众所周知，阿片受体(opioid receptor，OR)在人体的许多生理及病理活动中发挥着非常重要的作用。现已证实在骨组织中存在大量OR，引起很多学者的关注，对其深入地研究将对临床相关疾病的治疗具有深远的指导意义。骨组织中阿片肽系统对骨的代谢、炎症反应和癌变等过程均具有重要的调节作用，但国内已有文献仅涉及其中的单一方面或简单提及，尚无相关系统性综述报道。本文作者就国内外关于骨组织中阿片肽系统研究，尤其是最新进展，做一简要综述。

1 阿片肽系统简介 1.1 阿片肽系统的组成

近年来利用分子生物学、电生理学等技术对OR分子结构、形态学、分子药理学、离子通道和细胞内信号转导系统等方面的研究已取得了显著进展。OR是G蛋白耦联受体家族成员，具有7个跨膜区域，分别由3个胞外环和3个胞内环相连接。C端位于胞内，N端位于胞外，有可糖基化位点。细胞内环上存在着磷酸化位点，受蛋白激酶A和蛋白激酶C调控。现在研究较多的OR有4种，包括μOR(mu opioid receptor，MOR)、δOR(delta opioid receptor，DOR)、κOR(kappaopoid receptor，KOR)和OR样受体1(opioid receptor like 1 receptor，ORL1)，而对σ、ε等受体了解相对较少。不同的OR有各自的亚型，至今已发现有13种以上，其分布主要集中在神经系统^[1]。OR的激动剂可分为外源性和内源性两大类。已发现5种内源性阿片肽，包括脑啡肽(enkephalin，ENK)、强啡肽(dynorphin，Dyn)、内啡肽(endorphin，EP)、内吗啡肽(endomorphin，EM)和孤啡肽(orphanin-FQ，OFQ)。内源性阿片肽起着神经递质或者神经调质或神经激素的作用。

1.2 OR作用机制

OR被激活后主要依赖G蛋白进行跨膜信号转导。众所周知，G蛋白分为两大类，一类是由α亚基、β亚基和γ亚基构成的三聚体G蛋白，或称为大G蛋白；另一类是单聚体G蛋白，或称小G蛋白，结构和功能类似大G蛋白中的α亚基。依据α亚基的不同可将大G蛋白分为Gs、Gi、Gq和G₁₂等家族。Gs激活腺苷酸环化酶，Gi抑制腺苷酸环化酶，Gq对磷脂酶C有作用^[2]。大剂量阿片类药物结合Gi耦联受体，抑制腺苷酸环化酶的激活，关闭电压门控Ca²⁺通道，激活内向整流K⁺通道，抑制神经元的电冲动发放；而极低剂量(皮摩尔和纳摩尔级浓度)的阿片类药物能和Gs耦联受体相结合，激活腺苷酸环化酶和蛋白激酶A，关闭内向整流K⁺通道，增加Ca²⁺通道电流，因此OR可同时偶联Gs和Gi^[3]，且不同类型的OR活化不同的G蛋白。值得注意的是，除了G蛋白α亚基发挥活化下游蛋白之外，β和γ亚基复合体也能直接和效应器结合，从而介导信号传导^[4]。另外，在G蛋白耦联受体磷酸化后，调节因子β抑制因子(β-arrestin)会结合到激活的G蛋白耦联受体上，从而调节其信息传递和内在化。阿片类药物激活OR后β-arrestin从胞浆快速迁移到细胞核内，进而引起染色体重构和药物靶基因激活，对细胞功能有长期调节作用。

