吉林大学学报(医学版)  2017, Vol. 43 Issue (01): 42-46

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李宁, 刘聪, 李佳鸿, 刘畅, 杨鹏, 王春梅, 敬舒, 孙靖辉, 陈建光, 李贺
LI Ning, LIU Cong, LI Jiahong, LIU Chang, YANG Peng, WANG Chunmei, JING Shu, SUN Jinghui, CHEN Jianguang, LI He
五味子淫羊藿混合提取物对东莨菪碱致小鼠学习记忆障碍的改善作用
Improvement effect of mixed Schisandra-Epimedium extract on learning and memory disorder induced by scopolaminein mice
吉林大学学报(医学版), 2017, 43(01): 42-46
Journal of Jilin University (Medicine Edition), 2017, 43(01): 42-46
10.13481/j.1671-587x.20170109

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收稿日期: 2016-06-21
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李宁, 刘聪, 李佳鸿, 刘畅, 杨鹏, 王春梅, 敬舒, 孙靖辉, 陈建光, 李贺. 五味子淫羊藿混合提取物对东莨菪碱致小鼠学习记忆障碍的改善作用[J]. 吉林大学学报(医学版), 2017, 43(01): 42-46.
LI Ning, LIU Cong, LI Jiahong, LIU Chang, YANG Peng, WANG Chunmei, JING Shu, SUN Jinghui, CHEN Jianguang, LI He. Improvement effect of mixed Schisandra-Epimedium extract on learning and memory disorder induced by scopolaminein mice[J]. Journal of Jilin University (Medicine Edition), 2017, 43(01): 42-46.
五味子淫羊藿混合提取物对东莨菪碱致小鼠学习记忆障碍的改善作用
李宁1, 刘聪1, 李佳鸿1, 刘畅1, 杨鹏1, 王春梅1, 敬舒2, 孙靖辉1, 陈建光1, 李贺1     
1. 北华大学药学院药理教研室, 吉林 吉林 132013;
2. 北华大学附属医院普外科, 吉林 吉林 132013
收稿日期: 2016-06-21
基金项目: 吉林省科技厅重点科技攻关计划项目资助课题（20140204012）；吉林省科技厅自然科学基金资助课题（20150101230JC）；吉林省科技厅科技发展计划项目资助课题（20150311047YY）
作者简介: 李宁(1993-), 女, 吉林省公主岭市人, 在读医学硕士, 主要从事神经药理学方面的研究。
通信作者: 李贺, 副教授, 硕士研究生导师(Tel:0432-64608281, E-mail:3737292@qq.com)
[摘要]: 目的: 探讨五味子与淫羊藿混合提取物（MSEE）对东莨菪碱诱导的小鼠学习及记忆障碍的影响，为开发辅助改善记忆功能保健食品提供理论依据。 方法: ICR小鼠随机分为空白对照组（灌胃给予双蒸水，腹腔注射生理盐水），模型组（灌胃给予双蒸水，腹腔注射东莨菪碱）和150、300、600 mg·kg-1MSEE组（灌胃给予MSEE，腹腔注射东莨菪碱）。各组小鼠连续灌胃给药30d后，通过Morris水迷宫实验、避暗实验和跳台实验观察各组小鼠的学习记忆能力。分别应用酶联免疫检测法（ELISA）和比色法检测各组小鼠脑组织中乙酰胆碱（ACh）水平和胆碱酯酶（AChE）活性。 结果: 避暗实验与跳台实验，与模型组比较，600 mg·kg-1 MSEE组小鼠潜伏期明显延长（P < 0.05），各剂量MSEE组小鼠错误次数均明显减少（P < 0.05）。Morris水迷宫实验，与模型组比较，300和600 mg·kg-1MSEE组小鼠潜伏期明显缩短（P < 0.05），且经过平台次数和经过空间有效区次数明显增加（P < 0.05）。与模型组比较，各剂量MSEE组小鼠脑组织中ACh水平明显增高（P < 0.05或P < 0.01），AChE活性明显降低（P < 0.05或P < 0.01）。 结论: MSEE具有改善小鼠学习记忆能力的作用，该作用可能与增加脑内ACh水平有关。
关键词： 五味子     淫羊藿     学习记忆     小鼠    
Improvement effect of mixed Schisandra-Epimedium extract on learning and memory disorder induced by scopolaminein mice
LI Ning1, LIU Cong1, LI Jiahong1, LIU Chang1, YANG Peng1, WANG Chunmei1, JING Shu2, SUN Jinghui1, CHEN Jianguang1, LI He1     
