2017, Vol. 43扩展功能
文章信息
- 王睿斌, 赫东芸, 邹积艳, 盛敏佳
- WANG Ruibin, HE Dongyun, ZOU Jiyan, SHENG Minjia
- DC-CIK免疫治疗对卵巢癌患者凝血功能及D-二聚体水平的影响
- Influence of DC-CIK immunotherapy in blood coagulation function and D-dimer levels in patients with ovarian cancer
- 吉林大学学报(医学版), 2017, 43(01): 120-124
- Journal of Jilin University (Medicine Edition), 2017, 43(01): 120-124
- 10.13481/j.1671-587x.20170124
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文章历史
- 收稿日期: 2016-08-02
2. 吉林大学中日联谊医院妇产科, 吉林 长春 130033
2. Department of Obstetris and Gynecology, China-Japan Union Hospital, Jilin University, Changchun 130033, China
恶性肿瘤患者往往伴有高凝，可能出现凝血功能相关指标异常，这可能导致血栓性并发症的发生，高凝状态将直接关系到恶性肿瘤的转归。卵巢癌起病隐匿，确诊时常为晚期，预后不良，化疗为晚期及复发患者的主要治疗手段，但恶性肿瘤本身可加重患者高凝状态甚至形成血栓[1]。近年来，在恶性肿瘤治疗领域，免疫治疗的有效性逐渐得到认可，被美国科学杂志评为2013年度十大科学突破[2]。树突状细胞(dentritic cells, DC)与细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer cells, CIK)相互作用所诱发的免疫应答成为免疫抑瘤效应的中心环节。DC-CIK免疫治疗在卵巢癌中的应用也成为近年国内外研究的热点。本文作者探讨了DC-CIK细胞免疫治疗对卵巢癌患者凝血功能及D-二聚体水平的影响，从不同角度分析DC-CIK治疗对卵巢癌患者的有效性和安全性。
1 资料与方法 1.1 研究对象选择2014年7月-2015年12月在首都医科大学附属北京世纪坛医院行DC-CIK细胞免疫治疗的40例中晚期卵巢癌患者，年龄38~77岁。所有患者在DC-CIK治疗前后1月内均未接受放化疗。患者及其法定代理人知情并同意接受该治疗。入组患者治疗前血常规、尿常规及心电图正常，肝、肾功能各指标≤1.5倍正常值范围。所有患者在粒细胞集落刺激因子(G-CSF)动员前5d内及DC-CIK免疫治疗1个月后行凝血功能指标及D-二聚体水平的检测。
1.2 主要试剂白细胞介素2(IL-2)为北京双鹭药业股份有限公司产品，CD3单抗为北京同力海源生物技术开发公司产品，干扰素γ为上海凯茂生物医药有限公司产品，肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素4(IL-4)和G-CSF为厦门特宝生物股份有限公司产品，纤维蛋白原(FIB)、凝血酶原时间(PT)和D二聚体检测试剂盒均为贝克曼库尔特有限公司产品。
1.3 DC-CIK免疫治疗患者签署知情同意书后予以G-CSF皮下注射刺激造血，当外周血白细胞>1×109L-1后，抽取外周抗凝血50 mL行细胞培养，当细胞数量大于1×109时收集细胞回输给患者，隔日1次，3次为1个周期。
1.4 DC-CIK细胞悬液的制备取新鲜外周抗凝血50mL用0.9%生理盐水1：1稀释，缓慢加入到淋巴细胞分层液表面上，无菌封盖，400g离心30min，轻轻吸细胞层，用生理盐水1500g离心5min，洗3次。细胞计数后，每瓶5×106mL-1，将细胞加入完全培养基(含2.5%自体血浆的1640培养基)中，每瓶60~80mL，置于含5%的CO2、37℃培养箱中培养2~4 h。悬浮细胞进行CIK培养，贴壁细胞进行DC培养。① CIK培养：合并悬浮细胞培养液并移入完全培养基(含自体血浆的AIM-V培养基)，1L AIM-V培养基中加入各种细胞因子，包括干扰素-γ 1mL、IL-2 1200μL和CD3单抗10μL，并于首次加1支肝素，置于5% CO2培养箱中培养。② DC培养：贴壁细胞加入DC培养基30mL和各种细胞因子，包括TNF-α 30μL、IL-4 60μL和GM-CSF 60μL，置于5% CO2培养箱中培养。
隔日显微镜下观察，根据细胞状态，补充完全培养基和细胞因子(含2.5%自体血浆AIM-V加入IL-2调节终浓度1 mL·L-1)。回收细胞后生理盐水低速离心，洗涤3次。用适量含有12.5%血浆蛋白的生理盐水重悬细胞，回输患者进行DC-CIK免疫治疗。
