2017, Vol. 43扩展功能
文章信息
- 赵欢, 史册, 张雪, 李媛, 刘杰, 李杏, 胡月, 孙宏晨
- 激活素受体样激酶2调控骨重塑的研究进展
- Research progress in bone remodeling regulated by activin receptor-like kinase 2
- 吉林大学学报(医学版), 2017, 43(06): 1278-1281
- Journal of Jilin University (Medicine Edition), 2017, 43(06): 1278-1281
- 10.13481/j.1671-587x.20170640
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文章历史
- 收稿日期: 2017-03-17
人体骨骼系统终身都在进行不断的自我更新，具有运动、支持和保护器官、储存钙离子和造血等功能。骨组织通过成骨细胞介导的骨形成和破骨细胞介导的骨吸收处于动态平衡，这个过程被称为骨重塑(bone remodeling)。骨重塑受体内激素水平、细胞因子和生物力学等多种因素的影响，当骨形成和骨吸收的平衡被打乱时则会引起骨代谢性疾病[1]。骨形成蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)在骨发育、内环境稳态及骨再生等方面均发挥重要作用。2002年，美国食品药品管理局(Food and Drug Administration，FDA)批准了重组人骨形成蛋白2(recombinant human bone morphogenetic protein 2，rhBMP-2)和rhBMP-7在临床上治疗长骨开放性骨折、骨折不愈合以及脊柱融合[2]，但其治疗效果并不显著。
BMP能激活BMP信号通路，其配体首先与细胞膜上的Ⅰ型BMP受体和Ⅱ型BMP受体组成的异源复合物结合，进而激活细胞中的BMP信号通路发挥其生物学功能[3]。近年来，遗传学研究[4]表明：在人和小鼠体内由Ⅰ型BMP受体介导的BMP信号通路的紊乱可以引起骨、软骨和肌肉等组织的疾病。I型BMP受体分为激活素受体样激酶2(activin receptor-like kinase 2，ALK2)、ALK3和ALK6[4]。其中，人类ALK2基因的p.R206H位点的获得性突变可引起人类进行性肌肉骨化症(fibrodysplasia ossificans progressiva，FOP)[5]，即在骨骼肌和其他结缔组织中发生异位骨化，但是FOP患者的内生性骨组织通常不受影响[6]。因此，了解ALK2介导的BMP信号通路在骨重塑中的作用，不仅对阐明骨相关疾病的发生机制具有重要的理论意义，而且对提高rhBMPs的临床疗效具有重要的指导意义。
1 骨重塑 1.1 骨重塑的基本过程骨组织通过骨重塑维持体内的骨稳态，保证矿物质的含量、骨的数量及质量。骨重塑循环过程主要分为起始期(骨吸收)、逆转期和骨形成3个阶段[1]。
在起始期，骨细胞感受外界的压力或微损伤，通过释放细胞因子，募集来源于造血系统的破骨细胞前体细胞到骨吸收部位，进一步分化为成熟的破骨细胞，成熟的破骨细胞通过产生的酸以及合成释放的多种蛋白水解酶降解骨组织[1]，人体中这个过程约持续3周[7]。在逆转期，破骨细胞性骨吸收被抑制，破骨细胞凋亡，并通过分泌的趋化因子促进来源于骨髓间充质的骨祖细胞迁移至骨吸收部位，并最终分化为成熟的成骨细胞，为骨形成做准备[1, 7]。
在骨形成期，成骨细胞分泌骨基质，新形成的骨基质进一步矿化。当新骨占据骨吸收陷窝后，部分成骨细胞开始凋亡，部分成骨细胞进入静止期，位于新形成的骨表面，被称为骨衬细胞(bone lining cells)，部分成骨细胞被埋于骨基质中，成为骨细胞。在人体内，成骨细胞性骨形成较破骨细胞性骨吸收慢的多，约持续3个月[1, 7]。体内骨形成可分为膜内成骨和软骨内成骨2种方式，人颅面部骨和锁骨通过膜内成骨的方式形成，而颅底骨、中轴骨和四肢骨通过软骨内成骨的方式形成[8-9]。
