2017, Vol. 43扩展功能
文章信息
- 邱爽, 刘仕成, 彭博, 雷洁, 李日, 白烨, 于雅琴, 朱筱娟, 刘雅文, 姜慧轶
- QIU Shuang, LIU Shicheng, PENG Bo, LEI Jie, LI Ri, BAI Ye, YU Yaqin, ZHU Xiaojuan, LIU Yawen, JIANG Huiyi
- PLA2G4C基因多态性与北方汉族儿童孤独症谱系障碍的关联性分析
- Analysis on association of PLA2G4C gene polymorphisms with autism spectrum disorder in North Han Chinese children
- 吉林大学学报(医学版), 2017, 43(01): 80-84
- Journal of Jilin University (Medicine Edition), 2017, 43(01): 80-84
- 10.13481/j.1671-587x.20170116
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文章历史
- 收稿日期: 2016-05-05
2. 吉林大学第一医院儿科, 吉林 长春 130021;
3. 吉林大学第一医院二部儿科, 吉林 长春 130031;
4. 东北师范大学生命科学学院遗传与细胞研究所, 吉林 长春 130024
2. Department of Pediatrics, First Hospital, Jilin University, Changchun 130021, China;
3. Second Department of Pediatrics, First Hospital, Jilin University, Changchun 130031, China;
4. Institute of Cytology and Genetics, Northeast Normal University, Changchun 130024, China
孤独症谱系障碍(autism spectrum disorder, ASD)是一种严重影响儿童健康的神经发育障碍性疾病，由美国儿童精神科Leo Kanner医生于1943年首次提出[1]。ASD起病于婴幼儿期，一般3岁前发病，男性发病率为女性的4~5倍，主要表现为社会交往障碍、交流障碍、刻板重复的行为方式和兴趣[2-3]。ASD的患病率呈上升趋势，人群流行病学研究[4-5]显示：在一些发达国家，2000年ASD患病率为3.08‰，到2009年上升到10.00‰。目前，我国缺乏有关ASD大规模统一的流行病学调查报告。俞蓉蓉等[6]收集我国已有报道的2000-2010年10个省市ASD患病数据，结果显示：ASD总患病率为2.55‰。ASD的病因及发病机制尚不明确，双生子和家系研究[7]显示：遗传因素在ASD的发生过程中起重要作用；Sandin等[8]指出：ASD的遗传概率为50%，ASD患儿的同胞患ASD的风险增加10倍。近年来研究者越来越多地关注于影响大脑发育的基因与ASD之间的关系。PLA2G4C (phospholipase A2，group IVC)酶是胞浆型磷脂酶A2(cPLA2)家族中的一种，作为在中枢神经系统中起重要作用的基因之一，一方面通过其水解产物--花生四烯酸(arachidonic acid, AA)的作用影响神经发生和分化、神经可塑性和信号转导及学习和记忆等；另一方面通过AA生成的前列腺素E2(prostaglandins E2, PGE2)影响神经系统的功能，因此PLA2G4C基因可能是ASD的易感基因，而国内外关于该基因与ASD的关联研究较少。本研究首次检测了北方汉族儿童ASD患者的PLA2G4C基因，旨在探讨该基因的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)与ASD的关联，为ASD的病因研究提供新的线索。
1 资料与方法 1.1 资料来源采用病例-对照研究方法。病例组为2011-2013年吉林大学第一医院小儿神经康复科确诊的汉族ASD患儿，ASD诊断依据2013年美国精神病学会制定的《美国精神障碍诊断统计手册(第五版)》(DSM-Ⅴ)。共纳入85例ASD患儿及183名健康儿童。病例组男性68例，女性17例，年龄2~10岁，平均年龄(4±2)岁；对照组为同期于该科门诊进行常规儿童保健检查的健康儿童，其中男性148名，女性35名，年龄1~10岁，平均年龄(4±2)岁。2组研究对象年龄和性别构成比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经吉林大学第一医院伦理委员会批准，并获得2组研究对象父母或监护人的知情同意。
1.2 SNPs位点选择首先在HapMap数据库人类基因库中对19号染色体19q13.3区域的PLA2G4C基因上的SNPs位点进行检索并下载数据包，人群选择“CHB”，将数据导入Haploview4.2软件中，将“tagger”参数设置为：最小等位基因频率(MAF)>10%、r2 >0.8、D’=1，然后运行软件。共选择5个PLA2G4C基因多态性位点，分别为rs9226 (3′UTR)、rs1045376(3′UTR)、rs251684(Exon 6)、rs2307279(Exon 3)和rs156631(Exon 7)。
1.3 基因组DNA提取由研究对象父母或监护人签署知情同意书之后，抽取2组研究对象外周静脉血5mL，并将血样保存于负压管内，标注清楚姓名及编号，于-20℃冰箱保存。按照北京康为世纪生物科技有限公司的柱式凝固血液基因组试剂盒说明书，从外周静脉血中提取DNA。
