吉林大学学报(医学版)  2017, Vol. 43 Issue (05): 958-962

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行敏, 任宏伟, 屈慧明, 耿龙
HANG Min, REN Hongwei, QU Huiming, GENG Long
寻常型银屑病患者血清中IL-17的表达及紫草素对IL-17刺激HaCaT细胞分泌IL-6和IL-23的影响
Clinical significance of IL-17 expression in serum of patients with psoriasis vulgaris and effects of shikonin on IL-6 and IL-23 production in IL-17-stimulated HaCaT cells
吉林大学学报(医学版), 2017, 43(05): 958-962
Journal of Jilin University (Medicine Edition), 2017, 43(05): 958-962
10.13481/j.1671-587x.20170519

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收稿日期: 2017-01-19
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行敏, 任宏伟, 屈慧明, 耿龙. 寻常型银屑病患者血清中IL-17的表达及紫草素对IL-17刺激HaCaT细胞分泌IL-6和IL-23的影响[J]. 吉林大学学报(医学版), 2017, 43(05): 958-962.
HANG Min, REN Hongwei, QU Huiming, GENG Long. Clinical significance of IL-17 expression in serum of patients with psoriasis vulgaris and effects of shikonin on IL-6 and IL-23 production in IL-17-stimulated HaCaT cells[J]. Journal of Jilin University (Medicine Edition), 2017, 43(05): 958-962.
寻常型银屑病患者血清中IL-17的表达及紫草素对IL-17刺激HaCaT细胞分泌IL-6和IL-23的影响
行敏1,2 , 任宏伟1,3 , 屈慧明1,4 , 耿龙1     
1. 中国医科大学附属第一医院皮肤性病科, 辽宁 沈阳 110001;
2. 抚顺矿务局总医院皮肤性病科, 辽宁 抚顺 113008;
3. 抚顺矿务局总医院儿科, 辽宁 抚顺 113008;
4. 第四军医大学唐都医院皮肤性病科, 陕西 西安 710038
收稿日期: 2017-01-19
基金项目: 国家自然科学基金资助课题（81673055）；辽宁省高等学校优秀人才支持计划项目资助课题（LR2012026）
作者简介: 行敏(1981-), 女, 山西省侯马市人, 主治医师, 医学硕士, 主要从事皮肤病基础和临床方面的研究。
通信作者: 耿龙, 教授, 博士研究生导师(Tel:024-83282196, E-mail:genglong99@126.com)
[摘要]: 目的: 探讨寻常型银屑病患者血清中白细胞介素17（IL-17）的表达水平及IL-17刺激后HaCaT细胞分泌白细胞介素6（IL-6）和白细胞介素23（IL-23）的变化，阐明其临床意义及紫草素的干预作用。方法: 以25名正常对照者、29例寻常型银屑病患者和不同组别HaCaT细胞（空白对照组、IL-17刺激24h组、IL-17刺激36h组、IL-17刺激48h组、紫草素+IL-17组、环孢素A+IL-17组和IL-17组）为研究对象，采用双抗体夹心酶联免疫吸附法（ELISA）检测寻常型银屑病患者血清IL-17水平和HaCaT细胞各组上清液中IL-6、IL-23水平；实时荧光免疫定量-聚合酶链式反应法（RT-PCR）检测各组HaCaT细胞中IL-6和IL-23p19 mRNA表达水平；采用细胞计数盒-8（CCK-8）法检测各组HaCaT细胞活力。结果: 与正常对照组比较，银屑病组患者血清IL-17水平明显升高，以重度皮损银屑病组升高最为明显（P < 0.05）；IL-17刺激24、36和48h组HaCaT细胞及其培养上清中IL-6和IL-23水平及其mRNA表达水平均高于空白对照组（P < 0.01）；紫草素+IL-17组和环孢素A+IL-17组HaCaT细胞及其培养上清中IL-6和IL-23水平及其mRAN表达水平均低于IL-17组（P < 0.05）。与空白对照组比较，其他各组细胞活力差异无统计学意义（P > 0.05）。结论: 银屑病患者血清IL-17表达水平升高，尤其是重度皮损银屑病患者血清IL-17表达水平升高明显，IL-17可促进HaCaT细胞分泌IL-6和IL-23，呈时间依赖性，紫草素可抑制IL-17的促炎症作用。
关键词: 银屑病    HaCaT细胞    白细胞介素17    白细胞介素6    白细胞介素23    紫草素    
Clinical significance of IL-17 expression in serum of patients with psoriasis vulgaris and effects of shikonin on IL-6 and IL-23 production in IL-17-stimulated HaCaT cells
HANG Min1,2, REN Hongwei1,3, QU Huiming1,4, GENG Long1     
1. Department of Dermatology and Venereology, First Affiliated Hospital, China Medical University, Shenyang 110001, China;
2. Department of Dermatology and Venereology, General Hospital, Fushun Mining Bureau, Fushun 113008, China;
3. Department of Paediatrics and Venereology, General Hospital, Fushun Mining Bureau, Fushun 113008, China;
4. Department of Dermatology and Venereology, Tangdu Hospital, Fourth Military Medical University, Xi'an 710038, China
[Abstract]: Objective: To explore the expression level of serum interleukin-17 (IL-17) in the patients with psoriasis vulgaris and the changes of interleukin-6 (IL-6) and interleukin-23 (IL-23) levels secrered by the HaCaT cells after stimulated with IL-17, and to clarify its clinical significance and the intervention effect of shikonin. Methods: Twenty-five normal controls, 29 patients with psoriasis vulgaris and different groups of HaCaT cells (blank control group, IL-17-24 h group, IL-17-36 h group, IL-17-48 h group, shikonin+IL-17 group, CsA+IL-17 group and IL-17 group) were used as the subjects. The levels of serum IL-17 in the patients with psoriasis vulgaris and the levels of IL-6 and IL-23 in supernatant of HaCaT cells in various groups were measured by double antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) and real-time polymerase chain reaction RT-PCR was used to detect the expression levels of IL-6 and IL-23 p19 mRNA in HaCaT cells in various groups.At the same time, Cell Counting Kit-8 (CCK-8) method was used to detect the viabilities of HaCaT cells in various groups. Results: The level of serum IL-17 of the patients in psoriasis vulgaris group was increased compared with nomral control group, especially in the severe skin lesion group(P < 0.05). The levels of IL-6 and IL-23 in HaCaT cells and supernatant and their mRNA expression levels in IL-17-24 h, IL-17-36 h and IL-17-48 h groups were significantly higher than those in blank control group (P < 0.01). The expression levels of IL-6 and IL-23 in HaCaT cells and supernatant and their mRNA expression levels in shikonin+IL-17 and CsA+IL-17 groups were lower than those in IL-17 groups (P < 0.05). No statistical differences were found in the cell viabilities between each drug treatment group and blank control group (P>0.05). Conclusion: The expression level of IL-17 in the patients with psoriasis vulgaris is significantly increased, especially in the patients with severe psoriasis vulgaris.IL-17 can promote the secretion of IL-6 and IL-23 in HaCaT cells in a time-dependent manner. Shikonin can inhibit the proinflammatory effect of IL-17.
Key words: psoriasis     HaCaT cell     interleukin-17     interleukin-6     interleukin-23     shikonin    

