吉林大学学报(医学版)  2017, Vol. 43 Issue (01): 57-61

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宫睿, 谢湘林, 杜冰, 武毅, 刘宏雁
GONG Rui, XIE Xianglin, DU Bing, WU Yi, LIU Hongyan
桦褐孔菌对血管性痴呆模型大鼠的保护作用
Protective effect of Inonotus obliquus on vascular dementia model rats
吉林大学学报(医学版), 2017, 43(01): 57-61
Journal of Jilin University (Medicine Edition), 2017, 43(01): 57-61
10.13481/j.1671-587x.20170112

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收稿日期: 2016-07-25
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宫睿, 谢湘林, 杜冰, 武毅, 刘宏雁. 桦褐孔菌对血管性痴呆模型大鼠的保护作用[J]. 吉林大学学报(医学版), 2017, 43(01): 57-61.
GONG Rui, XIE Xianglin, DU Bing, WU Yi, LIU Hongyan. Protective effect of Inonotus obliquus on vascular dementia model rats[J]. Journal of Jilin University (Medicine Edition), 2017, 43(01): 57-61.
桦褐孔菌对血管性痴呆模型大鼠的保护作用
宫睿, 谢湘林, 杜冰, 武毅, 刘宏雁     
吉林大学药学院药理学教研室, 吉林 长春 130021
收稿日期: 2016-07-25
基金项目: 吉林省科技厅科技引导计划项目资助课题（201205020）
作者简介: 宫睿(1989-), 女, 吉林省长春市人, 在读医学硕士, 主要从事药理学方面的研究。
通信作者: 刘宏雁, 教授, 硕士研究生导师(Tel:0431-85619705, E-mail:hongyl@jlu.edu.cn)
[摘要]: 目的: 探讨桦褐孔菌对血管性痴呆（VD）大鼠行为学及组织病理形态的影响，阐明桦褐孔菌对VD大鼠的保护作用。 方法: 选用Wistar大鼠100只，采用反复夹闭大鼠双侧颈总动脉再灌注联合腹腔注射硝普钠降压法制备VD模型，大鼠分为正常对照组，模型组，阳性药组（吡拉西坦，0.5g·kg-1），低、中、高剂量（0.5、1.0和2.0g·kg-1）桦褐孔菌组，连续灌胃给药8周后，观察大鼠行为学和组织病理学变化。 结果: Morris水迷宫实验，与模型组比较，中和高剂量桦褐孔菌组大鼠在实验第2~6天，到达平台的潜伏期和游程明显缩短（P < 0.05或P < 0.01），实验第7天穿越平台次数、穿越有效区次数、有效区停留时间、有效区停留距离、有效区停留时间/总时间和有效区停留距离/总路程均明显增加（P < 0.05），高剂量桦褐孔菌组大鼠平台停留时间和平台停留时间/总时间明显增加（P < 0.05）。组织病理形态观察，与模型组比较，高剂量桦褐孔菌组大鼠脑组织皮质区和海马区的病理性损伤明显减轻。 结论: 桦褐孔菌对VD大鼠具有保护作用，能改善VD大鼠的学习记忆能力，减轻VD大鼠脑组织的病理损伤。
关键词： 桦褐孔菌     血管性痴呆     大鼠, Wistar     Morris水迷宫实验    
Protective effect of Inonotus obliquus on vascular dementia model rats
GONG Rui, XIE Xianglin, DU Bing, WU Yi, LIU Hongyan     
Department of Pharmacology, School of Pharmacy, Jilin University, Changchun 130021, China
[Abstract]: Objective: To explore the effects of Inonotus obliquus (IO) on the behavior and histopathology of vascular dementia (VD) rats, and to clarify the protective effect of IO on the VD rats. Methods: Total 100 Wistar rats were selected.Bilateral carotid artery repeating occlusion and intraperitoneal injection of sodium nitroprusside were used to establish the VD rat models. The rats were divided in control group, model group, positive group (piracetam, 0.5g·kg-1) and low, medium, and high doses of IO groups (0.5, 1.0, and 2.0g·kg-1). After 8 weeks of intragastric administration, the rats were tested by Morris water maze test, then they were sacrificed, and the histopathological changes were investigated. Results: In Morris water maze test, compared with model group, the latency and swimming distance of the rats in medium and high doses of IO groups on the second to the 6th days were significantly decreased (P < 0.05 or P < 0.01);on the 7th day, the times of crossing platform, the times of crossing effective area, the time of staying in effective area, the distance of staying in effective area, the time of staying in effective area/total time, distance of staying in effective area/total distance of the rats were significantly increased (P < 0.05).Compared with model group, the time of staying on platform and the time of staying on platform/total time of the rats in high dose of IO group were significantly increased (P < 0.05).The histopathological results showed that compared with model group, the cerebral cortex and hippocampus injury of the rats in high dose of IO group were significantly reduced. Conclusion: IO has a protective effect on the VD rats. It can improve the study and memory abilities of VD rats and reduce the pathological injury of brain tissue of VD rats.
Key words: Inonotus obliquus     vascular dementia     rats, Wistar     Morris water maze test    