2 阿片肽系统对骨代谢的调节 2.1 直接调节

骨代谢是个持续的过程，由成骨细胞和破骨细胞协同完成。临床上长期应用阿片类药物会导致骨质丢失。在这方面有关成骨细胞的研究较多。人成骨细胞株MG-63中MOR、DOR和KOR均有表达，1×10^-4mol·L^-1吗啡可抑制MG-63分泌骨钙素(osteocalcin)，此作用被纳洛酮阻断。骨钙素是反映成骨细胞功能的重要标志蛋白，其水平降低表明骨形成功能降低。1×10^-7、1×10^-6和1×10^-5mol·L^-1吗啡下调离体培养的人类成骨细胞MOR和雌激素受体表达，发挥抑制增殖作用。在体实验^[5]获得一致的结果：与对照组比较，吗啡依赖组大鼠的生长软骨增殖区域细胞数目减少，生长软骨厚度减小。上述研究表明MOR的激活可抑制骨形成。Thakur等^[6]发现：甲硫氨酸脑啡肽(met-enkephalin，MENK)及其受体OGFR和DOR在骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)和成骨细胞中均有表达。尽管50×10^-6mol·L^-1 MENK对BMSCs的增殖无作用，但与OGFR高亲和力的阿片受体拮抗剂纳洛酮显示出增加骨形成的作用，MENK经OGFR介导抑制SMAD1和p21的表达来调节骨的形成。另有研究^[7]观察不同浓度MENK(10^-1~10^-10mol·L^-1)对成骨细胞增殖的影响，结果显示：MENK摩尔浓度为1×10^-9、1×10^-8和1×10^-7 mol·L^-1时对成骨细胞增殖具有促进作用。而正常人血浆中MENK的浓度只有1×10^-11mol·L^-1。造成矛盾结果的可能原因是：MENK在不同情况下对不同细胞可能产生不同的生物效应。不同的使用剂量有可能导致MENK结合不同的受体，信号传导主要途径就可能发生变化，也就产生了不同的生物效应，提示了OR对骨代谢调节作用的复杂性。进行研究时一定要注意剂量，可能药物在低剂量或者生理剂量下促进细胞增殖，而高剂量时抑制细胞增殖。研究^[8]显示：DOR的激活对成骨细胞和BMSCs的凋亡均起保护作用。Janas等^[9]证实：切除双侧卵巢的大鼠会因为雌激素缺乏而引起骨质疏松，吗啡(20 mg·kg^-1·d^-1)皮下注射4周可抑制骨质疏松的发展，吗啡对未切除卵巢大鼠的骨骼系统也产生了有益的影响，但弱于去卵巢大鼠。在实验条件下适量使用阿片类止痛药对骨骼系统可发挥有益的作用。Janas等^[9]进一步研究发现：吗啡可降低骨形成标志物血清骨钙素的水平，但同时也降低了骨吸收标志物CTX-Ⅰ的水平，可见在体实验时吗啡抑制了骨转换。

2.2 间接调节

阿片肽系统调节骨代谢除了直接作用之外，也通过调控内分泌系统发挥间接调节作用。目前已知甲状旁腺激素、维生素D活性代谢产物、降钙素、性激素和细胞因子等多种因素调控成骨细胞和破骨细胞的活性，进而参与骨代谢调节。例如，成骨细胞和破骨细胞均存在雌激素受体和雄激素受体。雌激素和雄激素与其受体结合后促进骨基质形成。长期应用阿片类药物抑制下丘脑-垂体-性腺轴，导致血清中的性激素水平降低^[10]，从而导致骨质疏松。另外，阿片肽系统也通过调节甲状腺激素、糖皮质激素和胰岛素等参与调控骨代谢。

3 阿片肽系统对骨组织炎症的影响 3.1 抗炎镇痛

研究^[11]表明：慢性滑膜炎患者膝关节滑膜组织内MOR表达与对照组比较明显增加。在骨组织慢性炎症、骨折或骨手术后，炎症组织血管中的细胞内黏附分子1(ICAM-1)募集含有阿片肽的免疫细胞^[12]，后者在呈炎性状态的组织中表达并分泌内源性阿片肽，激活相应的OR，使骨组织中的感觉神经末梢超极化，达到局部镇痛作用，或者直接激活炎症组织的OR以及改变辅助性T淋巴细胞的状态，发挥抗炎作用^[13-16]。Obara等^[17]在炎性痛模型小鼠患肢足底局部注射MOR、DOR和KOR激动剂发现：MOR、DOR和KOR激动剂均有明显的镇痛作用，其中作用最强的为选择性MOR激动剂，而且KOR激动剂还减轻患肢炎性水肿。临床骨关节疼痛和接受骨科手术的患者早已从中获益^[18-19]。激活外周OR抑制炎性痛的机制可能涉及到L-精氨酸/NO/cGMP通路以及钙钾通道、Ca²⁺激活Cl^-通道等多条途径。