银屑病是以免疫介导为主的遗传与环境等多种因素相互作用的慢性复发性炎症性皮肤病。寻常型银屑病患者外周血中Th17细胞增多，其效应因子IL-17在银屑病的严重程度中起重要作用[1-2]。白细胞介素17(interleukin-17, IL-17) 可促进角质形成细胞(keratinocyte, KC)产生血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、白细胞介素8(interleukin-IL，IL-8)、粒细胞巨噬细胞刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和趋化因子10(chemokine /C-X-C motif ligand 10，CXCL10) 等细胞因子[3]，而IL-6、IL-17、IL-23和TNF-α等细胞因子在银屑病免疫介导中起关键作用[4]。在银屑病的治疗中，紫草为常见的中药治疗方剂，主要具有抑制炎症、血管增生和调节免疫等作用[5]。最近研究表明紫草素可抑制HaCaT增殖[6]。既往关于紫草的研究多集中于动物模型，本文通过检测寻常型银屑病患者血清中IL-17水平及IL-17刺激HaCaT细胞分泌IL-6和IL-23的表达水平，观察紫草素对IL-17刺激HaCaT细胞分泌IL-6及IL-23表达水平的变化，探讨银屑病发病机制中IL-17和细胞因子之间的相互作用，同时探讨紫草素治疗银屑病的可能机制。