1.2 参与骨重塑的信号通路骨形成和骨吸收是骨重塑的2个基本过程，主要由成骨细胞和破骨细胞完成[10]。成骨细胞来源于未分化的间充质干细胞，在膜内成骨过程中，间充质干细胞在转录因子Runx2和Osx等作用下定向分化为前成骨细胞，进一步分化成熟为成骨细胞；在软骨内成骨过程中，间充质干细胞在转录因子Sox9的作用下定向分化为软骨细胞和软骨膜细胞，软骨细胞经历肥大后进一步刺激软骨膜细胞分化为成骨细胞[10]。成骨细胞除可以分泌Ⅰ型胶原(collagen type Ⅰ，ColⅠ)、骨钙素(osteocalcin，OCN)和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)等骨基质蛋白外，还可以分泌核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of NF-κB ligand，RANKL)和骨保护素(osteoprotegerin，OPG)等细胞因子调控破骨细胞的分化[7-8, 10]。目前已知有大量的细胞内和细胞间信号分子、激素、细胞因子、酶、矿物质和转录因子等通过调控成骨细胞的增殖、分化来调控骨量[11]。研究[12]表明：BMP信号通路、hedgehog信号通路、Wnt信号通路、Notch信号通路和FGF信号通路等均可以调控成骨细胞的分化和骨形成。其中，BMP信号通路在胚胎发育期骨发育和出生后骨稳态的维持过程中均发挥根本性作用。
破骨细胞主要来源于造血干细胞，造血干细胞在早期转录因子的作用下首先定向分化为髓系祖细胞，这些前体细胞进一步分化为单核巨噬细胞，表达核因子κB受体活化因子(receptor activator of NF-κB，RANK)的单核巨噬细胞被认为是典型的破骨细胞前体细胞，破骨细胞前体细胞在巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor，M-CSF)和RANKL的作用下分化为破骨细胞。在破骨细胞形成和分化的过程中参与调节的主要是NF-κB、NFATc1和RANKL/RANK/OPG信号轴[13-14]。成熟的破骨细胞是位于骨小梁和骨内膜皮质骨表面的大的多核细胞，是目前公认的机体唯一可以降解的骨细胞[15]。
此外，成骨细胞谱系细胞和破骨细胞之间存在广泛的相互作用，其相互联系主要通过细胞间的接触(cell-cell contact)、可扩散的旁分泌因子和细胞-骨基质相互作用等途径[7]。
2 BMP信号通路BMP信号通路必须在配体与受体结合之后才能被启动。BMP是转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)超家族中的一员，TGF-β家族目前已有14个成员，其中BMP-2、4、5、6、7和9具有较强的成骨能力，BMP-2和BMP-7被广泛的研究，其重组人蛋白已经被应用于临床治疗颅面缺损、骨折和脊柱融合等[12]。BMP受体是一种跨膜蛋白，分为Ⅰ型BMP受体和Ⅱ型BMP受体。这2型受体均分为胞外区、跨膜区和胞内区，其中Ⅰ型BMP受体的胞内区位于激酶区上游的富含丝氨酸/苏氨酸区域(GS-box)。BMP与Ⅰ型BMP受体和Ⅱ型BMP受体所组成的杂聚肽结合之后使Ⅱ型受体磷酸化，磷酸化的Ⅱ型受体可转磷酸化Ⅰ型受体的GS区域，GS区域的磷酸化可活化Ⅰ型受体激酶，进而激活下游的SMAD依赖性和SMAD非依赖性信号通路，即经典BMP信号通路和非经典BMP信号通路[12]。
经典BMP信号通路在配体与受体结合之后，其下游的R-Smads(Smad1/5/8)被激活，进而与co-Smad(Smad4)形成复合体，复合体从胞浆转移至细胞核后与转录因子相互作用进而调控成骨相关基因的表达，如Runx2、Dlx5和Osx等[12]。
非经典BMP信号通路不依赖Smads进行信号转导，而是通过MKK-p38 MAPK或MKK ERK1/2将信号转至细胞核中，进而调控目的基因的表达。经典BMP信号通路和非经典BMP信号通路之间有相互调节和反馈调节，如MAPK信号通路可以通过促进Runx2和Smads复合体的相互作用提高经典BMP信号通路的活性[12]。
