山葡萄(Vitis amurensis Rupr)也称东北山葡萄，又名野葡萄，为葡萄科落叶藤本，主要分布在我国东北三省和内蒙古等地^[1]，资源丰富，可药食两用。目前，山葡萄主要用来酿酒，在其加工过程中会产生大量的山葡萄籽，山葡萄籽中含有丰富的多酚类物质。研究^[2-3]表明：葡萄籽提取物中多酚类物质在体内的抗氧化效果约为维生素C的20倍，维生素E的50倍，是迄今为止发现的植物来源中最高效的抗氧化剂之一。因此，葡萄籽多酚的提取和应用备受国内外学者^[4-7]的关注。但在相关文献中葡萄多酚的提取大多采用传统溶剂浸提法，该法提取时间长，溶剂消耗量大，提取效率低。近年来，超声波提取法在多酚提取方面的应用越来越广泛，该方法利用超声波的机械破碎和空化效应，能加速有效成分的扩散和溶解，减少杂质成分的溶出，且避免高温对多酚成分的破坏，能最大程度保持有效成分活性，具有提取时间短、高效率、温度低和多酚结构没有破坏等优点^[8-10]。目前，超声波辅助乙醇提取山葡萄籽多酚的方法尚未见报道。本文作者采用超声波辅助乙醇提取法，对酿酒后山葡萄籽中多酚类物质进行提取，旨在寻找一种低成本、高效率的山葡萄籽多酚提取方法，为山葡萄籽的进一步开发和合理利用提供参考。

酿酒山葡萄籽(吉林省柳河县酒厂提供)，没食子酸对照品(中国药品生物制品检定所提供)，乙醇和碳酸钠等试剂均为国产分析纯。

AB204-E分析天平(瑞士梅特勒公司), KQ3200DE型医用数控超声波清洗器(江苏省昆山市超声仪器有限公司)，SHHW21-Cr三用电热恒温水箱(北京长安科学仪器厂)，RE-52A旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)，722-可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)，D2F-6020型真空干燥箱(上海博迅实业有限公司)。

收集酿酒后的山葡萄籽，进行挑选、清洗、自然风干后，粉碎至60目，得到山葡萄籽粉末，备用。

取山葡萄籽粉末适量，置入锥形瓶中，按一定的料液比加入一定比例的乙醇溶液，在一定温度、功率和时间下，超声提取，提取液滤过，定容至刻度，作为样品溶液，待测。

在料液比为1:8，温度为45℃，超声波功率为120W，超声30 min，提取1次的条件下，计算乙醇浓度分别为20%、40%、60%、80%和95%时山葡萄籽多酚的提取率。

在料液比为1:8，乙醇浓度为60%，温度为45℃，超声波功率为120W，提取1次的条件下，计算超声时间分别为10、20、30、40和60 min时山葡萄籽多酚的提取率。

在料液比为1:8，乙醇浓度为60%，超声波功率为120W，超声30 min，提取1次的条件下，计算温度分别为25℃、35℃、45℃、55℃和65℃时山葡萄籽多酚的提取率。

在乙醇浓度为60%，温度为45℃，超声波功率为120W，超声30 min，提取1次的条件下，计算料液比分别为1:4、1:6、1:8、1:10和1:12时山葡萄籽多酚的提取率。

在料液比为1:8，乙醇浓度为60%，温度为45℃，超声波功率为120W，超声30 min的条件下，计算提取次数分别为1、2、3、4和5次时山葡萄籽多酚的提取率。

在料液比为1:8，乙醇浓度为60%，温度为45℃，超声30 min的条件下，计算超声功率分别为50、60、80、100和120W时山葡萄籽多酚的提取率。

采用Folin-Ciocalteu比色法^[11]对山葡萄籽提取物中总多酚的含量进行测定。精密量取各提取样品溶液0.5 mL，分别置50 mL容量瓶加水稀释并定容至刻度；再精密量取1mL稀释溶液置10 mL容量瓶中；加蒸馏水3 mL，摇匀；再加FC显色剂1 mL，摇匀；8 min内各加入20%碳酸钠溶液3 mL，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，室温下避光放置2h。以相应试剂为空白对照，在760 nm处测定吸光度(A)值，比较各提取样品的A值。