1. Department of Pharmacology, College of Pharmacy, Beihua University, Jilin 132013, China;
2. Department of General Surgery, Affiliated Hospital, Beihua University, Jilin 132013, China
[Abstract]: Objective: To study the effect of mixed Schisandra-Epimedium extract (MSEE) on the learning and memory disorder induced by scopolamine in the mice, and to provide a theoreitical basis for the development of health food of improving auxiliary memory function. Methods: MSEE was extracted by heating reflux extraction. ICR mice were divided into control group (intragastrical administration of water and intraperitoneal saline injection), model group (intragastrical administration of water and intraperitoneal scopolamine injection) and 150, 300, 600 mg·kg-1 MSEE groups (intragastrical administration of MSEE and intraperitoneal scopolamine injection).After continuously intragastric administration of MSEE for 30 d, Morris water maze test, step-through test, and step-down test were respectively carried out to observe the effects of MSEE on the learning and memory abilities of the mice.Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and clorimetric detection were respectively used to detect the levels of acetylcholine (ACh) and the activities of acetylcholinesterase (AChE) in the brain tissue of the mice in various groups. Results: The results of step-through test and step-down test showed that the latency of mice in 600 mg·kg-1 MSEE group was significantly prolonged compared with model group (P < 0.05), and the error times of mice in 150, 300, and 600 mg·kg-1 MSEE groups were significantly reduced (P < 0.05). In Morris water maze test, the latencies of mice in 300 and 600 mg·kg-1 MSEE groups were significantly shortened compared with model group (P < 0.05), and the times crossing the platform and the effective areas in the space were increased (P < 0.05). Compared with model group, the ACh levels in brain tissue of the mice in 150, 300, and 600 mg·kg-1 MSEE groups were significantly increased (P < 0.05 or P < 0.01) and the AchE activities were significantly decreased (P < 0.05 or P < 0.01). Conclusion: MSEE can improve the learning and memory abilities of the mice, and its effect may be related to increasing the ACh level.
Key words: Schisandra chinensis Baill     Epimedium davidii Franch     learning and memory     mice    