桦褐孔菌(Inonotus obliquus)作为一种可食用的真菌，近年来受到国内外学者广泛关注。大量研究[1-6]显示：桦褐孔菌具有多种药理作用，如抗肿瘤、抗氧化、抗炎、抗病毒、抗辐射和免疫调节等作用，以其抗氧化和抗炎作用尤为突出。氧化损伤及炎症反应为血管性痴呆(vascular dementia，VD)主要发病机制。桦褐孔菌对VD是否有保护作用, 国内外文献尚未见相关报道。本研究首次通过反复夹闭大鼠双侧颈总动脉再灌注合并腹腔注射硝普钠降压法制备大鼠VD模型，初步探讨桦褐孔菌对VD大鼠的保护作用，为桦褐孔菌的临床应用提供实验依据。

1 材料与方法 1.1 实验动物、主要试剂和仪器

清洁级Wistar大鼠100只，雄性，体质量220~280 g，动物使用许可证号：SCXK-(吉)2013-0001，由吉林大学基础医学院实验动物中心提供。桦褐孔菌(原粉系200目的细粉，由吉林大学药学院药理教研室制备); 硝普钠注射液(开封康诺药业有限公司，批号：1301021);吡拉西坦片(天津金世制药有限公司，批号：H12020667)。XR-XM101型Morris水迷宫装置(成都泰盟科技有限公司)，CX31型光学显微镜(日本Olympus公司)。

1.2 实验方法

采用双侧颈总动脉反复夹闭再灌注联合腹腔注射硝普钠降压法，建立大鼠VD模型。按参考文献[7]方法，将大鼠用10%的水合氯醛(0.35 mg·100g-1)腹腔注射麻醉后，仰卧固定于手术台上，颈正中切口，分离双侧颈总动脉，穿线备用。在夹闭之前，腹腔注射0.05%硝普钠2.5 mg·kg-1, 随即夹闭双侧颈总动脉8 min，再通10 min，重复3次。术前预留出正常对照组大鼠。术后14d，将存活的大鼠随机分为模型组，阳性药(吡拉西坦，PT, 0.5 g·kg-1)组，低、中、高剂量(0.5、1.0和2.0 g·kg-1)桦褐孔菌组，连续给药8周后进行水迷宫实验，实验期间继续给药直至实验结束。水迷宫实验连续7 d，前6 d将大鼠分别从1、2、3和4象限4个不同的入水点放入水中，记录大鼠游到平台的潜伏期、游程、平均游速和朝向角；实验第7天移走平台，记录大鼠2 min内经过平台的次数、平台区的逗留时间、在平台区的停留距离、经过有效区的次数、有效区的逗留时间、有效区的停留距离、平台停留时间/总时间、平台停留距离/总路程、有效区停留时间/总时间、有效区停留距离/总路程、总游程、平均游速和朝向角的变化情况。水迷宫实验后，处死大鼠，取脑组织甲醛固定，HE染色，制备病理切片，光学显微镜下观察大鼠大脑皮质和海马区组织的病理形态表现。

