弓形虫是一种专性细胞内寄生的病原体，具有广泛的宿主范围；可感染人和多种动物，引起人兽共患病^[1]。弓形虫感染主要分为急性和慢性2个阶段，大多数弓形虫感染的人或动物表现出强烈的细胞介导的免疫反应。宿主通过自然杀伤(natural killer, NK)细胞和T细胞产生的干扰素γ(interferon gamma, IFN-γ)参与宿主抵抗^[2-5]。刚地弓形虫肌动蛋白profilin(Toxoplasms gondii profilin protein, TgPRF)是弓形虫入侵机体的一个必需蛋白分子，与其他蛋白聚合形成滑行体，从而有效地穿越机体的生物屏障并进一步入侵宿主细胞。因此破坏TgPRF可阻断弓形虫的滑行运动^[6-7]。TgPRF在小鼠的巨噬细胞和树突状细胞(dendritic cells，DCs)中可识别Toll样受体11(Toll-like receptor 11, TLR11)和12，在人类抗体中可识别Toll样受体5(Toll-like receptor 5，TLR5)，调控DCs分泌白细胞介素12 (interleukin 12，IL-12)和干扰素α(interferon alpha, IFN-α)及NK细胞分泌的IFN-γ因子，因此profilin蛋白被认为与抗弓形虫免疫有关^[8-10]。

CpG岛(Toll样受体9的配体)和单磷酰脂质A (monophosphoryl lipid A，MPL，即Toll样受体4的配体)等Toll样受体的配体作为抗肿瘤佐剂已经进入临床前实验，但TgPRF作为免疫佐剂的研究尚处于起步阶段^[11-13]。为进一步研究TgPRF作为免疫佐剂的作用及其相关的抗肿瘤免疫机制，本实验成功构建了重组质粒pET28a-TgPRF并实现了TgPRF的可溶性原核表达，为后续的抗肿瘤免疫佐剂研究奠定了基础。

cDNA来源于刚地弓形虫RH株。原核表达质粒pET-28a(+)和大肠埃希菌(E. coli)DH5α由吉林大学第一医院转化医学研究院杨永广实验室保存。Trans1-T1感受态细胞和pEASY^®-T5 Zero Cloning Vector购自北京全式金生物技术有限公司。BL21(DE3)购自北京鼎国生物技术有限责任公司。

限制性内切酶Nco Ⅰ和Xho Ⅰ购自美国Thermo FisherScientific公司，T4 DNA连接酶和质粒提取试剂盒购自美国Promega公司，琼脂糖凝胶回收试剂盒购自上海生工有限公司，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)购自美国Sigma公司，Ni Sepharose 4B和SephadexG-25介质购自美国Amersham Pharmacia Biotech公司，DNA marker和标准蛋白质maker购自北京全式金生物技术有限公司，氨苄青霉素和卡那霉素购自美国Amresco公司，小鼠抗多聚组氨酸标签(His-tag)单克隆抗体和辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗小鼠抗体IgG购自北京全式金生物技术有限公司，化学发光液ECL购自美国Thermo Fisher Scientific公司。高压灭菌锅(日本SANYO公司)，电热恒温水箱(上海新苗医疗器械制造有限公司)，-80 ℃冰箱(美国Thermo Scientific公司)，PCR仪(上海伯乐生命医学产品有限公司)，恒温培养摇床(上海一恒科学仪器有限公司)，凝胶成像系统(上海伯乐生命医学产品有限公司), 超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司)。

根据弓形虫肌动蛋白profilin基因编码序列(GenBank: AY937257.1)设计1对引物。上、下游引物分别为F：5′-TCATTC CATGGCCAT-GTCCGACTGGGACCC TG-3′和R：5′-ACT-GACTCGAGG TAC CCAGACTGGTGA AGA-3′, 下划线为酶切位点，并分别设计含有NcoⅠ和XhoⅠ的酶切位点。引物由上海生工生物技术有限公司合成。