1 资料与方法 1.1 研究对象

选取2007—2010年在中国医科大学附属第一医院皮肤科诊治的寻常型银屑病住院患者29例，年龄20~67岁，平均年龄(47±14) 岁，其中男性19例，女性10例，所有患者均无其他自身免疫性疾病史。根据银屑病面积和严重程度指数(psoriasis area and severity index，PASI)标准，将寻常型银屑病患者分为3组：轻度11例、中度9例和重度9例。正常对照组为自愿献血者25名，性别、年龄与患者组匹配，无银屑病及其他自身免疫性疾病史，所有研究对象均签订知情同意书。皮肤角质形成细胞株HaCaT细胞为德国柏林自由大学本杰明·富兰克林医学中心惠赠，复苏后应用。

1.2 主要试剂和仪器

IL-17为美国Peprotech公司产品，人IL-17定量ELISA试剂盒购自美国Rapidbio公司，人IL-6定量ELISA试剂盒购自中国武汉博士德公司，人IL-23定量ELISA试剂盒购自美国R & D公司，紫草素为日本和光(Wako)生物试剂公司产品，环孢素A购自德国Merck公司，CCK-8购自日本同仁化学研究所。紫草素及环孢素A均用DMSO助溶，双蒸水定容，经0.22 μm滤膜过滤后使用，置于4℃保存，－20℃长期保存。超净工作台(DL-CJ-1N，北京东联哈尔仪器制造有限公司)，实时荧光定量PCR仪(ABI7300，美国ABI生物公司)，酶标仪(Eon Gen5，美国伯腾仪器有限公司)，电热恒温水箱(HHW21.600AⅡ，天津市泰斯特仪器有限公司)，二氧化碳细胞培养箱(MCO-5AC，日本松下健康医疗器械株式会社)。

1.3 HaCaT细胞培养和传代

HaCaT细胞生长于10%的胎牛血清及1%青链霉素的DMEM培养液中，在37℃、5% CO2相对饱和的培养箱中以1:5~1:3传代培养。

1.4 细胞分组

根据预培养，实验确定IL-17浓度为80 μg·L-1[3]，紫草素浓度为50 μmol·L-1，环孢素A浓度为10 μmol·L-1[7]。HaCaT细胞以每孔1×105个细胞接种于12孔板，每组平行设3个复孔，细胞重复培养6次，分别检测。实验细胞分为不同时间IL-17刺激组及药物处理组。不同时间IL-17刺激组分为空白对照组(DMEM培养24 h)、IL-17刺激24 h组、IL-17刺激36 h组和IL-17刺激48 h组。药物处理组分为空白对照组(DMEM培养48 h)、紫草素+IL-17组、环孢素A+ IL-17组(阳性对照组)和IL-17组。

1.5 ELISA法检测IL-17、IL-6和IL-23水平

收集寻常型银屑病患者血清、不同时间IL-17刺激组及药物处理组细胞培养上清，离心后应用ELISA法检测IL-17、IL-6和IL-23水平，按说明书操作，每个样本和标准品均设3个复孔，用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(A)值，根据标准曲线计算出样品浓度，IL-17、IL-6和IL-23水平均以pg·L-1表示。

1.6 RT-PCR法检测IL-6和IL-23p19mRNA表达水平

因IL-23有亚型，其中p19在银屑病中发挥作用，所以选择IL-23p19。Trizol法提取HaCaT细胞总RNA，测定纯度并定量后逆转录合成第一链cDNA。取逆转录产物进行RT-PCR反应。引物由联星生物技术有限公司合成，IL-6上游引物为5′-AATCATCACTGGTCTTTTGGAG-3′，下游引物为5′-GCATTGTTGGTTGGGTCA-3′，扩增片段长度为177 bp；IL-23p19上游引物为5′-CAGCTTTCACAGAAGCTCTGCAC-3′，下游引物为5′-TGACTGTTGTCCCTGAGTCCTTG-3′，扩增片段为长度158 bp；内参照β-actin上游引物为5′-TTAGTTGCGTTACACCCTTTC-3′，下游引物为5′-GCTGTCACCTTCACCGTTC-3′，扩增片段长度为156 bp。RT-PCR反应条件：95℃预变性30 s，95℃、5 s，60℃、34 s，循环40次。数据分析采用2－ΔΔCt法。用2－ΔΔCt代表基因的相对表达量(RQ=2－ΔΔCt)，Ct代表扩增产物达到设定阈值所经历的循环数，ΔCt=目的基因Ct值－管家基因Ct值，ΔΔCt =样本ΔCt－对照ΔCt。