1.3 统计学分析

采用SPSS13.0统计学软件包进行统计学分析。水迷宫实验数据均以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 各组大鼠Morris水迷宫实验结果

与模型组比较，低剂量桦褐孔菌组大鼠在实验第2~6天到达平台的潜伏期、游程、朝向角和游泳速度无明显变化(P>0.05)，中和高剂量桦褐孔菌组大鼠在实验第2~6天到达平台的潜伏期和游程均明显减少(P < 0.05或P < 0.01)，吡拉西坦组大鼠在实验第3~6天游到平台的潜伏期及游程均明显缩短(P < 0.05)，各组大鼠朝向角及游泳速度无明显变化(P>0.05)。

在实验第7天，与模型组比较，各剂量桦褐孔菌组大鼠在2 min内的总游程、平均游速、平台停留距离和平台停留距离/总路程均无明显变化(P>0.05)，中和高剂量桦褐孔菌组大鼠穿越平台次数、穿越有效区次数、有效区停留时间、有效区停留距离、有效区停留时间/总时间和有效区停留距离/总路程均明显增加(P < 0.05)，高剂量桦褐孔菌组大鼠平台停留时间和平台停留时间/总时间明显增加(P < 0.05)，吡拉西坦组大鼠经过平台的次数、在平台的停留时间、经过有效区的次数、有效区的停留时间、有效区的停留距离、平台停留时间/总时间、平台停留距离/总路程、有效区停留时间/总时间和有效区停留距离/总路程均明显增加(P < 0.05或P < 0.01)；各组大鼠总游程、游泳的平均速度和朝向角均无明显变化(P>0.05)。见表 1~5。