1.4 基因型检测根据PubMed数据库检索得到的SNPs序列信息，采用Assay Designer 3.1软件对每个位点设计上下游引物，然后采用Sequenom Mass ARRAY平台进行基因型检测，主要涉及PCR扩增反应、SAP反应、单碱基延伸反应、树脂纯化、点样、上机检测和数据收集。
1.5 统计学分析采用SPSS21.0软件进行统计学分析。采用SNPStats在线分析程序进行Hardy-Weinberg (H-W)平衡定律检验、遗传模型分析、连锁不平衡分析和单体型分析。采用χ2检验分析病例组和对照组基因型及等位基因频数分布的差异。病例组和对照组研究对象年龄分布不符合正态分布，使用中位数及四分位数间距描述集中和离散趋势。
2 结果 2.1 H-W平衡定律检验在病例组和对照组中PLA2G4C 5个位点基因型频数分布均符合H-W平衡定律(P>0.05)。见表 1。
| NCBI SNP ID | Location | Genotyping rate (η/%) | Alleles (Major/Minor) | MAF (Case/Control) | P(HWE in case/control) |
| rs9226 | 3′UTR | 100.00 | A/T | 0.09/0.10 | 1.00/0.11 |
| rs1045376 | 3′UTR | 100.00 | C/T | 0.09/0.06 | 1.00/1.00 |
| rs251684 | Exon 6 | 98.88 | G/A | 0.32/0.31 | 0.22/0.60 |
| rs2307279 | Exon 3 | 100.00 | G/C | 0.33/0.32 | 0.81/0.39 |
| rs156631 | Exon 7 | 99.63 | C/T | 0.18/0.18 | 0.46/0.45 |
| HWE:Hardy-Weinberg equilibrium; MAF:Minor allele frequency; UTR:Untranslated regions. | |||||
病例组和对照组中PLA2G4C 5个位点的基因型和等位基因频数分布比较差异均无统计学意义(P>0.05)。病例组中无rs9226位点TT (突变纯合子)基因型患者，对照组中只有4人(2.2%)；在病例组和对照组中均无rs1045376位点TT基因型患者。见表 2。
| [n(η/%)] | ||||||||||||||||||||||||||||
| Group | rs9226 | rs1045376 | rs251684 | rs2307279 | rs156631 | |||||||||||||||||||||||
| AA | AT | TT | A | T | CC | CT | C | T | GG | GA | AA | G | A | GG | GC | CC | G | C | CC | CT | TT | C | T | |||||
| Control | 149(81.4) | 30(16.4) | 4(2.2) | 328(89.6) | 38(10.4) | 161(88.0) | 22(12.0) | 344(94.0) | 22(6.0) | 84(46.7) | 81(45.0) | 15(8.3) | 249(69.2) | 111(30.8) | 88(48.1) | 74(40.4) | 21(11.5) | 250(68.3) | 116(31.7) | 120(65.9) | 58(31.9) | 4(2.2) | 298(81.8) | 66(18.2) | ||||
| Case | 69(81.2) | 16(18.8) | 0(0.0) | 154(90.6) | 16(9.4) | 69(81.2) | 16(18.8) | 154(90.6) | 16(9.4) | 42(49.4) | 32(37.6) | 11(12.9) | 116(68.2) | 54(31.8) | 39(45.9) | 36(42.4) | 10(11.8) | 114(67.1) | 56(32.9) | 58(68.2) | 23(27.1) | 4(4.7) | 139(81.8) | 31(18.2) | ||||
| χ2 | 1.613 | 0.121 | 2.207 | 2.308 | 2.073 | 0.047 | 0.116 | 0.083 | 1.789 | 0.001 | ||||||||||||||||||
| P | 0.454 | 0.728 | 0.137 | 0.153 | 0.355 | 0.829 | 0.944 | 0.773 | 0.408 | 0.977 | ||||||||||||||||||
本研究采用SNPStats在线程序分析PLA2G4C基因5个位点的SNPs在显性模型、隐性模型、共显性模型、超显性模型和叠加模型5个遗传模型下与ASD的关联性，并同时将年龄和性别纳入分析中进行调整，根据赤道信息准则(akaike information criterion, AIC)选择最优模型。rs251684位点最优模型为超显性模型；rs2307279位点最优模型为显性模型；rs156631位点最优模型为隐性模型，由于rs9226位点在病例组中无TT基因型，对照组中的频数为2.2%，因此不能给出共显性模型和隐性模型，从余下的显性、超显性和叠加模型中选择最优模型为超显性模型；rs1045376位点在病例组和对照组中均无TT基因型，故只能给出杂合子与野生纯合子相比与ASD的关联。本研究结果显示：各位点基因SNPs与ASD均无关联(P>0.05)。最优模型结果见表 3。
| SNPs | Model | Genotype | OR (95%CI)* | P* |