样品溶液的A值随乙醇浓度的增加先上升后下降。当乙醇浓度小于60%时，样品溶液A值逐渐增大，乙醇溶液浓度达到60%时，A值最大，表明提取率最高，而乙醇浓度高于60%后样品溶液A值呈缓慢下降趋势。因为乙醇浓度进一步升高时，溶剂与多酚极性差异增大，根据相似相溶原理，醇溶性杂质等亲脂性成分溶出量增加，与多酚类物质竞争溶剂结合，从而导致山葡萄籽多酚提取率下降，另外提取溶剂浓度越大，生产成本越高，故本实验选择60%的乙醇为提取溶剂。见图 1。

图 1 不同浓度乙醇时山葡萄籽多酚提取率 Figure 1 Extraction rates of polyphenols with different concentrations of ethanol

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超声时间在10~30 min内，样品溶液A值呈逐渐增加趋势；当超声时间为30 min时，样品溶液A值最大；超声时间从30 min增加至60 min时，样品溶液A值呈下降趋势。说明超声时间达到30 min时，山葡萄籽多酚化合物的浸出已经很充分，提取量接近饱和，再延长超声时间无明显效果，反而可能有更多的杂质溶出，且提取时间增加可以加速多酚的氧化，从而使产品的有效成分含量减小，综合考虑时间、耗能等因素，超声时间宜选用30 min。见图 2。

图 2 不同提取时间时山葡萄籽多酚的提取率 Figure 2 Extraction rates of polyphenols at different extraction time

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当温度从25℃增加至45℃时，样品溶液A值随温度的增加而增大，但当温度继续增加时，A值逐渐减小，提取率下降。原因可能是山葡萄籽多酚物质在高温下不稳定，易被氧化分解破坏，致使提取出来的多酚含量下降，而温度过低不利于超声的空化作用，降低山葡萄籽多酚的提取效果，因此最佳提取温度宜选用45℃。见图 3。

图 3 不同提取温度时山葡萄籽多酚的提取率 Figure 3 Extraction rates of polyphenols at different extraction temperatures

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当料液比从1:4增加至1:8时，多酚的提取率随之增加；当料液比达到1：8时，提取率最大；之后随着料液比的增大，多酚的提取效果反而下降。可能是杂质的溶出间接降低了多酚的提取量，同时考虑到提取溶剂的用量过多，能耗大，后续浓缩、过滤和干燥等工作耗时长，因此最佳料液比选择为1:8。见图 4。

图 4 不同料液比时山葡萄籽多酚的提取率 Figure 4 Extraction rates of polyphenols with different material/liquid ratios

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随着提取次数增加，合并提取液后多酚提取率增大，但增加趋势不明显，当提取次数达3次时，多酚提取率就不再增加，之后随提取次数的增加提取率反而下降。一方面由于提取液放置太久多酚易氧化，另一方面提取次数多，合并提取液浓缩时间长，考虑到实验成本和工作时间因素，选择提取次数为2~3次为宜。见图 5。

图 5 不同提取次数时山葡萄籽多酚的提取率 Figure 5 Extraction rates of polyphenols with different extraction times

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随着超声功率增加，样品溶液A值增大，提取率增加。在观察范围内，120 W时样品溶液A值达到最大值。超声波功率的大小直接影响超声波空化效应，进而影响山葡萄籽多酚的提取效果，增大超声波功率有助于目标产物的提出，但超声波功率过大，其空化效应大幅度增强，容易破坏多酚类物质，提取率下降，且结合实验室条件，本实验选择超声功率为120 W。见图 6。

图 6 不同超声功率时山葡萄籽多酚的提取率 Figure 6 Extraction rates of polyphenols with different ultrasonic powers

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在单因素实验基础上，选取超声温度、超声时间、料液比和超声次数作为考察因素，进行4因素3水平的正交试验，观察山葡萄籽粗提物中多酚含量的变化，对其提取条件进行优化，确定最佳提取条件。因素与水平设计见表 1，正交试验结果见表 2。