3 ALK2介导的BMP信号通路和骨重塑 3.1 ALK2介导的BMP信号通路对间充质干细胞成骨向分化的调控研究[4]表明：ALK2在间充质干细胞的成骨分化过程中有重要的作用。神经嵴细胞是一类多潜能的具有迁移能力的细胞，在颅面部发育过程中起重要作用。Dudas等[16]利用Cre-loxp系统建立了小鼠神经嵴细胞中特异性敲除ALK2基因的ALK2fx/fx/Wnt1-Cre的转基因动物模型，发现ALK2fx/fx/Wnt1-Cre小鼠在胚胎14d时即可表现出明显的下颌骨发育不全，新出生的ALK2fx/fx/Wnt1-Cre小鼠还表现为额囟门增大、颧弓不全、颧骨缺失和腭裂等颅面部缺损。因此，神经嵴细胞中ALK2所介导的BMP信号通路在颅面骨的发育过程中是必不可少的。
Agarwal等[17]通过建立ca-ALK2fx/WT/Nfatc1-Cre+转基因动物模型，发现出生后4d的小鼠，在无外伤或外源性BMP的刺激下，异位骨化仅出现在指间关节和脚踝等肢体末端，同时伴有成骨细胞前体细胞数增多，且异位病灶的成骨细胞前体细胞体外培养时成骨分化较对照组明显增强；Culbert等[18]通过基因打靶的方法建立了ALK2R206H/+基因敲入小鼠动物模型，通过分离培养小鼠胚胎期成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts，MEFs)，发现MEFs内经典BMP信号通路中的Smad1/5/8磷酸化程度增强，成骨相关基因Alp、Runx2和Ocn表达量升高，这与FOP患者体内提取间充质来源的前体细胞实验结果一致；此外，ALK2构成性活化的人间充质干细胞对外源性BMP的敏感度增强，从而更有利于分化成熟为有功能的成骨细胞[19]，当采用等位基因特异性干扰RNA(allele-specific siRNA，ASP-RNAi)抑制FOP患者间充质前体细胞ALK2活性时，原本增强的成骨向分化则降低至正常水平[20]。综上所述，ALK2所介导的BMP信号通路在间充质干细胞成骨向分化的过程中扮演着重要角色。
3.2 ALK2介导的BMP信号通路对间充质干细胞成软骨向分化的调控BMP信号通路在间充质凝集、最早期的软骨形成过程中是必不可少的，同时还参与调控骨和软骨形成时软骨细胞的增殖和成熟[18]。有学者将ALK2构成性活化的鸡胚胎成纤维细胞植入胚胎3.5 d时的鸡前肢，发现软骨形成增强，但软骨内骨化延迟[21]。Culbert等[18]通过体外培养ALK2R206H/+小鼠MEFs，发现其对BMP-4的敏感性较对照组明显增强，且早期软骨细胞特异性标志基因Sox9、Col2、Agg和晚期标志基因Col10的表达量均有所升高；而体外培养ALK2fx/fx/Esr1-Cre+小鼠MEFs可见：成软骨向分化则受到明显抑制。综上所述，ALK2可以调控间充质干细胞的软骨向分化，并且是软骨形成的必要调控因子。
3.3 ALK2介导的BMP信号通路对成骨细胞的调控出生后，内源性ALK2在小鼠骨组织中的表达水平明显高于心脏和骨骼肌[6]，表明ALK2在成骨谱系细胞中可能是必要的。Kamiya等[6]利用Cre-loxP系统成功建立了在小鼠成骨细胞内特异性敲除ALK2的ALK2fx/fx/Col1-CreERT+条件性基因敲除模型，发现基因敲除小鼠较对照组在胚胎18.5d和出生后21d时均伴有肱骨、颅骨骨量的增多，这表明ALK2所介导的BMP信号通路可以通过软骨内成骨和膜内成骨2种方式负性调节骨量。研究[6]表明：这种骨稳态的紊乱很可能是由Wnt信号通路的抑制因子Dkk1和Sost表达降低、经典Wnt信号通路表达增强所致。上述研究结果提示：抑制ALK2介导的BMP信号通路可以增加骨量，这可能会为临床上治疗骨质疏松和骨折提供新的方向。