1.7 CCK-8法检测细胞活力

将各药物组HaCaT细胞以1×104 mL-1 接种于96孔板，37℃、5%CO2条件下DMEM培养，设3个平行复孔，培养48 h后，将CCK-8 10 μL分别加入空白对照组、紫草素+ IL-17组、环孢素A+ IL-17组及IL-17组，待培养液显色后用酶标仪测各孔450 nm的A值，以细胞存活率表示细胞的增殖程度。细胞存活率=[(As－Ab)/Ac－Ab)]×100%。As表示含有细胞培养基、CCK-8和毒性物质，Ac表示含有细胞培养基和CCK-8，没有毒性物质，Ab表示不含有细胞和毒性物质的培养基和CCK-8。

1.8 统计学分析

采用SPSS 16.0统计软件包进行统计学分析。患者血清中IL-17水平，HaCaT细胞上清中IL-6、IL-23水平及其mRNA表达水平，HaCaT细胞活力，均以x±s表示。多组间样本均数比较采用单因素方差分析。以P < 0.05表示差异有统计学意义。

2 结果 2.1 研究对象的临床资料

2组研究对象性别和年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。见表 1。

表 1 2组研究对象的临床资料 Table 1 Clinical information of subjects in two groups
Group n Age (year) Sex(Male/Female)
Normal control 25 47.07±14.98 19/10
Psoriasis vulgaris 29 46.64±13.82 13/12
表选项
2.2 各组研究对象血清中IL-17水平

与正常对照组比较，寻常型银屑病患者血清中IL-17表达水平明显升高(P＜0.05)。根据PASI评分，与轻度和中度皮损银屑病患者组比较，重度皮损患者组血清IL-17水平明显升高(P＜0.01)。见表 2。

表 2 正常对照组受试者和寻常型银屑病患者血清中IL-17表达水平 Table 2 Expression levels of serum IL-17 in and healthy controls patients with psoriasis vulgans
[x±s, ρB/(ng·L-1)]
Group n IL-17
Normal control 25 2 963.76±1 421.91
Psoriasis vulgaris 29 18 141.23±8 034.62*
 Mild skin lesion (＜7) 11 3 476.48±1 295.22*
 Moderate skin lesion (7-12) 9 7 931.25±11 233.86*
 Severe skin lesion (＞12) 9 20 320.17±6 258.37△#
  *P＜0.05 compared with normal control group; △ P＜0.01 compared with mild skin lesion group; # P＜0.05 compared with moderate skin lesion group.
表选项
2.3 各组HaCaT细胞上清液中IL-6和IL-23水平

IL-17刺激24 h组、IL-17刺激36 h组和IL-17刺激48 h组HaCaT细胞培养上清中IL-6及IL-23表达水平均高于空白对照组(P＜0.05或P＜0.01)。见表 3。随着IL-17刺激HaCaT细胞时间的延长，IL-6和IL-23表达水平逐渐升高。紫草素+IL-17组及环孢素A+IL-17组HaCaT细胞培养上清中IL-6及IL-23表达水平均低于IL-17组(P＜0.01)。见表 4。

表 3 IL-17刺激后HaCaT细胞和培养上清中IL-6和IL-23水平及其mRNA表达水平 Table 3 Expression levels of IL-6, IL-23 and their mRNA in HaCaT cells and supernatant after stimulated with IL-17
(n=6, x±s)
Group IL-6 mRNA IL-6 [ρB/(ng·L-1)] IL-23p19mRNA IL-23[ρB/(ng·L-1)]
Blank control 1.00±0.00 107.50±23.80 1.00±0.00 96.49±4.35
IL-17-24 h 3.25±0.70 144.48±44.26 0.29±0.09 62.37±8.50
IL-17-36 h 8.65±1.28** 210.48±30.02** 2.56±0.63** 121.35±13.10*
IL-17-48 h 17.47±5.16** 220.37±35.74** 4.27±0.46** 161.91±12.77**
  *P＜0.05, ** P＜0.01 compared with blank control group.
表选项
表 4 各组HaCaT细胞和培养上清中IL-6和IL-23水平及其mRNA表达水平 Table 4 Expression levels of IL-6, IL-23 and their mRNA in HaCaT cells and supernatant in various groups
(n=6, x±s)
Group IL-6 mRNA IL-6 [ρB/(ng·L-1)] IL-23p19 mRNA IL-23[ρB/(ng·L-1)]
Blank Control 1.00±0.00 107.95±20.04 1.00±0.00 100.07±10.25
Shikonin+IL-17 7.10±1.73* 133.88±33.85** 2.34±0.36** 119.16±16.47**
CsA+IL-17 8.79±0.72* 135.57±26.41** 2.60±0.51** 129.28±13.36**
IL-17 16.36±5.55 220.59±34.66 4.70±0.80 178.63±27.01
  *P＜0.05, ** P＜0.01 compared with IL-17 group.
表选项
2.4 各组HaCaT细胞中IL-6和IL-23p19 mRNA表达水平