由表 2可知：极差分析得到山葡萄籽多酚提取的最佳组合为A3B1C2D2，即超声温度为50℃，超声时间为30 min，料液比为1:8，提取2次，在此条件下提取得到的山葡萄籽提取物中多酚含量最高。为了进一步确定各因素对山葡萄籽多酚含量的影响，对表 2结果进行方差分析，四因素中超声温度对多酚含量的影响最为明显，超声时间、料液比和超声次数对多酚的含量无明显影响，各因素对多酚含量的影响程度为A＞C＞B>D，即超声温度＞料液比＞超声时间＞超声次数。见表 3。

为进一步对最佳组合条件进行验证，按正交试验确定的最佳工艺条件对山葡萄籽多酚进行3次平行试验提取，计算山葡萄籽多酚提取物的得率和含量。按正交试验确定的最佳工艺条件提取，所得提取物多酚含量均高于正交试验结果，进一步验证了最佳组合条件的正确性和有效性，说明该方法重复性好，工艺稳定可行。见表 4。

按照正交试验确定的最佳提取条件，采用超声波提取法和参考文献[12]中所用最佳条件的传统溶剂提取法对酿酒山葡萄籽进行多酚提取，通过计算山葡萄籽多酚提取物的得率和含量，进行2种提取方法的比较。与传统溶剂提取法比较，超声波辅助提取山葡萄籽多酚的提取时间明显缩短，提取溶剂用量减少，且所得山葡萄籽多酚得率(11.71%)比传统提取方法(10.20%)略高，多酚含量为32.85%，提高了4.37%。见表 5。

山葡萄在我国种植面积大，产量高，野生和种植资源丰富。山葡萄主要用来酿酒和制作饮品，在其加工过程中会产生大量的葡萄皮渣等废弃物，其中葡萄籽占很大比率，约为葡萄干皮渣的65%^[13]。一直以来，山葡萄籽作为加工后的副产品大多数被丢弃，没有很好地被开发和利用，不仅造成了资源的浪费而且污染环境。研究^[14-15]显示：葡萄籽中含有大量的多酚类物质，具有抗氧化、抗衰老、抗辐射、降血压、消炎防肿和抗癌等多种生物活性，是一类极具开发前景的天然抗氧化物质。酿酒后的山葡萄籽作为葡萄多酚的重要资源，越来越受到人们的关注。

如何高效提取葡萄籽多酚成为了当前研究的热点之一。常见的植物多酚提取方法有溶剂浸提法、超声波辅助提取法、微波辅助提取法、超临界流体存取法和离子沉淀法等^[16-17]，其中传统的山葡萄籽多酚提取方法为溶剂浸提法，该方法仪器设备要求不高、实验过程比较简单，但存在溶剂消耗量大、毒性大、提取时间长且效率低等缺点^[18]。本研究采用超声波辅助乙醇提取山葡萄籽多酚，综合单因素实验和正交试验优化法，确定多酚提取最佳工艺条件为乙醇浓度60%，超声温度50℃，超声时间30 min，超声功率120W，料液比1:8，超声提取2次。且超声波辅助提取时，山葡萄籽多酚得率和含量均高于传统有机溶剂浸提，综合考虑时间和能耗因素，超声波辅助提取山葡萄籽多酚具有高效、环保和节能等优点，有利于提升山葡萄籽废渣的附加值，具有极大的社会经济价值。该方法不仅效率高，有机溶剂用量少，成本低，而且在很大程度上保持了山葡萄籽的有效活性成分。从节能与资源综合利用等角度来看，超声波辅助提取山葡萄籽多酚比传统的有机溶剂浸提法更具有优势。

本实验结果表明：超声波辅助乙醇提取法与传统溶剂浸提法比较，不仅大大缩短了提取时间，节约了成本，而且多酚结构不易被破坏，多酚提取得率和含量均有所提高，效果优于传统溶剂浸提法，值得推广应用。