| rs9226 | Overdominant | A/A-T/T | 1.00 | 0.62 |
| T/A | 1.19 (0.61-2.32) | |||
| rs1045376 | - | C/C | 1.00 | 0.14 |
| C/T | 1.72(0.85-3.49) | |||
| rs251684 | Overdominant | G/G-A/A | 1.00 | 0.26 |
| A/G | 0.74 (0.43-1.25) | |||
| rs2307279 | Dominant | G/G | 1.00 | 0.72 |
| G/C-C/C | 1.10 (0.65-1.84) | |||
| rs156631 | Recessive | C/C-C/T | 1.00 | 0.28 |
| T/T | 2.21 (0.54-9.07) | |||
| * OR (95%CI) and P values were adjusted for age and sex；“-”: No model. | ||||
rs251684、rs2307279和rs156631位点间连锁不平衡分析结果显示：3个位点间D′为0.0818~0.6698，r2为0.0031~0.4293。
2.5 PLA2G4C 3个位点单体型分析采用在线SNPStats在线程序分析PLA2G4C 3个位点组成的各个单体型与ASD之间的关联性，GGC单体型的频率最高为51.59%，故以该单体型为对照，其他单体型与该单体型比较与ASD均无关联(P>0.05)。见表 4。
| (x±s) | |||||
| Haplotype rs251684/rs2307279/rs156631 |
Frequency | OR (95%CI)* | P* | ||
| Total | Case | Control | |||
| GGC | 0.5159 | 0.4982 | 0.5179 | 1.00 | - |
| ACC | 0.1881 | 0.1614 | 0.2009 | 0.86 (0.50-1.49) | 0.59 |
| GGT | 0.0946 | 0.0937 | 0.0966 | 1.03 (0.49-2.18) | 0.94 |
| GCC | 0.0627 | 0.0834 | 0.0534 | 1.62 (0.72-3.65) | 0.24 |
| AGC | 0.0547 | 0.0775 | 0.0425 | 1.64 (0.69-3.92) | 0.26 |
| ACT | 0.0541 | 0.0747 | 0.0466 | 1.71 (0.69-4.24) | 0.25 |
| Rare | 0.0330 | 0.0111 | 0.0421 | 0.28 (0.04-2.21) | 0.23 |
| *OR (95%CI) and P values were adjusted for age and sex; Rare: Haplotypes with frequencies < 0.05. | |||||
ASD的病因及发病机制尚不明确，并且没有特异有效的治疗方法，预后较差，60%~70%患儿不能独立生活，终生需要照顾，给家庭和社会带来沉重的经济和精神负担，因此探索ASD的病因及发病机制，可为ASD的预防和早期干预提供可靠依据。
PLA2G4C位于人类染色体19q13.3，是cPLA2家族中唯一的一种与构成细胞膜相关的非钙离子依赖的亚型，在磷脂重构和AA代谢中起重要作用[9]，主要在脑、骨骼肌和心脏中表达[10-11]。AA作为PLA2G4C的水解产物之一，与二十二碳六烯酸(docosahexenoic acid，DHA)在神经系统中起至关重要的作用[12]。Yui等[13]研究结果显示：血浆DHA/AA比值升高，可以降低血浆铜蓝蛋白水平，而铜蓝蛋白对大脑有保护作用，因此铜蓝蛋白水平降低，将降低其对大脑的保护作用，从而使ASD患儿发生异常行为表现。AA还能通过环氧合酶通路进一步代谢生成PGE2[9]，PGE2作为内源性调节分子，在产后第2周小脑发育中起重要作用[14]。研究[15]表明：小脑发育异常与ASD的症状相关。PGE2还能通过蛋白激酶A和磷酸肌醇3-激酶与Wnt (wingless-related MMTV integration site)通路相互作用，影响依赖Wnt通路的神经外胚层细胞的行为和基因表达[16]。Kalkman等[17]发现：Wnt信号通路的改变也可能与ASD有关。目前，已有研究[18-19]表明：PLA2G4C是另一种神经发育障碍性疾病--精神分裂症的易感基因。因此，本研究基于中国北方汉族儿童，设计病例对照研究以探讨PLA2G4C是否为ASD的易感基因。
本研究结果表明：病例组和对照组中5个位点基因型及等位基因频数分布差异无统计学意义；采用遗传模型分析方法分析PLA2G4C基因多态性与ASD的关联，各位点各个遗传模型下均未发现与ASD间有关联。由于rs9226位点突变纯合子的频率低，rs1045376位点无突变纯合子，故对余下的3个位点进行连锁不平衡分析和单体型分析，单体型分析结果也未发现各单体型与ASD存在关联。综上所述，本研究未发现PLA2G4C基因多态性与ASD存在关联，因此PLA2G4C可能不是ASD的易感基因。
本研究首次在中国北方汉族人群中探讨PLA2G4C基因多态性与ASD的关系，为ASD病因的研究提供新的线索。本研究获得阴性结果的可能原因如下：①样本量较小，可能降低统计效能，因此需要在大样本人群中重复验证；②ASD是复杂的疾病，受基因及环境等因素的共同影响，同时还需要考虑其他可能的影响因素进一步分析；③本研究中研究对象仅选择北方汉族人，还需要在其他民族的人群中得到验证。
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