1.5 统计学分析采用SPSS17.0统计软件进行统计学分析。患者凝血功能各指标D-二聚体水平以x±s表示，治疗前不同临床特征患者D-二聚体水平和凝血功能指标比较采用Mann-Whitney检验，各指标比较采用Wilcoxon符号秩和检验。D-二聚体水平正常患者比例治疗前后比较采用McNemar检验。检验水准为α=0.05。
2 结果 2.1 卵巢癌患者一般情况共有40例卵巢癌患者纳入本研究，其中≤60岁的患者21例，>60岁的患者19例。所有患者按FIGO临床病理分期，Ⅱ期患者5例，Ⅲ期患者4例，Ⅳ期患者31例。
2.2 DC-CIK免疫治疗前后卵巢癌患者D-二聚体水平及凝血功能指标DC-CIK细胞回输后，卵巢癌患者D-二聚体水平从1 063μg·L-1降低至485μg·L-1，治疗前后比较差异有统计学意义(P < 0.05)；FIB水平也降低了10%，治疗前后比较差异有统计学意义(P < 0.05)；但部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原活动度(PTA)、国际标准化比值(INR)和凝血酶原时间(PT-S)治疗前后比较差异无统计学意义(P＞0.05)。见表 1。
| (n=40, x±s) | ||||||
| Time | D-dimer[ρB/(μg·L-1)] | APTT (t/s) | FIB[ρB/ (g·L-1)] | PTA (η/%) | INR | PT-S (t/s) |
| Before treatment | 1 063.85±1 121.20 | 30.96±3.41 | 3.63±0.96 | 105.78±24.74 | 1.01±0.16 | 11.17±2.31 |
| After treatment | 485.70±433.17* | 30.17±3.16 | 3.29±0.83* | 102.08±27.05 | 1.02±0.22 | 11.06±2.42 |
| * P < 0.05 compared with before treatment. | ||||||
临床Ⅳ期卵巢癌患者回输DC-CIK细胞后，D-二聚体水平从1252μg·L-1降至547μg·L-1，FIB原水平从3.88g·L-1降至3.48g·L-1, 治疗前后比较差异有统计学意义(P < 0.05)；临床Ⅱ、Ⅲ期患者回输DC-CIK后，D-二聚体水平降低了34%，FIB水平降低了5%，治疗前后比较差异有统计学意义(P < 0.05)。临床Ⅳ期卵巢癌患者D-二聚体和纤维蛋白原水平降低程度较临床Ⅱ、Ⅲ期患者更为明显。APTT、PTA、INS和PT-S在不同临床分期的患者中治疗前后比较均无明显变化(P＞0.05)。见表 2。
| (n=40, x±s) | ||||||
| Clinical stage | D-dimer[ρB/(μg·L-1)] | APTT (t/s) | FIB[ρB/(g·L-1)] | PTA (η/%) | INR | PT-S (t/s) |
| Ⅳ stage | ||||||
| Before treatment | 1 252.87±1 206.80 | 30.84±3.43 | 3.88±0.87 | 101.84±24.60 | 1.02±0.17 | 11.41±2.48 |
| After treatment | 547.00±467.58* | 30.32±3.27 | 3.48±0.79* | 105.13±22.14 | 0.98±0.10 | 10.86±1.31 |
| Ⅱ-Ⅲ stage | ||||||
| Before treatment | 412.78±227.04 | 31.38±3.52 | 2.75±0.75 | 119.33±21.17 | 0.97±0.12 | 10.36±1.42 |
| After treatment | 272.22±169.47* | 29.64±2.86 | 2.62±0.62* | 91.56±39.59 | 1.15±0.41 | 11.77±4.63 |
| * P < 0.05 compared with before treatment. | ||||||
在≤60岁的卵巢癌患者中，回输DC-CIK细胞后D-二聚体水平降低49%，治疗前后比较差异有统计学意义(P < 0.05)；在>60岁卵巢癌患者中，回输DC-CIK后D-二聚体降低57.5%，同时FIB降低13.5%，治疗前后比较差异有统计学意义(P < 0.05)。>60岁卵巢癌患者D-二聚体和FIB水平降低程度较≤60岁的卵巢癌患者更为明显。不同年龄分组卵巢癌患者其他凝血指标治疗前后比较均无明显变化(P＞0.05)。见表 3。
| (n=40, x±s) | ||||||
| Age (year) | D-dimer[ρB/(μg·L-1)] | APTT (t/s) | FIB[ρB/(g·L-1)] | PTA (η/%) | INR | PT-S (t/s) |
| ≤60 | ||||||