研究^[20-21]显示：BMSCs作为细胞治疗方法有减轻慢性疼痛的作用。Guo等^[20]制备了咬肌肌腱部分结扎模型和三叉神经慢性压榨损伤模型，静脉注射或损害部位局部注射BMSCs可逆转痛觉过敏，该作用会一直延续到实验结束的第22周，OR拮抗剂纳洛酮可让痛觉过敏复燃。采用RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术可让脑干MOR局灶性下调，抑制BMSCs的作用。进一步研究^[21]显示：BMSCs静脉注射降低自发兴奋性突触后电流的幅度和频率，抑制初级传入神经元的超兴奋状态，在延髓头端腹内侧NMDA受体2A亚基酪氨酸磷酸化和蛋白激酶Cγ的免疫反应也被抑制，因此BMSCs可发挥长时程的镇痛作用，此作用涉及到外周和中枢的OR激活。在骨组织发生炎症反应时，骨髓中BMSCs参与到镇痛程序中的机制尚有待阐明。

3.2 调节免疫系统

阿片肽通过OR或非OR途径与免疫系统的细胞成分或体液成分(如淋巴细胞、粒细胞、肥大细胞和补体系统)相互作用，调节免疫系统的功能。研究^[22]证实：吗啡通过阻断IkB激酶激活和SNAP-23磷酸化，抑制肥大细胞分泌肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)，从而抑制保护性的免疫反应。另外，急性吗啡处理瞬时上调骨髓源性巨噬细胞NF-κB p65和磷酸化p65在细胞核和细胞质中的表达，引发miR-124的表达，而吗啡长时间处理维持miR-124的表达，后者直接作用于NF-κB p65和TNF受体关联因子6(TRAF6)，抑制Toll样受体信号，从而抑制骨髓源性巨噬细胞的先天性免疫^[23]。

4 阿片肽系统对骨癌痛的调节 4.1 镇痛

多种恶性肿瘤如乳腺癌、前列腺癌、肺癌和大肠癌等均可发生骨转移^[24]。癌症骨痛具有神经性痛和炎性痛的双重特征，是中晚期癌症骨转移患者疼痛的最常见原因。癌组织可机械性损伤感觉传入神经，也可诱导炎症细胞(如巨噬细胞、中性粒细胞和淋巴细胞等)释放细胞因子，直接兴奋初级传入伤害性感受器而诱发疼痛。在癌细胞诱导作用下，骨膜中的感觉神经和交感神经纤维生长和重组，进而诱发自发痛。大多数转移性肿瘤发生溶骨性病变，与破骨细胞增殖、活化有关。破骨细胞通过自身与矿化骨之间形成高酸性区破坏骨质。骨癌痛动物模型骨组织内酸敏感离子通道表达明显增加^[25]。破骨细胞释放的H⁺可激活传递伤害性信息的感觉神经纤维上的酸敏感离子通道，引起痛觉信息的发起。抑制肿瘤溶骨性反应可间接减轻痛觉行为。癌症骨痛中的痛觉感受器敏化和(或)周围神经病变可诱导脊髓敏化。

骨组织局部释放的内源性阿片肽或者外源性给予的阿片类药物可经OR介导阻断痛觉信号的发起和脊髓传入。杜俊英等^[26]向胫骨内注入Walker256肿瘤细胞建立骨癌痛模型发现：电针对骨癌痛具有良好的镇痛作用，同时患侧L4~6背根神经节MOR、KOR、阿黑皮素及前强啡肽mRNA的表达比模型组明显增加，提示电针镇痛与提高外周部分OR和阿片前体mRNA的表达相关。El-Mouedden等^[27]将NCTC2472型纤维肉瘤细胞植入小鼠股骨骨髓腔，并在随后的3周癌症生长期评价疼痛行为和骨质破坏状况，结果显示：疼痛程度与骨质破坏严重程度一致；芬太尼、舒芬太尼和吗啡分别于皮下注射均可呈剂量依赖性地减轻癌痛相关行为。目前骨癌痛的临床治疗大多首先采用止痛效果确切、又无封顶效应的阿片类药物，或以其为主联合非甾体类抗炎镇痛药物、破骨细胞抑制剂和放射治疗等综合治疗^[28]。

