视网膜母细胞瘤 (retinoblastoma，Rb) 是婴幼儿内眼恶性肿瘤中最常见的一种，其发病率在婴幼儿中为1:28 000~1:15 000 ^[1-3]。视网膜母细胞瘤的形成是由于第13号染色体上 (13q14) 一对等位基因的同时缺失或失活所致，Rb基因为肿瘤抑制基因或抗癌基因，具有抑制肿瘤形成的作用。N末端缺失的Rb蛋白——Rb94(野生型全长Rb110的NH2末端缺失112个氨基酸残基) 不仅具有全长Rb基因的功能，而且因其半衰期长，所以比野生型Rb蛋白的抑瘤作用更强^[4]。本研究将食管癌K150细胞接种裸小鼠建立肿瘤模型，观察Rb94基因联合γ射线放射治疗 (放疗) 对荷瘤裸小鼠肿瘤的治疗效果，为临床上肿瘤的基因治疗与放疗的联合应用提供实验依据。

人食管癌细胞株K150由本实验室保存，培养于含10%血清、青霉素105 U·L^-1和链霉素100 mg·L^-1的RPMI 1640培养基中，在37℃、含5%CO₂饱和湿度条件下培养。

30只BALB/c-nu裸鼠6周龄，雄性，平均体质量 (22±2) g，由中国医学科学院动物所提供，动物许可证号：SCXK (2009-0004)。置于无特定病原体条件下，置于恒温 (25±2)℃、恒湿 (45%~50%)、无菌净化屏障系统内饲养。所有动物耳廓被标记以便跟踪小鼠个体肿瘤的生长历史过程。

Ad-Rb94重组腺病毒由本实验室构建并保存^[5]，RPMI 1640培养基购自美国Gibco公司，小鼠抗人埃布尔森酪氨酸蛋白激酶 (Abelson tyrosine-protein kinase, ABL) 和c-Jun氨基末端激酶 (c-Jun N-terminal kinase, JNK) 单克隆抗体均购自上海Santa Cruz公司，兔抗人β-actin单克隆抗体购自天津Abmart公司。¹³⁷Cs γ射线照射源购自加拿大Atomic Energy公司 (剂量率为0.873 Gy·min^-1)。

将处于对数生长期的食管癌K150细胞经胰蛋白酶消化，离心去上清，用无血清培养液离心洗涤2次，制备成1×10⁷mL^-1细胞悬液。于每只裸小鼠后腿两侧皮下注射200 μL细胞悬液 (即2×10⁵个细胞)，每个实验组有6只动物。

裸小鼠接种食管癌细胞后约10 d形成肿瘤, 当肿瘤最大直径长至3 mm时随机分为对照组 (未进行处理)、Ad-LacZ组 (含lacZ基因但不含Rb94基因的对照腺病毒，分别于治疗的0、3和7 d以50 μL Ad-LacZ感染瘤体，感染复数为40)、Ad-Rb94组 (分别于治疗的0、3、和7 d以50 μL Ad-Rb94感染瘤体，感染复数为40)、照射组 (4 Gy¹³⁷Cs γ射线照射源局部照射瘤体，分别于治疗的1、4和8 d进行照射) 和Ad-Rb94联合照射组 (联合组，Ad-Rb94感染后24 h进行4 Gyγ射线局部照射，给药剂量与Ad-Rb94组相同，照射时间与照射组相同)。

定期观察瘤体体积变化，于治疗的0、3、7、11和15 d用游标卡尺测量肿瘤结节的最长径 (a) 和最短径 (b)。根据公式计算肿瘤体积V=1/6π(ab²)，计算平均值，绘制肿瘤生长曲线。于治疗的第18天采用过量的CO₂吸入法处死裸鼠，称瘤质量，计算肿瘤生长抑制率。肿瘤生长抑制率=(对照组肿瘤平均瘤质量－实验组平均瘤质量)/对照组平均瘤质量×100%。