| Before treatment | 740.52±769.29 | 30.39±3.44 | 3.44±0.95 | 115.33±17.95 | 0.95±0.07 | 10.27±0.97 |
| After treatment | 378.29±265.07* | 29.78±2.67 | 3.26±0.69 | 104.81±31.59 | 1.03±0.29 | 11.00±3.17 |
| > 60 | ||||||
| Before treatment | 1 421.21±1 345.13 | 31.59±3.35 | 3.84±0.95 | 95.21±27.28 | 1.08±0.20 | 12.17±2.93 |
| After treatment | 604.42±547.85* | 30.60±3.64 | 3.32±0.98* | 99.05±21.40 | 1.01±0.09 | 11.13±1.26 |
| * P < 0.05 compared with before treatment | ||||||
以D-二聚体水平 < 243 μg·L-1做为正常值，在DC-CIK免疫治疗前，10%的卵巢癌患者血清中D-二聚体水平 < 243 μg·L-1，给予DC-CIK免疫治疗后D-二聚体水平 < 243 μg·L-1患者的比例增加至35%。与治疗前比较，治疗后D-二聚体水平正常患者的比例明显增加(P < 0.05)。
3 讨论在肿瘤细胞生长、转移的过程中，患者的凝血机制不断被激活，肿瘤细胞通过分泌细胞因子启动凝血系统，同时也产生肿瘤相关促凝物质直接激活凝血因子，因此患者常呈高凝状态。文献[3]报道：90%以上肿瘤患者的实验室检查提示凝血系统异常，尤其是血浆FIB及D-二聚体水平增高，与肿瘤高负荷有关。凝血异常导致肿瘤患者患静脉血栓的风险是健康人的7倍，也是该人群的第二大死因[4]。D-二聚体是FIB单体的降解产物，其水平升高特异性反映继发性纤溶活性的增高和凝血酶生成增加，标志着机体凝血和纤溶系统的双重激活。D-二聚体可作为晚期肺癌、乳腺癌、结直肠癌及胰腺癌的独立不良预后因素[5-7]。有研究[8]报道：在预测恶性肿瘤患者生存率方面，D-二聚体比癌胚抗原(CEA)更有意义。D-二聚体水平的变化在一定程度上代表肿瘤活跃程度，D-二聚体水平的升高往往预示着肿瘤的进展[9-10]，D-二聚体水平的降低也客观代表肿瘤有所控制。研究[11]表明：接受伊马替尼治疗的胃肠间质瘤患者，如果患者无肿瘤复发的临床表现、D-二聚体水平低于900 μg·L-1且存在下降趋势，则说明治疗有效，据此可延长影像学复查周期。
放疗和化疗是肿瘤患者治疗的重要手段，但放化疗可直接导致机体内皮细胞损伤，引发免疫应答，引起肿瘤促凝物质和细胞因子等的释放，激活凝血系统，引起机体凝血障碍，从而增加静脉血栓的风险[12]。因此，临床上有待于探索一种在治疗有效的同时又能降低血栓风险的方法。自2009年美国FDA批准了全球第一个免疫治疗产品以来，免疫治疗对于肿瘤治疗的有效性逐步得到肯定，目前淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)、抗CD3单克隆抗体激活的杀伤细胞(CD3AK)、CIK、自然杀伤细胞(NK)和DC-CIK等免疫细胞都被用于抗肿瘤的治疗中，其中DC-CIK细胞在国内的应用最为广泛。DC细胞作为最重要的抗原递呈细胞，在介导免疫细胞的抗肿瘤活性中起着至关重要的作用。CIK细胞是非组织相容性复合物和非T细胞受体限制性的免疫活性细胞[13]，兼具NK细胞的非MHC限制性抗肿瘤作用和T细胞的抗肿瘤活性，DC-CIK联合培养的抗肿瘤活性更强、增殖速度更快、凋亡速度更慢，对多药耐药的肿瘤细胞的疗效更好[14-15]。已有多家国内外研究机构报道DC-CIK细胞治疗的有效性[16-18]。
本研究探讨采用DC-CIK细胞免疫治疗后卵巢癌患者凝血功能和D-二聚体水平的变化，从独特视角客观评价DC-CIK细胞免疫治疗的安全性及有效性。CIK细胞主要通过3种途径发挥抗肿瘤作用：①直接杀伤肿瘤细胞。CIK细胞通过释放颗粒酶/穿孔素等毒性颗粒，导致肿瘤细胞的裂解。②释放大量细胞因子(如干扰素γ和IL-2等)，不但对肿瘤细胞有直接抑制作用，而且可通过调节机体免疫反应间接杀伤肿瘤细胞。③诱导肿瘤细胞凋亡。CIK细胞表达的Ⅱ型跨膜糖蛋白(FasL)通过与肿瘤细胞表达的Ⅰ型跨膜糖蛋白(Fas)结合，诱导肿瘤细胞的凋亡。⑤与放化疗比较。DC-CIK细胞治疗不直接损伤血管内皮细胞，所分泌的主要细胞因子除TMF-α作用于血管内皮细胞外均不作用于血管内皮细胞。