我国已经步入老龄化国家行列，老年人口中以记忆障碍为常见表现，记忆力减退也是老年痴呆的一个典型特征[1]。记忆障碍严重影响着人们的生活质量, 研发具有辅助改善记忆功能的保健食品具有重要意义。中医古方及现代药理学研究[2-3]显示：五味子(Schisandra chinensis Baill)和淫羊藿(Epimedium davidii Franch)均具有改善记忆的功效。但目前未见关于五味子和淫羊藿混合提取物改善记忆作用的研究报道。本研究依据中医学理论，将五味子及淫羊藿组方并进行混合提取，得到五味子与淫羊藿混合提取物(mixed Schisandra-Epimedium extract, MSEE)，通过Morris水迷宫实验、避暗实验和跳台实验观察MSEE对东莨菪碱所致学习记忆障碍小鼠学习记忆能力的影响，同时检测小鼠脑组织中胆碱酯酶(acetylcholine esterase, AChE)活性和乙酰胆碱(acetylcholine, ACh)水平，探讨MSEE对小鼠脑组织Ach的影响，以期为开发辅助改善记忆功能的保健食品提供实验和理论依据。

1 材料与方法 1.1 实验动物、材料和试剂

清洁级健康ICR小白鼠，雄性，体质量(20±2) g，由吉林大学实验动物研究中心提供，动物生产许可证号：SCXK (吉)2015-0005。小鼠采取分笼饲养，且维持12h:12h昼夜循环，自由饮水、进食。五味子由吉林省集安市五味子种植基地提供，淫羊藿由河北省祁新中药饮片有限公司提供(批号：20140701-1)；采用加热回流提取法应用70%乙醇对五味子和淫羊藿混合物(质量比1:1)在75℃条件下进行料液比为1:18提取1.5h。氢溴酸东莨菪碱(纯度≥98%，200mg，美国Sigma公司)，Ach酶联免疫分析试剂盒(美国GBD公司)，AchE检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2 仪器与设备

Morris水迷宫视频跟踪分析系统(WMT-100)、小鼠避暗仪(BA-200)和小鼠跳台测试仪(DT-200)均购自成都泰盟科技有限公司，全自动酶标仪(infiniteM200)购自瑞士TECAN集团公司。

1.3 动物分组及给药

将ICR小鼠随机分为5组，每组10只，分别为对照组(灌胃给予双蒸水，腹腔注射生理盐水)、模型组(灌胃给予双蒸水，腹腔注射东莨菪碱)及150、300和600 mg·kg-1 MSEE组(分别灌胃给予150、300和600 mg·kg-1MSEE, 腹腔注射东莨菪碱)。各组小鼠按0.1mL·10g-1连续灌胃给药30d，每天1次，最后1d给药30min后行为学实验。在进行行为学实验前10min，空白对照组小鼠腹腔和注射生理盐水，模型组和其他各组小鼠腹腔注射5 mg·kg-1氢溴酸东莨菪碱。

1.4 小鼠避暗实验

将小鼠放入避暗仪中面部背向洞口放入明室，同时启动计时器。小鼠进入洞口到达暗室受到电击时计时器记录的时间即为潜伏期。本实验先训练小鼠5 min，并记录在5 min内小鼠的错误次数。间隔24h后进行第2次试验。记录每只小鼠的潜伏期及在5min内出现的错误次数[4]。

1.5 小鼠跳台实验

将小鼠放置在跳台测试仪中使其先适应环境5 min，然后施加24V的交流电，将小鼠放在跳台仪平台上，同时启动计时器，记录各组小鼠第1次跳下平台的时间(潜伏期)、各小鼠5 min内受到电击的次数(错误次数)。24h后进行第2次试验，记录各组小鼠潜伏期和错误次数[5]。

1.6 小鼠Morris水迷宫实验

训练期间继续给药，将小鼠放在Morris水迷宫视频跟踪测试系统WMT-100中，小鼠的训练时间设定为120s，在120s内未达到终点的小鼠按120s记录。每隔24 h训练1次，采集第5天的实验数据。第1次实验之前将小鼠放在平台附近，使其自动爬上3次。以后每次训练前将小鼠放在平台附近，使其自主爬上到平台一次。第6天把平台去掉统计小鼠空间搜索能力，并记录小鼠经过平台的次数和经过空间有效区的次数[6]。

1.7 检测小鼠脑组织中Ach水平和AChE活性

实验分组同前。各组小鼠连续灌胃给药30d，自灌胃第24天开始灌胃后30 min腹腔注射东莨菪碱，连续注射6d。注射30 min后处死小鼠，快速在冰垫上分离出大脑组织。将小鼠大脑组织用生理盐水清洗、称质量，加入1:9的生理盐水，用高速匀浆机冰上制成质量比为10%的脑组织匀浆液。4℃、3000 r·min-1离心10 min后，取上清液，参照酶联免疫分析试剂盒说明书检测各组小鼠脑组织中Ach水平和AChE活性。

1.8 统计学分析

采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。避暗实验、跳台实验中的潜伏期和错误次数及Morris水迷宫中潜伏期、经过平台及空间有效区次数和脑组织中Ach水平、AchE活性均以x±s表示，组间样本均数比较采用单因素方差分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 各组小鼠避暗实验结果

实验第1天，与对照组比较，模型组小鼠错误次数明显增加(P < 0.05)；与模型组比较，300和600 mg·kg-1 MSEE组小鼠错误次数明显减少(P < 0.05)。实验第2天，与对照组比较，模型组小鼠的潜伏期明显缩短(P < 0.05)，错误次数明显增加(P < 0.01)；与模型组比较，600 mg·kg-1 MSEE组小鼠潜伏期明显延长(P < 0.05)，各剂量MSEE组小鼠错误次数均明显减少(P < 0.05)。见表 1。