4.2 调节肿瘤的生长和侵袭

癌细胞和间质细胞的相互作用在肿瘤微环境中发挥着关键作用，可控制肿瘤细胞的侵袭、转移和血管生成等。在特殊的病理环境中，M2巨噬细胞可促进肿瘤的侵袭。研究^[29]显示：吗啡阻止白细胞介素4(interleukin-4，IL-4)诱导的RAW264.7巨噬细胞可选择性激活。4T1乳腺癌细胞与RAW264.7细胞共培养，RAW264.7会被4T1乳腺癌细胞旁分泌激活而导致MMP-9和arginase-1表达增加，4T1乳腺癌细胞展现出侵袭能力，吗啡经OR介导阻断两者的状态变化，表明吗啡通过控制肿瘤微环境中巨噬细胞蛋白酶的产生和M2极化，调节肿瘤的侵袭。在乳腺癌细胞侵犯骨组织时，巨噬细胞成为助手，阿片肽系统可能为拦截者。此外，内源性阿片肽MENK对免疫系统发挥着直接的作用，参与先天和后天性免疫相关细胞各种功能的调节，具有抗肿瘤作用。骨髓源树突状细胞(bone marrow dendritic cells，BMDCs)接受MENK处理后增加关键表面分子和细胞因子的表达，减少FITC-右旋糖酐的内吞作用, 通过MyD88/NF-κB信号通路上调TLR4，展现出更高的抗肿瘤活性^[30]。Liu等^[31]研究发现：MENK可增加BMDCs中DOR和KOR表达，促进其分泌高水平的促炎因子IL-12p70和TNF-α，MENK也抑制在体的肿瘤生长，诱导离体的肿瘤细胞凋亡。

但也有研究^[32]证实：阿片类药物通过激活丝裂原激活蛋白激酶/细胞外信号调节激酶(MAPK/ERK)信号转导通路、磷脂酰肌醇3激酶/丝氨酸蛋白激酶(PIK3/Akt)信号传导通路和一氧化氮合酶(NOS/NO)信号通路等途径，促进肿瘤细胞的增殖迁移和肿瘤血管新生。另外，作为DOR选择性拮抗剂的纳曲吲哚也显示出抑制肿瘤细胞增殖的活性^[33]，而同为DOR选择性拮抗剂的纳曲酮却上调BMDCs中的MHCⅡ、CD40、CD83、CD80和CD86分子表达，诱导IL-12和TNF-α高水平分泌，促进BMDCs的成熟，具体机制尚不清楚^[34]。

关于阿片类药物是促进还是抑制肿瘤细胞的增殖尚存在争议。实验方法、用药剂量和时程等的不同导致不一致的结果，但很显然持续用药可改变癌细胞的生长速度。

5 展望

阿片肽系统在骨组织的生理病理程序中发挥着重要作用，但还有很多疑问和矛盾有待进一步探索。由于骨组织富含钙盐，限制了其组织学观察。传统的石蜡包埋制作切片和明胶浸泡冷冻切片需将骨组织进行脱钙，会改变原组织结构形态，使很多指标难以检测或严重影响观察效果，塑料包埋不脱钙切片技术避免了脱钙程序，但也有局限性。因此，建立一种可靠的、简便的且同时适应各种检测的不脱钙骨组织包埋方法将是骨组织学研究的关键。技术的改良将对骨组织阿片肽系统研究有革命性的推进作用。另外，利用骨癌痛模型研究^[35]显示：雌激素限制吗啡的镇痛作用，尽管其机制有待进一步研究，但可指导临床治疗。临床研究^[21]显示：BMSCs直接注射无副作用，有很好的容受性和安全性，BMSCs又易于获取、分离，因此对骨癌痛有较好的治疗应用前景。阿片肽系统的复杂性将增加研究的工作量。但只要经过不断的探索，就有可能更好地利用阿片肽系统为临床患者减轻病痛。