以合成的cDNA为模板进行PCR反应，反应条件为：98℃、1 min；98℃、10 s，62℃、30 s，72℃、30 s，共30个循环；72℃、10 min延伸。1.2%琼脂糖凝胶电泳分离鉴定。琼脂糖凝胶回收试剂盒回收和纯化PCR产物。

PCR产物和pEASY^®-T5 Zero Cloning Vector连接，连接产物转化入Trans1-T1感受态细胞中，铺板，培养过夜，挑取多个单克隆送公司测序，鉴定阳性重组子。

选择形态较好的单克隆接种于含LB/Kan+(50 g·L^-1)的5 mL液体培养基中，于37℃剧烈振摇下培养过夜。采用试剂盒小量提取质粒，应用NcoⅠ和XhoⅠ双酶切，鉴定含有profilin基因片段的重组质粒T5-profilin基因。

将pET28a空质粒和T5-profilin重组质粒用NcoⅠ和XhoⅠ双酶切消化，琼脂糖凝胶回收profilin基因片段及线性化的pET28a(5 369 bp)载体，目的基因TgPRF与载体质粒pET-28a(+)按摩尔比5:1(目的片段:载体)将二者连接、转化入E.coli DH5α感受态细胞，涂布于含卡那抗性(50mg·L^-1)的平皿, 37℃孵箱培养12~16 h，挑取单克隆接种于5 mL含卡那抗性(卡那霉素使用浓度为50 g·L^-1)的LB培养基中，37℃摇床225 r·min^-1，振荡培养12~16 h。试剂盒提取质粒，并采用NcoⅠ和XhoⅠ双酶切处理，电泳鉴定阳性重组质粒。阳性菌液送上海生工生物技术有限公司测序鉴定。同时设pET28a空质粒为阴性对照。

测序鉴定序列正确后，采用pET28a-profilin重组质粒转化入BL21(DE3)表达菌株，涂布于含卡那抗性(50 mg·L^-1)的平皿上, 37℃孵箱培养12~16 h。挑取单克隆接种于20 mL卡那抗性(50 mg·L^-1)的LB培养基中，37℃摇床225 r·min^-1，振荡培养，当A(600)达0.5~0.8时，留取菌种和1 mL菌液作为诱导前对照。剩余菌液内加入终浓度为0.5 mmol·L^-1 IPTG，37℃摇床225 r·min^-1诱导表达4 h后，留取1mL诱导后菌液。分别将诱导前与诱导后菌液11 000 r·min^-1离心2 min，沉淀用100 μL 1×还原buffer重悬，沸水煮沸10 min，11 000 r·min^-1离心5 min，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定表达产物。

取pET28a-profilin重组质粒在BL21(DE3)菌中诱导后的菌液5 mL离心，沉淀用裂解缓冲液(tris 20 mmol·L^-1, NaCL 0.5 mmol·L^-1, 咪唑20 mmol·L^-1)重悬，放置于小瓶中超声裂菌。裂菌条件为：功率600 W，5 s工作，5 s间歇，超声60次。采用结晶紫染色的方法观察菌体是否经超声裂解完全。如裂菌完全，各取1 mL超声后菌液于2个EP管中，11 000 r·min^-1离心30 min。其中一管弃上清，沉淀采用100 μL1×还原buffer重悬；另一管取50 μL上清，加入50 μL 2×还原buffer，沉淀用1 mL超纯水重悬后取50 μL，加入50 μL 2×还原buffer，将电泳的样品煮沸、离心，SDS-PAGE鉴定表达方式。

重组蛋白表达菌离心后，菌沉淀用裂解缓冲液重悬，采用金属螯合亲和层析法(填料为Ni²⁺ Saphrose-4B)纯化重组蛋白(柱长30 cm，直径2.5 cm，填料高度10 cm)。葡聚糖凝胶Sephadex G-25为填料进行凝胶过滤除盐(除盐柱柱长100 cm，直径2.5 cm, 填料高度80 cm)。洗脱纯化的蛋白并测定蛋白纯度和浓度(洗脱条件：用平衡缓冲液对Ni²⁺ Saphrose-4B进行柱平衡，缓慢上样后，加入洗涤缓冲液进行洗涤，洗涤至基线，再加入样品洗脱缓冲液，收集目标蛋白，将收集的目的蛋白流经除盐柱进行除盐)。