表 1 各组小鼠避暗实验中潜伏期和错误次数 Table 1 Latencies and error times in step-through test of mice in various groups
(n=10, x±s)
Group Latency (t/s) Error times
(t/d) 1 2 (t/d) 1 2
Control 53.46±40.66 87.01±62.98 4.80±3.58 4.40±1.96
Model 50.54±53.97 44.41±13.08* 7.90±2.12* 6.90±2.70**
MSEE (mg·kg-1)
  150 48.58±55.20 57.72±48.12 6.60±2.59 4.70±1.72△
  300 53.14±52.51 60.07±37.34 5.50±1.96△ 4.60±1.67△
  600 51.57±43.32 67.37±30.20△ 5.10±2.91△ 4.40±1.59△
*P < 0.05, ** P < 0.01 compared with control group; △P < 0.05 compared with model group.
表选项
2.2 各组小鼠跳台实验结果

实验第1天，与对照组比较，模型组小鼠的错误次数明显增加(P < 0.05)；与模型组比较，300和600 mg·kg-1 MSEE组小鼠的错误次数明显减少(P < 0.05)。实验第2天，与对照组比较，模型组小鼠潜伏期明显缩短(P < 0.05)，错误次数明显增加(P < 0.01)；与模型组比较，600 mg·kg-1 MSEE组小鼠潜伏期明显延长(P < 0.05)，各剂量MSEE组小鼠的错误次数均明显降低(P < 0.05)。见表 2。

表 2 各组小鼠跳台实验中潜伏期和错误次数 Table 2 Latencies and error times of mice in step-down tests in various groups
(n=10, x±s)
Group Latency (t/s) Error time
(t/d) 1 2 (t/d) 1 2
Control 11.70±18.68 53.70±29.47 4.50±2.84 2.80±2.04
Model 6.20±7.08 23.90±26.62* 7.80±2.75* 7.20±2.70**
MSEE (mg·kg-1)
150 9.80±5.61 37.70±26.70 6.00±2.00 4.10±3.14△
300 7.90±6.89 41.80±24.22 5.20±2.27△ 4.00±2.58△
600 7.90±6.89 41.60±24.31△ 4.70±3.23△ 3.80±3.01△
*P < 0.05, ** P < 0.01 compared with control group; △P < 0.05 compared with model group.
表选项
2.3 各组小鼠Morris水迷宫实验结果

在定位航行实验第5天，与对照组比较，模型组小鼠找到平台潜伏期明显延长(P < 0.05)；与模型组比较，300和600 mg·kg-1 MSEE组小鼠找到平台潜伏期明显缩短(P < 0.05)。见表 3。

表 3 各组小鼠定位航行实验中找到平台潜伏期 Table 3 Latencies searching for platform of mice in orientation navigation test in various groups
(n=10, x±s)
Group Latency (t/s)
Control 41.84±28.55
Model 90.74±42.83*
MSEE (mg·kg-1)
  150 83.23±36.43
  300 52.37±31.21△
  600 48.47±34.96△
*P < 0.05 compared with control group; △P < 0.05 compared with model group.
表选项

空间搜索实验, 与对照组比较，模型组小鼠经过平台的次数和经过空间有效区次数明显减少(P < 0.05或P < 0.01)；与模型组比较，300和600 mg·kg-1MSEE组小鼠经过平台次数和经过空间有效区次数明显增加(P < 0.05)。见表 4。

表 4 各组小鼠空间搜索实验中经过平台及空间有效区次数 Table 4 Times crossing platform and effective area of space of mice in spatial probe test in various groups
(n=10, x±s)
Group Times crossing platform Times crossing effective area
Control 4.40±2.06 6.70±2.55
Model 2.40±1.42* 3.30±1.79**
MSEE (mg·kg-1)
  150 3.30±3.00 4.20±2.20
  300 3.90±1.58△ 4.80±1.32△
  600 4.30±2.50△ 5.10±1.94△
*P < 0.05, **P < 0.01 compared with control group; △P < 0.05 compared with model group.
表选项
2.4 各组小鼠脑组织中Ach水平和AchE活性