IL-17刺激24 h组、IL-17刺激36 h组和IL-17刺激48 h组HaCaT细胞IL-6和IL-23p19 mRNA表达水平均高于空白对照组，随着IL-17刺激HaCaT细胞时间的延长，IL-6和IL-23 mRNA表达水平逐渐升高(P＜0.01)。见表 3。紫草素+IL-17组和环孢素A+IL-17组HaCaT细胞中IL-6和IL-23 p19 mRNA表达水平均低于IL-17组(P＜0.05或P＜0.01)。见表 4。

2.5 CCK-8法检测药物处理组HaCaT细胞活力

紫草素组及环孢素A组细胞存活率均为101%，与对照组比较，药物组HaCaT细胞活力差异无统计学意义(P＞0.05)。见表 5。

表 5 各组HaCaT细胞活力 Table 5 Viabilities of HaCaT cells in various groups
(n=6, x±s)
Group A value
Blank control 1.115±0.011
Shikonin+IL-17 1.125±0.142
CsA+IL-17 1.125±0.085
IL-17 1.126±0.129
表选项
3 讨论

银屑病是由免疫或炎症介导的皮肤病，而T淋巴细胞和KC参与免疫介导反应。在T细胞因子作用下，KC可能会出现异常的增殖和分化；KC通过表达细胞因子进一步参与T细胞的记忆和活化。在银屑病中除受T细胞的影响外，活化的KC自身也可合成IL-1、IL-4、IL-6、IL-8和IL-23等细胞因子，促进KC增殖。IL-17主要生物学功能是促炎性反应, 与类风湿性关节炎、哮喘、多发性硬化症、银屑病和移植排斥反应密切相关。Th17细胞活化后表达IL-17、IL-22、IFN-γ和ROR-γt等细胞因子[8]，而IL-17可促进KC分泌炎症细胞因子[8-9]及KC增殖[10]，从而加重银屑病。银屑病患者外周血及其皮损处IL-6、IL-17、IL-22和IL-23表达水平明显增高[11-15]，应用环孢素A有效治疗后IL-17可降至正常[12]。最近研究[16]显示：应用IL-17单抗治疗斑块型银屑病，可明显改善银屑病患者的临床症状。

紫草为临床治疗银屑病常用中药，主要包括紫草素和紫草多糖。紫草素可降低IL-17和IL-6等细胞因子水平[17]。本研究结果表明：寻常型银屑病患者血清中IL-17含量明显高于对照组，随着银屑病患者皮损损害程度的增加，银屑病患者血清中IL-17逐渐升高，推测IL-17在银屑病的发病机制中起关键作用；本研究结果显示：随着IL-17刺激HaCaT细胞时间的延长，HaCaT细胞分泌IL-6及IL-23含量逐渐增加，从而推断IL-17可促进炎症细胞因子分泌；而紫草素可抑制不同时间IL-17刺激组HaCaT细胞中IL-6及IL-23表达；同时本文作者发现：紫草素及环孢素A在未抑制HaCaT细胞生长的情况下，都可抑制HaCaT细胞分泌IL-6和IL-23。环孢素是目前治疗银屑病有效药物，说明紫草素可有效抑制IL-17的促炎作用。在Th17细胞形成过程中，IL-6、IL-23发挥重要作用，Th17细胞活化后分泌IL-17、IL-22等多种炎性细胞因子，在本研究中银屑病患者血清中IL-17表达水平增高，而IL-17可促进HaCaT细胞分泌IL-6和IL-23，从而推测在银屑病中KC表达IL-6和IL-23增加，进一步参与Th17细胞的活化，而紫草素可抑制KC分泌炎症细胞因子。在Th17细胞和KC分泌的细胞因子相互作用中，IL-17在银屑病中发挥重要作用，而紫草素治疗银屑病的机制可能是通过抑制KC中IL-6及IL-23的表达及影响Th17细胞形成、活化而实现的。

参考文献
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