱导5 d后的RAW264.7细胞，去除原有培养基，用37℃预热的PBS漂洗3次，4%多聚甲醛常温固定20 min后，37℃预热的PBS漂洗3次。使用TRAP染色试剂盒，按照说明书建议的操作步骤操作。显微镜下拍照，光镜下观察到2个细胞核以上且TRAP染色阳性的多核细胞即为OC。

1.5 OC骨吸收陷窝的观察

取24孔培养板，选用生长状态良好的RAW264.7细胞以每孔1×104的细胞密度与骨片共同培养，置37℃、5% CO2培养箱中，实验组培养液中加入60 μg·L-1的RANKL，对照组不加RANKL，诱导第5天时，弃上清，PBS冲洗3次，用蒸馏水反复冲洗骨片，去除骨片上贴附的细胞，超声清洗10 min×3次。通过电镜扫描检测观察骨吸收陷窝。

1.6 选取对OC无细胞毒性适宜浓度的UA

选用生长状态良好的RAW264.7细胞按每孔2×103的细胞密度接种于96孔板上，分为对照组和不同浓度 (1.0、2.5、5.0、10.0、20.0和40.0μmol·L-1) UA组，每组6个复孔，置于37℃、5% CO2培养箱中孵育5 d，每2d换液1次，换液同时更换培养液中诱导液及不同浓度的药物。分别在第1、3和5天每孔加入10μL CCK-8试剂溶液，培养箱继续孵育4 h后，终止培养。在酶标仪上测定各孔在波长450 nm处的吸光度 (A) 值，计算各孔细胞的活力。细胞活力=(加药组A值-空白组A值)/(对照组A值－空白组A值)×100%。

1.7 统计学分析

采用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析。各组细胞活力均以x±s表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 OC的TRAP染色观察

RAW264.7细胞诱导培养5 d后，可见TRAP染色阳性细胞，体积大，多核 (核≥3个)，形状不规则，边缘呈云雾状，有伪足，镜下细胞核呈紫蓝色，胞浆中TRAP活性部位呈紫红色颗粒，表明RAW264.7细胞成功向OC转化。见图 1(插页一)。

A:RAW264.7 cells induced without RANKL; B:Osteoclasts induced successfully with RANKL. 图 1 OC的TRAP染色结果 (×400) Figure 1 Results of TRAP staining of OC (×400)
图选项
2.2 OC的骨吸收陷窝观察

RAW264.7细胞诱导培养5 d后，扫描电镜下吸收陷窝呈圆形和椭圆形等，底壁较粗糙，边界较清晰。表明RAW264.7细胞成功向OC转化。见图 2。

A:Bone pieces co-cultured without RAW264.7 cells; B:Bone pieces co-cultured with RAW264.7 cells. 图 2 OC的骨吸收陷窝 Figure 2 Bone resorption lacunae of OC
图选项
2.3 CCK-8法选择适宜的UA浓度

纵向观察：药物作用1、3和5 d时，UA浓度在> 10.0 μmol·L-1时细胞活力均低于对照组，说明UA浓度> 10.0 μmol·L-1时对OC增殖有明显的抑制作用；药物作用1和3 d时，UA浓度 < 5.0 μmol·L-1组细胞活力低于对照组，但差异无统计学意义 (P > 0.05)；在药物作用5 d时，UA < 5.0 μmol·L-1组均低于对照组，且5.00 μmol·L-1组差异有统计学意义 (P < 0.05)。UA对OC的作用表现为高浓度早期抑制增殖 (> 10.0 μmol·L-1)，低浓度 (1.0和2.5μmol·L-1) 早期无作用，中浓度 (5.0 μmol·L-1) 早期无作用，第5天时起抑制OC增殖作用。见表 1。

表 1 各组药物作用不同时间OC的细胞活力 Table 1 Cell viablilities of OC in various groups after treatment for different time
(n=6, x±s, η/%)
Group Cell viability
(t/d)    1 3 5
Control 100.00±1.81 100.00±4.00 100.00±5.87
UA (μmol·L-1)
    1.0 96.00±5.60 98.43±7.34 99.90±3.23
    2.5 100.79±4.52 99.92±4.03 98.80±3.88
    5.0 98.36±6.43 100.28±5.82 90.36±5.29*
    10.0 40.46±1.47* 16.59±0.59* 13.53±1.49*
    20.0 32.20±0.65* 17.11±1.29* 17.21±3.31*
    40.0 32.35±0.66* 16.67±1.22* 17.39±4.58*
*P < 0.01 vs control group.
表选项