于治疗的第3天采用过量的CO₂吸入法处死裸小鼠，每组6只，剥离肿瘤组织。提取总蛋白，采用二喹啉甲酸 (bicinchoninic acid，BCA) 蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。蛋白样品经SDS-PAGE胶电泳后转膜，封闭液封闭2 h；加入小鼠抗人ABL或JN K单克隆抗体 (1:1000稀释)，4℃孵育过夜，加入HRP结合的山羊抗鼠IgG抗体 (1:3000稀释) 室温孵育1 h，采用ECL发光法检测蛋白表达，同时以β-actin抗体为内参。

检查处死的裸小鼠种植瘤的大体形态、生长部位、肿瘤附近区域转移和远处转移情况。取肿瘤组织固定于10%甲醛溶液中，用标准方法石蜡包埋，组织切片最大断面切成5 μm厚，HE染色后封片镜检，进行组织病理学分析。

采用SPSS 16.0统计软件进行统计学分析。各组荷瘤裸小鼠瘤体体积和瘤质量均以x±s表示，多组间资料比较采用完全随机设计的单因素方差分析，两样本均数组间比较采用SNK-q法。以P < 0.05为差异有统计学意义。

对照组和Ad-LacZ组荷瘤裸小鼠肿瘤生长较快，从治疗的第11天开始肿瘤迅速增长；荷瘤裸小鼠接受治疗后，Ad-Rb94组、照射组和联合组小鼠肿瘤生长速度缓慢，肿瘤生长出现抑制效应；治疗的第15天联合组小鼠肿瘤体积明显小于Ad-Rb94组和照射组，与对照组和Ad-LacZ组比较差异有统计学意义 (F=26.7，F=23.8, P < 0.01)。见图 1。

图 1 各组荷瘤裸小鼠的肿瘤生长曲线 Figure 1 Growth curves of tumor in tumor-bearing nude mice in various groups

图选项

对照组和Ad-LacZ组小鼠瘤体质量较重，但两者比较差异无统计学意义 (P > 0.05)。与对照组比较，照射组、Ad-Rb94组和联合组小鼠肿瘤生长受到抑制，肿瘤质量明显减少 (F=21.2，P < 0.05；F=28.7，P < 0.01；F=39.6, P < 0.01)；联合组小鼠瘤质量最轻，抑瘤效应最明显，肿瘤生长抑制率高达81.16%，明显高于Ad-Rb94组 (57.84%) 和照射组 (38.20%)(P < 0.01)。见表 1。

于治疗的第3天检测荷瘤裸小鼠肿瘤组织中ABL和JNK蛋白的表达水平，对照组和Ad-LacZ组小鼠肿瘤组织中ABL和JNK蛋白表达水平较低，照射组、Ad-Rb94组和联合组小鼠肿瘤组织中ABL和JNK蛋白表达水平升高；与对照组比较，Ad-Rb94组和联合组小鼠肿瘤组织中ABL和JNK蛋白表达水平明显升高 (P < 0.01)。见图 2。

Lane 1: Control group; Lane 2: Ad-lacZ group; Lane 3: Radiation group; Lane 4: Ad-Rb94 group; Lane 5: Combination group. 图 2 各组荷瘤裸小鼠肿瘤组织中ABL和JNK蛋白表达电泳图 Figure 2 Electrophoregram of expressions of ABL and JNK proteins in tumor tissue of tumor-bearing nude mice in various groups

图选项

于治疗的第18天对荷瘤裸小鼠肿瘤进行病理分析，对照组和Ad-LacZ组小鼠食管癌细胞生长活跃，而Ad-Rb94组和照射组小鼠肿瘤细胞出现生长抑制和凋亡；与其他组比较，联合组小鼠肿瘤组织有较少的核分裂和较浅的核深染。见表 2。