表 1 各组大鼠水迷宫实验的潜伏期 Table 1 Latencies in Morris water maze test of rats in various groups
(x±s, t/s)
Group n Latency
(t/d) 1 2 3 4 5 6
Control 10 62.38±27.80 25.40±14.20 15.60±7.47 12.57±4.32 8.32±3.30 8.79±2.69
Model 10 73.40±23.15 54.82±37.42* 39.30±34.49* 26.16±19.35* 17.77±9.98* 22.04±16.30*
PT 8 59.51±26.66 30.73±15.78 12.71±4.86△ 10.46±1.87△ 8.20±2.25△ 7.94±2.16△
Inonotus obliquus
  Low 10 57.89±21.13 32.42±26.00 15.76±10.84 14.54±7.21 11.06±7.57 12.22±10.87
  Medium 10 67.56±26.00 24.60±16.04△ 13.57±6.88△ 11.73±5.38△ 9.63±2.48△ 9.06±4.55△
  High 9 55.87±31.15 22.95±25.94△ 11.98±6.92△ 9.85±6.77△ 8.74±3.28△ 7.77±4.03△
  P < 0.05 compared with control group; △P < 0.05 compared with model group.
表选项
表 2 各组大鼠水迷宫实验的游程 Table 2 Swimming distances in Morris water maze test of rats in various groups
(x±s, l/cm)
Group n Swimming distance
(t/d) 1 2 3 4 5 6
Control 10 1 374.81±672.73 719.64±355.52 418.29±141.81 396.65±145.04 294.55±92.37 263.58±62.61
Model 10 1 718.37±828.75 1 370.03±872.72 729.22±365.09* 725.45±428.32* 528.91±204.47** 599.59±374.94*
PT 8 1 411.97±607.33 749.91±316.39 377.15±87.57△ 366.88±104.27△ 305.01±99.50△ 304.18±118.32△
Inonotus obliquus
  Low 10 1 264.76±414.73 845.90±473.58 452.59±184.76 419.25±201.02 347.90±169.87 346.57±242.96
  Medium 10 1 484.52±337.90 631.34±354.45△ 440.08±188.72△ 379.57±150.48△ 358.73±84.83△ 301.47±158.49△
  High 9 1 215.83±395.50 558.80±515.83△ 335.18±149.32△ 280.91±115.72△ 271.24±59.26△△ 206.30±85.12△
  * P < 0.05, ** P < 0.01 compared with control group; △P < 0.05, △△P < 0.01 compared with model group.
表选项
表 3 各组大鼠水迷宫实验的朝向角 Table 3 Starting angles in Morris water maze test of rats in various groups
(x±s, θ/°)
Group n Starting angle
(t/d) 1 2 3 4 5 6
Control 10 36.36±20.40 35.41±13.75 34.05±22.41 38.04±20.23 26.95±17.07 40.94±20.85
Model 10 29.12±19.50 43.65±14.40 37.34±21.10 38.25±25.25 29.84±19.77 34.61±12.33
PT 8 27.29±16.84 43.40±17.59 27.61±19.69 40.80±17.06 33.16±16.44 27.78±27.18
Inonotus obliquus
  Low 10 30.70±15.82 47.07±23.90 36.84±22.60 23.37±11.81 30.73±19.47 24.49±17.11
  Medium 10 49.14±23.26 40.12±15.36 31.34±16.66 41.41±22.06 37.22±20.14 35.08±16.29
  High 9 43.08±21.28 53.98±23.43 49.98±24.12 43.35±20.51 34.28±19.72 44.49±26.44
表选项
表 4 各组大鼠水迷宫实验的平均速度 Table 4 Average velocitices in Morris water maze test of rats in various groups
[x±s, v/(cm·s-1)]
Group n Average velocitice
(t/d) 1 2 3 4 5 6
Control 10 26.78±6.48 32.59±8.57 34.67±10.14 33.36±9.04 41.53±13.73 32.19±7.32
Model 10 25.22±6.74 26.92±4.61 28.71±6.59 36.84±9.37 35.45±7.86 36.26±8.51
PT 8 27.62±5.86 30.11±7.92 34.68±9.96 29.47±7.87 38.02±10.10 43.02±14.16
Inonotus obliquus
  Low 10 23.43±2.84 33.46±9.88 35.22±7.44 39.10±9.63 43.82±15.05 34.72±10.81
  Medium 10 25.39±6.72 27.18±8.23 35.89±9.87 30.93±9.50 38.85±9.97 33.12±10.27
  High 9 28.48±5.13 32.79±8.73 29.80±5.50 35.45±12.76 35.99±8.85 30.02±12.44
表选项
表 5 实验第7天各组大鼠水迷宫实验的各项指标 Table 5 Indexes in Morris water maze test on the 7th day of rats in various groups
(x±s)
Group n Total swimming
distance (t/cm)		 Average velocity
[v/(cm·s-1)]		 Times of
crossing platform		 Time of staying
on platform (t/s)		 Distance of
staying on
platform (l/cm)		 Times of
crossing
effective area		 Time of staying
in effective
area (t/s)		 Distance of
staying in effective
area (l/cm)		 Time of staying
on platform/
Total time		 Distance of staying
on platform/
Total distance		 Time of staying
in effective
area/Total time		 Distance of
staying in
effective area/
Total distance
Control 10 2710.37±529.13 22.66±4.41 5.10±3.21 2.55±1.68 72.65±43.61 8.00±1.76 26.76±12.88 696.66±306.02 0.021±0.014 0.026±0.016 0.224±0.108 0.252±0.080
Model 10 2633.93±549.56 22.00±4.58 2.30±1.89* 1.10±1.22* 33.01±39.21* 5.10±3.03* 16.19±8.52* 420.18±247.27* 0.009±0.010* 0.010±0.012* 0.135±0.071* 0.162±0.094*
PT 8 2705.18±297.87 22.59±2.48 4.63±2.56△ 3.09±2.10△ 70.26±36.19 8.38±3.16△ 31.31±12.43△△ 699.97±269.77△ 0.026±0.018△ 0.027±0.017△ 0.261±0.104△△ 0.260±0.998△
Inonotus obliquus
  Low 10 2568.91±601.01 21.46±5.12 4.11±3.18 2.01±1.68 53.70±48.56 5.78±1.39 24.84±11.70 642.57±255.21 0.017±0.014 0.021±0.023 0.207±0.977 0.258±0.105
  Medium 10 2696.48±630.29 22.50±5.25 5.78±4.00△ 2.72±2.24 71.72±57.16 8.11±2.26△ 29.87±12.87△ 746.56±295.45△ 0.023±0.019 0.027±0.021 0.249±0.107△ 0.272±0.094△
  High 9 2799.70±716.71 23.39±6.02 6.13±5.33△ 2.99±2.06△ 85.31±72.64 8.00±2.56△ 32.73±16.67△ 798.77±399.68△ 0.025±0.017△ 0.029±0.024 0.273±0.139△ 0.280±0.107△
  * P < 0.05 compared with control group; △P < 0.05, △△P < 0.01 compared with model group.
表选项
2.2 各组大鼠脑组织病理形态表现