横向观察：高浓度组 (> 10.0 μmol·L-1) 表现为早期抑制OC增殖作用 (P < 0.05)；低浓度组 (< 2.5μmol·L-1) 表现为无作用；中浓度组 (5.0μmol·L-1) 表现为早期无作用，晚期 (第5天) 有抑制OC增殖作用。见图 3。

图 3 CCK-8法横向观察线状图 Figure 3 Linear graph of CCK-8 method in horizontal observation
图选项
3 讨论

正畸所导致的牙根外吸收是由于机械力诱发牙周细胞坏死所触发的炎症反应，该炎症所致的微环境可以引起骨吸收和骨形成[17]。在此过程中，OC起到关键的作用，研究[18-19]表明：RANKL可促进OC的分化，增强成熟OC的活力，阻止OC凋亡，是OC分化成熟和维持功能所需的重要因子。RANKL的信号经RANK传递给肿瘤坏死因子受体相关因子 (TRAF)，经过TRAF激活下游多种信号分子，引起一系列的信号转导反应和细胞生物学效应, 从而促进OC的增殖、分化、成熟以及增强骨吸收活性。其中，RANKL与M-CSF结合到OC的前体细胞表面受体RANK和M-CSFR上，RANK胞内区的特异性位点与OC内的肿瘤坏死因子受体相关蛋白结合，引起OC下游信号的的链式反应。近年来研究[20]显示：无论M-CSF是否存在, RANKL均能诱导脾细胞向OC分化。本实验中直接用加RANKL的诱导培养基诱导RAW264.7细胞，出现许多TRAP (OC特征性标志物[21]) 染色阳性的多核细胞和骨吸收陷窝 (体外培养成熟OC最可靠的鉴别指标[22])，证实了实验培养的多核细胞是OC前体细胞分化形成的成熟OC。本研究以OC前体细胞RAW264.7细胞为模型，在含诱导培养基中加RANKL诱导RAW264.7细胞分化成熟, 减少了M-CSF的应用, 使培养体系更加简单, 易于操作, 获取的细胞时程短、稳定高效、细胞成分单一、产量和纯度都高，通过RANKL诱导OC分化从而获取成熟OC，为进一步研究OC与正畸炎性牙根吸收的机制奠定基础。

Tan等[23]以卵巢切除 (OVX) 的小鼠为模型，发现喂养含有UA的枇杷叶的实验组OVX小鼠比对照组OVX小鼠骨矿化密度明显增高，表明UA在OVX小鼠中可显著抑制骨密度流失，尤其在头部、腹部及腰椎部，并且表明该机制与雌激素不相关；而后续的细胞实验中也证明了UA对OC起抑制作用并呈剂量依赖性 (在生物安全浓度范围内0~40 mg·L-1)。Jiang等[24]以RANKL诱导的RAW 264.7细胞的OC为载体，将UA分为3个不同浓度组，对照组可见大量OC生成，而UA组则出现显著抑制作用并呈浓度依赖性。本实验应用此方法将实验组分为6组 (浓度分别为1.0、2.5、5.0、10.0、20.0和40.0μmol·L-1)，选取RANKL诱导第5天的RAW 264.7细胞，通过CCK-8法选取适宜浓度的UA组。结果表明：高浓度组 (> 10.0μmol·L-1) 早期抑制OC增殖，证明了UA的安全作用浓度为 < 10.0μmol·L-1，与Lee[25]的研究结果一致。而低浓度组 (< 2.5μmol·L-1) 表现为无作用，但细胞活力均低于对照组，是否无作用还需进一步的研究。中浓度组 (5.0μmol·L-1) 表现为早期对OC无作用，晚期 (第5天) 表现为抑制OC增殖的作用，说明适宜浓度UA对OC增殖有抑制作用，且呈时间依赖性。

本研究结果表明：高浓度UA (> 10.0μmol·L-1) 对OC有显著抑制作用，具有细胞毒性，表明UA的安全作用浓度为 < 10.0μmol·L-1。适宜浓度UA对OC具有抑制作用且呈时间依赖性，但其作用机制还有待进一步的研究。随着研究的逐步深入，UA有望成为临床上治疗正畸炎性牙根吸收修复的有效药物或辅助药物。

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