3.4 ALK2对破骨细胞的调控目前，尚无研究发现ALK2可以直接调控破骨细胞，但有研究[22]表明Wnt信号通路表达上调时，可负性调控表达于成骨细胞中的Rankl/Opg比值，从而间接抑制破骨细胞活性。此外，Yano等[23]在裸鼠体内植入转染ALK2R206H的成肌细胞(C2C12 cells)，并给予BMP-2刺激，发现小鼠肌肉组织中有大量的异位骨化和破骨细胞的形成。转染ALK2R206H的C2C12细胞与小鼠RAW264.7细胞共培养或采用转染ALK2R206H的C2C12细胞的条件培养基培养小鼠RAW264.7细胞均可以增强破骨细胞的形成。机制分析结果表明：转染ALK2R206H的C2C12细胞中TGF-β分泌量升高，TGF-β激活周围单核细胞内的p38-MAPK信号通路，从而增强破骨细胞的分化；而TGF-β信号通路被抑制后，破骨细胞的形成也随之受到抑制。Kawao等[24]通过实验证明：当TGF-β受体Ⅰ型激酶或p38-MAPK信号通路被抑制后，即由C2C12内转染ALK2R206H而引起的破骨细胞形成增多被抑制后，异位骨化并没有受到影响。综上所述，成肌细胞中构成性活化的ALK2可以通过刺激TGF-β分泌，从而激活p38-MAPK信号通路促进破骨细胞的形成，但是增多的破骨细胞对ALK2活化引起的异位骨化并无影响。
4 ALK2介导的BMP信号通路和骨相关疾病 4.1 FOPFOP是一种常染色体显性遗传病，由ALK2基因的获得性点突变引起，每200万人中便有1人患病，典型的FOP患者临床表现为胚胎期大脚趾畸形和出生后肌腱、韧带、骨骼肌和筋膜等软组织内的异位骨化[25]。目前遗传学分析确定的FOP患者ALK2基因的突变位点包括c.617G4A (p.R206H)、c.619C4G (p.Q207E)、c.1067G4A (p.G356D)、c.982G4 T(p.G328W)、c.983G4A(p.G328E)、c.982G4A (p.G328R)、c.774G4C/c.774G4T(P.R258S)、c.1124G4C (p.R375P)、c.587T4C (p.L196P)、c.590-592delCTT (p.P197_F198delinsL)和c.605G4T(p.R202I)[4]，其中近97%的FOP患者由p.R206H位点的获得性突变所引起[26]。体外转染小鼠C2C12细胞发现：稳定转染ALK2的C2C12细胞中成骨标志性基因Osx和Alp表达水平均有所升高[27]。当在C2C12细胞内敲低ALK2时，可以促进成肌分化，抑制成骨分化。学者[28]发现：在ALK2持续性活化的组织内抑制Smad1/5/8的活性时，异位骨化和功能障碍症状减轻，表明ALK2很可能是通过激活经典BMP信号通路引起骨骼肌和结缔组织的软骨内骨化的，这些研究成果也为FOP的临床治疗提供了新的靶点。
4.2 骨骼成分发育紊乱(disorganized development of skeletal component，DDSC)由ALK2基因突变所引起的疾病中研究最多的是FOP，但当患者临床表现不典型、病情程度不一时，临床诊断较困难。非典型FOP患者通常被分为“FOP加型”(FOP-plus)和“FOP变异型”(FOP variant)两类。前者指除了具有典型的FOP临床表现外，还伴有一个或多个与FOP无关的症状；后者则不具有典型FOP临床表现，但是这些患者的ALK2基因均发生了突变。DDSC是一类由包括ALK2在内的9种基因的突变所引起的骨骼发育不良的一类疾病，临床上可表现为外生骨疣和异位骨化等。Rafati等[25]发现1例33岁的男性DDSC患者，通过基因测序发现了1个ALK2基因c.737T＞A (p.Phe246Tyr)的新型突变，该患者的父亲和兄弟亦有同样的基因突变，但无影像学改变。关于ALK2基因的这类新型突变的分子病理学机制尚有待进一步的研究。
5 展望ALK2作为Ⅰ型BMP受体的一种，既参与了膜内成骨也参与了软骨内成骨，在胚胎期和出生后骨量的调节中均有不可替代的作用。近年来，随着科学技术的进步，人们对于ALK2基因突变所引起的遗传学疾病有了更深层次的认识，对于其病理学机制有了深入的研究，以ALK2为靶点的治疗手段也取得了一定的进展。但是，关于ALK2所介导的BMP信号通路对成骨细胞和破骨细胞的直接调控机制以及其在成骨细胞与破骨细胞间相互作用中的研究尚未见报道，值得进一步探索。
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