与对照组比较，模型组大鼠的大脑皮质神经细胞变性、坏死细胞较多，核仁不清，胞浆染色深；大鼠海马神经细胞数量减少，层次不清，可见较多的变性、坏死细胞。与模型组比较，吡拉西坦组和低、中剂量桦褐孔菌组大鼠大脑皮层、海马无明显改变；高剂量桦褐孔菌组大鼠大脑皮层神经细胞数较多，变性、坏死细胞较少，海马神经细胞数较多，排列较整齐，坏死细胞少。见图 1(插页三)。

A-F: Cerebral cortex; G-L: Hippocampus; A, G:Control group; B, H: Model group; C, I:PT group; D, J: Low dose of IO group; E, K: Middle dose of IO group; F, L: High dose of IO group. 图 1 各组大鼠脑组织病理形态表现(×20) Figure 1 Pathomorphology of brain tissue of rats in various groups (×20)
图选项
3 讨论

VD是老年性痴呆常见的一种类型，是由脑血管疾病引发的一种具有痴呆表现的临床综合征，可导致脑智能的损伤，学习记忆和认知功能的障碍，目前是继阿尔兹海默症(Alzheimer’s disease，AD)之后的第2大痴呆性疾病[8]。

20世纪80年代初，英国心理学家Morris[9]发明了Morris水迷宫实验，用于研究大鼠的空间学习记忆能力，由于其设计的合理性和有效性，现已广泛用于学习记忆的研究。目前采用Morris水迷宫实验结果衡量动物的空间定向能力、空间辨别能力及空间记忆能力。本实验结果表明:桦褐孔菌能明显改善VD大鼠在水迷宫实验中的空间定向能力及空间辨别能力，改善VD大鼠的学习记忆功能。

脑皮层及海马结构对于学习能力是至关重要的, VD大鼠脑皮层及海马组织损伤[10-12]，因此在光学显微镜下观察VD大鼠脑组织海马区和皮质区组织细胞的病理形态学变化，可以间接地反映出VD大鼠学习记忆功能变化。

本研究中大鼠脑组织病理结果显示:桦褐孔菌(2.0 g·kg-1)可以减轻VD大鼠大脑皮层及海马区组织细胞的病理损伤，提示桦褐孔菌(2.0 g·kg-1)对VD大鼠的脑组织病理损伤具有保护作用。大量实验[13-17]证实：桦褐孔菌中的乙酸乙酯相及乙醇相有较强的抗氧化作用。本研究结果从行为学与脑组织病理学两方面证实了桦褐孔菌原粉对VD大鼠有一定的保护作用，其作用机制有待于进一步深入研究。

参考文献
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