将His-profilin蛋白经SDS-PAGE分离、转膜和5%脱脂奶粉封闭等程序后，加入小鼠抗His-tag单克隆抗体(1:5 000)作为一抗，4℃摇动孵育过夜，PBS-T洗涤3次，再加入山羊抗小鼠的HRP-IgG(1:5 000)作为二抗，室温孵育1 h，PBS-T洗涤3次，采用ECL发光液显色并拍照。

PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳结果显示：在约492 bp处有1条特异性扩增条带，其相对分子质量与刚地弓形虫肌动蛋白profilin的cDNA序列大小相符，结合测序结果，证实该片段为TgPRF基因片段。见图 1。

M: DL2 000 DNA marker; Lane 1: TgPRF fragment. 图 1 TgPRF基因片段的琼脂糖凝胶电泳图 Figure 1 Agarose gel electrophorogram of TgPRF gene fragment

图选项

将pEASY^®-T5-profilin重组质粒采用NcoⅠ和XhoⅠ双酶切，所得片段定向亚克隆置入pET28a(+)表达载体中，经转化筛选，挑取几个单克隆菌株，提取质粒，采用NcoⅠ和XhoⅠ双酶切。电泳结果显示，在约5369 bp和492 bp处分别出现条带，与预期结果相符。提取的pET28a-profilin重组质粒送公司测序，测序结果与设计的目的序列完全相同，见图 2。

M1: DL2 000 DNA marker; M2: DL15 000 DNA marker; Lane 1, 3: pET28a-profilin; Lane 2, 4: pET28a-profilin digested by NcoⅠand XhoⅠ; Lane 5, 7: pET28a vector (negative control); Lane 6, 8: pET28a vector digested by NcoⅠand XhoⅠ(negative control). 图 2 重组质粒pET28a-profilin的双酶切鉴定的琼脂糖凝胶电泳图 Figure 2 Agarose gel electrophoregram of recombinant plasmid pET28a-profilin identified by double enzyme digestion

图选项

与诱导前比较，诱导后出现1条相对分子质量约为18 000的蛋白条带(图 3)，与预测的蛋白质相对分子质量基本一致，初步证实重组蛋白profilin在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达。应用带His标签的一抗对重组蛋白TgPRF进行Western blotting鉴定，在相对分子质量约为18 000处可见阳性条带，而相应的未插入profilin基因的pET28a空质粒表达菌株诱导4 h后，在18 000条带处未见阳性条带(图 4)，进一步证实在大肠杆菌中表达的蛋白即是TgPRF蛋白。SDS-PAGE分析结果显示：重组蛋白主要在超声裂解菌体的上清中表达(图 5)，说明重组蛋白TgPRF在大肠杆菌BL21(DE3)中以可溶性形式表达，为可溶性原核表达。

M: Protein marker; Lane 1: Before induction; Lane 2: After induction. 图 3 SDS-PAGE法检测重组蛋白TgPRF表达的电泳图 Figure 3 Electrophoregram of expression of recombinant protein TgPRF detected by SDS-PAGE method

图选项

Lane 1: Whole proteins of pET28a bacteria without induction(negative control); Lane 2: Whole proteins of pET28a bacteria with induction (negative control); Lane 3: Whole proteins of bacteria without induction; Lane 4: His-profilin. 图 4 Western blotting法检测重组蛋白TgPRF表达的电泳图 Figure 4 Electrophoregram of expression of recombinant protein TgPRF detected by Western blotting method