恶性肿瘤的主要治疗方法包括手术、放疗、化疗和分子靶向治疗。新兴的基因治疗因其高度特异性成为肿瘤治疗的理想途径^[6-7]。近年来，放疗与基因治疗联合应用逐渐成为肿瘤治疗的重要发展趋势。放疗既可有效地控制肿瘤的生长，降低肿瘤负荷，又可促进基因载体的高效肿瘤靶向转移，为基因治疗疗效的发挥创造有利条件；而基因的导入又可增强放疗疗效，放疗与基因治疗联合应用可显著提高肿瘤治疗的效果^[8-10]。

Rb基因是1种抑癌基因，其至少影响2种控制细胞死亡的蛋白而发挥作用，即ABL和JNK。Rb蛋白的C末端口袋区与ABL结合^[11]，与许多刺激细胞死亡通路的下游底物相互作用^[12-13]。ABL在照射的数分钟内被激活，但在Rb蛋白表达的情况下，ABL的激活能保持到照射后的48h，这个时间与开始出现细胞死亡的时间相一致^[14]。Rb蛋白的C末端是与JNK相互作用的位点^[15]，JNK的激活依赖Rb蛋白的存在，激活发生在照射后8 h之内。本研究结果显示:与对照组和Ad-LacZ组比较，Ad-Rb94组和联合组荷瘤裸小鼠肿瘤组织中ABL和JNK的蛋白表达呈上升趋势。这一结果说明：Rb94转染入食管癌细胞后，Rb蛋白激活了与之结合的控制细胞死亡的2种蛋白，即ABL和JNK的活性。本实验裸小鼠肿瘤接受的放疗是在照射后24 h，病理分析显示：联合放射组荷瘤裸小鼠肿瘤细胞生长抑制率高于Ad-Rb94组和照射组。上述结果均提示：转染的外源Rb94可能增加放射电离辐射诱导的与ABL和JNK相关的细胞凋亡。

本研究将食管癌K150细胞接种裸小鼠建立肿瘤模型，采用本文作者已经成功构建的Ad-Rb94重组腺病毒，观察Rb94基因联合γ射线放疗后荷瘤裸小鼠肿瘤的生长和瘤体的体积。在肿瘤异种移植物研究中，肿瘤体积通常是通过带着外部皮肤测量肿瘤外部而计算得到的，这种计算方法不如剥去皮肤后测量肿瘤内部三个维度的方法准确^[16]。但此方法的优点是处死动物前可以重复测量，并且能够避免皮肤的直接损伤。本研究采用测量肿瘤外部的方法计算出瘤体体积，结果显示：Ad-Rb94组、照射组和联合组肿瘤生长速度缓慢，随着治疗的进行联合组肿瘤体积缩小最明显；Ad-Rb94组和照射组肿瘤生长抑制率分别为57.84%和38.20%；与前两者比较，联合组抑瘤率最高，达81.16%。而且病理学检查结果显示：联合组肿瘤细胞出现生长抑制和凋亡，核分裂最少。上述结果均说明：Rb94基因或照射均能抑制肿瘤的生长，而Rb94基因联合放射电离辐射对荷瘤裸小鼠肿瘤的抑瘤效应优于单独Rb94基因或单独照射处理，具有协同作用。这一结论与基因联合放射电离辐射对肿瘤细胞的生长具有协同抑制效应的文献^[17-18]报道结果相一致。

课题组前期实验^[19]显示：Rb94基因联合电离辐射对体外食管癌K150细胞的生长具有显著的抑制效应。本研究通过观察Rb94基因联合电离辐射对裸小鼠种植瘤生长的影响，也发现Rb94基因与放疗联合应用的抑瘤效应明显高于单独Rb94基因或单独照射处理。前期体外结果与本研究体内结果一致说明：基因联合放疗对肿瘤生长具有协同抑瘤效应，产生较好的治疗效果。本研究为肿瘤的基因治疗联合放疗研究以及今后的临床应用奠定了基础。