与对照组比较，模型组小鼠脑组织中Ach水平明显降低(P < 0.01)；与模型组比较，各剂量MSEE组小鼠脑组织中Ach水平均明显升高(P < 0.05或P < 0.01)。与对照组比较，模型组小鼠脑组织中AChE活性明显增高(P < 0.01)；与模型组比较，各剂量MSEE组小鼠脑组织中AChE活性均明显降低(P < 0.05或P < 0.01)。见表 5。

表 5 各组小鼠脑组织中Ach水平和AchE活性 Table 5 Levels of ACh and AChE activities in brain tissue of mice in various groups
(n=10, x±s)
Group Ach [mB/(mmol·g-1)] AChE [λB /(U·mg-1prot)]
Control 27.17±9.45 0.94±0.43
Model 15.74±3.77* 3.80±1.82*
MSEE (mg·kg-1)
  150 21.36±4.40△ 2.21±1.12△
  300 22.33±5.15△△ 1.78±0.97△△
  600 22.65±5.42△△ 1.64±0.57△△
*P < 0.01 compared with control group; △P < 0.05, △△P < 0.01 compared with model group.
表选项
3 讨论

五味子是国家中药现代化科技产业基地的五大品种之一，在《本草纲目》和《神农本草经》中对其应用有明确记载。本课题组已致力于五味子相关研究10余年。前期研究[7-8]显示：五味子总木脂素在学习记忆障碍小鼠中表现出明显的改善学习记忆作用。淫羊藿又称仙灵脾，为小檗科植物淫羊藿的全草，具有抗炎和抗氧化等多种生物活性。已有文献[9-10]报道：淫羊藿苷及总黄酮在学习记忆障碍动物模型中表现出明显的改善学习记忆作用。因此，本研究在前期研究结果及相关报道的基础上，结合中医药学理论，以五味子益气敛阴和以淫羊藿补肾壮阳，将五味子与淫羊藿进行组方并行混合提取，得到的提取物MSEE能够明显改善东莨菪碱造模小鼠的学习记忆能力。

本研究选用氢溴酸东莨菪碱制备小鼠学习记忆障碍模型[11-12]。学习和记忆原理涉及复杂的神经生理和生化机制，尤其是胆碱能系统与学习记忆关系密切。大脑有多种机制用于记忆的存储，而Ach水平是这一过程的关键因素。研究[13-16]表明:脑部释放的Ach水平越高，大脑的记忆能力越强。氢溴酸东莨菪碱可以通过阻断副交感神经，降低脑内Ach水平，从而产生学习记忆障碍。本研究结果显示：与对照组比较，模型组小鼠学习记忆能力明显降低，脑组织中Ach水平明显减低，AchE活性增高，提示造模成功；与模型组比较，各剂量MSEE组小鼠的学习记忆能力明显改善，且Ach水平明显升高，AchE活性明显减低，提示MSEE对小鼠的学习记忆能力具有改善作用，该作用可能与调节小鼠脑内Ach水平有关。

由于体现小鼠学习记忆能力的行为学指标很容易受环境、声音、温度和气味等多方面因素影响，因此本研究同时应用跳台实验、避暗实验和Morris水迷宫实验3种方法观察MSEE对小鼠学习记忆的改善作用，结果显示：与模型组比较，避暗实验及跳台实验中，各剂量MSEE组小鼠学习记忆成绩均明显提高；Morris水迷宫实验中300和600 mg·kg-1MSEE组小鼠学习记忆成绩明显提高。上述结果提示：MSEE能够明显改善东莨菪碱所致学习记忆障碍小鼠的学习记忆能力，但其剂量效应关系尚不明确，相关机制需进一步研究。本课题组将在后续的工作中进一步对其量效关系及相关机制进行探讨。

参考文献
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