图选项

M: Protein marker; Lane 1: Before induction; Lane 2: After induction; Lane 3: Supernatant of induced BL21;Lane 4: Supernatant of induced BL21 (2 fold dilution); Lane 5: Supernatant of induced BL21 (4 fold dilution); Lane 6: Supernatant of induced BL21 (8 fold dilution); Lane 7: Deposition of induced BL21;Lane 8: Deposition of induced BL21 (2 fold dilution). 图 5 SDS-PAGE法检测TgPRF蛋白诱导表达形式的电泳图 Figure 5 Electrophoregram of inducible expression patterns of TgPRF protein detected by SDS-PAGE method

图选项

超声裂解表达重组蛋白TgPRF的菌体，采用Ni²⁺-Saphrose-4B金属螯合亲合层析纯化重组蛋白，纯化样品进行SDS-PAGE分析，行考马斯亮蓝染色鉴定(图 6)。纯化蛋白在SDS-PAGE上呈现单一条带，凝胶成像系统软件分析纯化蛋白的纯度大于90%，BCA法测定蛋白浓度为1 g·L^-1。说明获得了较好纯度和浓度的目的蛋白。

Protein marker; Lane 1: Precipitation after squeeze and centrifuge; Lane 2: Supernatant liquid after squeeze and centrifuge; Lane 3: Flow through; Lane 4: Washing buffer; Lane 5: Before elution; Lane 6: Elution of post-peak; Lane 7: After elution; Lane 8: Protein samples after demineralization; Lane 9: After induction with 0.5 mmol·L-1 IPTG. 图 6 SDS-PAGE法检测纯化重组蛋白TgPRF表达电泳图 Figure 6 Electrophoregram of expressions of purified recombinant protein TgPRF detected by SDS-PAGE method

图选项

TgPRF基因突变或缺失将阻碍弓形虫滑动，无法完成对宿主的侵袭和感染，从而影响弓形虫的毒力和对宿主的抗弓形虫免疫。因此profilin蛋白可作为抗弓形虫药物的靶位点或疫苗的候选基因。研究^[13]显示：将TgPRF包裹在甘露糖脂质(TgPF-OML)体内，注射给感染弓形虫的C57BL/6小鼠，可明显延长小鼠的生存周期和减小脑部损伤，诱导TgPRF依赖的特异性IFN-γ和抗体IgG的产生，引发强烈的抗弓形虫体液和细胞免疫反应。但是这一过程依赖髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88, MyD88)信号通路和TLR11受体分子。人和猪等动物中并不存在TLR11，在感染弓形虫的猪血清中检测到anti-TgPF抗体，暗示在缺少TLR11的物种中TgPRF的免疫原性被提高，TgPF-OML可能在缺乏TLR11的物种中参与抗弓形虫的感染免疫，但需要更多的科学研究支持。

TgPRF处理的细胞能诱导抗原提呈和适应性T细胞免疫反应，可作为一种新的肿瘤疫苗佐剂^[14]。弓形虫感染过程中可通过增加树突状细胞(DCs)、巨噬细胞、自然杀伤细胞(NK)、CD4⁺和CD8⁺ T细胞的数量诱导肿瘤免疫反应，通过Th1免疫反应，活化细胞毒性T细胞，减缓肿瘤的生长速度^[15-17]。采用分泌的TgPRF抗原治疗B16荷瘤小鼠，可明显减缓肿瘤的生长速度和增加细胞免疫反应^[18]。Pyo等^[14]应用小鼠结肠癌细胞系的自体整个肿瘤细胞疫苗(autologous whole-tumor-cell vaccine, AWV)模型研究显示：TgPRF可增加抗原提呈分子(如MHCs Ⅰ/Ⅱ)及其共刺激分子受体(CD80和CD86)的表达，诱导抗肿瘤免疫和吞噬作用。TgPRF和AWV共同作用可提高疫苗的效果，减缓肿瘤的生长速度，提高荷瘤者的生存率。但现有的多种抗弓形虫疫苗均受到安全性和保护效力不充分的限制，未能应用于临床。

本实验成功构建了重组质粒pET28a(+)-profilin的原核表达体系，并实现了重组蛋白TgPRF的可溶性表达和高度纯化，为后续的抗肿瘤免疫佐剂研究奠定了基础。