本研究结果表明：卵巢癌患者治疗前90%患者D-二聚体水平高于正常值，尤其是晚期(临床Ⅳ期)卵巢癌患者，可高达1252.87 μg·L-1，这与相关文献报道一致；年龄大于60岁的老年患者和晚期患者治疗前基线检查均表现出凝血功能异常程度更严重，这与晚期患者肿瘤负荷高、老年患者心血管方面基础疾病多有关；治疗后D-二聚体和FIB水平降低，在治疗前只有10%的患者血清中D-二聚体水平正常，治疗后D-二聚体水平正常患者比例增加到35%, 其中Ⅳ期患者比Ⅱ、Ⅲ期患者改变更加明显，年龄大于60岁的老年患者较≤60岁患者这一改变更加明显，按多数学者认为的D-二聚体水平下降与肿瘤活跃度下降正相关这一理论分析，本研究结果客观说明DC-CIK细胞治疗有效。
综上所述，本研究表明：DC-CIK细胞免疫治疗后卵巢癌患者D-二聚体水平明显下降，说明该治疗有效，同时可改善卵巢癌患者的过度纤溶，降低静脉血栓风险。
| [1] | Faiz AS, Khan I, Beckman MG, et al. Characteristics and risk factors of cancer associated venous thromboembolism[J]. Thromb Res, 2015, 136(3): 535–541. DOI:10.1016/j.thromres.2015.06.036 |
| [2] | Couzin-Frankel J. Breakthrough of the year 2013.Cancer immunotherapy[J]. Science, 2013, 342(6165): 1432–1433. DOI:10.1126/science.342.6165.1432 |
| [3] | Dammacco F, Vacca A, Procaccio P, et al. Cancer-related coagulopathy (Trousseau's syndrome):review of the literature and experience of a single center of internal medicine[J]. Clin Exp Med, 2013, 13(2): 85–97. DOI:10.1007/s10238-013-0230-0 |
| [4] | Tas F, Ciftci R, Kilic L, et al. Clinical and prognostic significance of coagulation assays in melanoma[J]. Melanoma Res, 2012, 22(5): 368–395. DOI:10.1097/CMR.0b013e328357be7c |
| [5] | Liu P, Zhu Y, Liu L. Elevated pretreatment plasma D-dimer levels and platelet counts predict poor prognosis in pancreatic adenocarcinoma[J]. Oncol Targets Ther, 2015, 4(8): 1335–1340. |
| [6] | Yamamoto M, Yoshinaga K, Matsuyama A, et al. Plasma D-dimer level as a mortality predictor in patients with advanced or recurrent colorectal cancer[J]. Oncology, 2012, 83(1): 10–15. DOI:10.1159/000338329 |
| [7] | Inanc M, Er O, Karaca H, et al. D-dimer is a marker of response to chemotherapy in patients with metastatic colorectal cancer[J]. BUON, 2013, 18(2): 391–397. |
| [8] | Lal I, Dittus K, Holmes CE. Platelets, coagulation and fibrinolysis in breast cancer progression[J]. Breast Cancer Res, 2013, 15(4): 207. DOI:10.1186/bcr3425 |
| [9] | Zhang X, Ran Y. Prognostic role of elevated platelet count in patients with lung cancer:a systematic review and meta-analysis[J]. Int J Clin Exp Med, 2015, 8(4): 5379–5387. |
| [10] | Khalil J, Bensaid B, Elkacemi H, et al. Venous thromboembolism in cancer patients:an underestimated major health problem[J]. World J Surg Oncol, 2015, 13: 204. DOI:10.1186/s12957-015-0592-8 |
| [11] | Afshar M, Hamilton P, Seligmann J, et al. Can D-Dimer Measurement Reduce the Frequency of Radiological Assessment in Patients Receiving Palliative Imatinib for Gastrointestinal Stromal Tumor (GIST)[J]. Cancer Invest, 2015, 33(8): 347–353. DOI:10.3109/07357907.2015.1047504 |
| [12] | Rhode S, Paul MC, Martens E, et al. Simulation of haemodynamic flow in head and neck cancer chemotherapy[J]. Biomed Eng Online, 2011, 10: 104. DOI:10.1186/1475-925X-10-104 |
| [13] | Bremm M, Huenecke S, Zimmermann O, et al. In-vitro influence of mycophenolate mofetil (MMF) and ciclosporin A (CsA) on cytokine induced killer (CIK) cell immunotherapy[J]. J Transl Med, 2016, 14: 264. DOI:10.1186/s12967-016-1024-4 |
| [14] | Yang L, Ren B, Li H, et al. Enhanced antitumor effects of DC-activated CIKs to chemotherapy treatment in a single cohort of advanced non-small-cell lung cancer patients[J]. Cancer Immunol Immunother, 2013, 62(1): 65–73. DOI:10.1007/s00262-012-1311-8 |
| [15] | Wang S, Wang Z. Efficacy and safety of dendritic cells co-cultured with cytokine-induced killer cells immunotherapy for non-small-cell lung cancer[J]. Int Immunopharmacol, 2015, 28(1): 22–28. DOI:10.1016/j.intimp.2015.05.021 |
| [16] | Ren J, Di L, Song G, et al. Selections of appropriate regimen of high-dose chemotherapy combined with adoptive cellular therapy with dendritic and cytokine-induced killer cells improved progression-free and overall survival in patients with metastatic breast cancer:reargument of such contentious therapeutic preferences[J]. Clin Transl Oncol, 2013, 15(10): 780–788. DOI:10.1007/s12094-013-1001-9 |
| [17] | Zhan HL, Gao X, Pu XY, et al. A randomized controlled trial of postoperative tumor lysate-pulsed dendritic cells and cytokine-induced killer cells immunotherapy in patients with localized and locally advanced renal cell carcinoma[J]. Chin Med J, 2012, 125(21): 3771–3777. |
| [18] | Lee JH, Lee JH, Lim YS, et al. Adjuvant immunotherapy with autologous cytokine-induced killer cells for hepatocellular carcinoma[J]. Gastroenterology, 2015, 148(7): 1383–1391. DOI:10.1053/j.gastro.2015.02.055 |