满族医药是我国传统民族医药的重要组成部分，北五味子(满语为孙扎木炭)，主要产于满族文化的主要发源地长白山山脉，在现有传承的满族单方中记载北五味子煎水内服，用于健脑安神和治疗失眠等证^[1]。现代医学研究^[2]证实：北五味子具有多种药理成分，主要含有木脂素、多糖和三萜等。其中对北五味子多糖(north-schisandra chinensis polysaccharide, NSCP)活性的研究比较多，主要集中在抗氧化、抗衰老活性、保肝作用、镇静催眠和抗癌活性等方面^[3-4]。近年来研究^[5-7]表明:NSCP具有缓解炎症浸润、减轻疼痛和炎症反应等药理作用。许珂玉等^[5]应用五味子多糖对CCl₄所致肝损伤大鼠的肝组织气球样变、炎症浸润等有明显的改善作用；刘丹娜等^[6]及付立波等^[7]发现：五味子多糖可抑制小鼠酒石酸锑钾扭体反应及缓解大鼠甲醛致痛行为等，但其作用机制尚不明确。中性粒细胞在炎症反应中具有重要作用，肿瘤坏死因子α (tumor necrosis factor-α, TNF-α)是中性粒细胞炎症反应的重要标志。除中性粒细胞的数量变化与炎症反应程度有关外，其增殖与凋亡的动态平衡是确保有效发挥机体防御反应的前提。但在严重创伤、脓毒血症和缺血再灌注等条件下，TNF-α等炎性细胞因子又可延迟中性粒细胞凋亡，还可使其过度激活、聚集于靶组织，释放的大量毒性介质及炎性细胞因子，超过防御需要，对周围组织和细胞造成进一步损伤^[8-9]。因此，如何适时诱导中性粒细胞凋亡，终止过度的炎症反应，对于治疗创伤、控制非特异性炎症具有重要的意义。本研究旨在通过脂多糖(LPS)刺激离体培养的人中性粒细胞，建立炎症细胞模型，探讨NSCP对经LPS处理的中性粒细胞TNF-α的释放及中性粒细胞凋亡的影响，进一步阐明其抗炎作用机制。

NSCP由东北师范大学生命科学院提供。LPS购自美国Sigma公司，人中性粒细胞分离液购自天津灏洋生物公司，TNF-α检测试剂盒购自美国RD公司，Annexin-V/PI检测试剂盒购自南京Vazyme公司，瑞士-姬姆萨复合染色液购自北京鼎国生物公司。流式细胞仪检测细胞凋亡在北华大学附属医院免疫研究室完成。

抽取健康志愿者外周静脉血5 mL，EDTA抗凝。按人中性粒细胞分离液试剂盒、血液样本量小于5 mL进行操作。取15 mL离心管，先加入试剂A，后加入试剂B，制成梯度界面；小心吸取血液样本加入分离液的液面上，540 g离心30 min；吸取下层乳白色环于另一个15 mL离心管(离心管中先加入清洗液5 mL)中，然后补足清洗液至10 mL，混匀细胞，240 g离心12 min，弃上清；5 mL清洗液重悬细胞，240 g离心12 min，弃上清；5 mL清洗液重悬细胞，240 g离心12 min，弃上清；加入5 mL含10%胎牛血清的DMEM细胞培养液重悬液体，并将此液体倒入25 mL细胞培养瓶中，37℃、5% CO₂培养。通过台盼蓝排斥实验计数并评价细胞存活率(>96%)。瑞士姬姆萨染色观察中性粒细胞纯度(>96%)。

实验分为对照组、LPS组(终浓度1.0 mg·L^-1)和不同浓度NSCP组。NSCP组先加入LPS(终浓度1.0 mg·L^-1)刺激60 min，再加入NSCP。NSCP组包括3个浓度组，即1.25、2.50和5.00 g·L^-1NSCP组。每组设定3个平行孔。

中性粒细胞悬液按1×10⁵ mL^-1 接种于96孔平底培养板，在不同时间终止培养后，取各组细胞培养上清液1500 r·min^-1离心10 min；离心后取40 μL上清液，加入对应的酶标板中。按TNF-α检测试剂盒说明书操作。

采用Annexin-Ⅴ/PI双染方法进行，调整细胞浓度至1×10⁶ mL^-1，取500 μL悬浮液300×g、4℃离心5 min，弃上清；用预冷的PBS洗涤细胞2次，每次均在300×g、4℃离心5 min，弃上清；加入100 μL Binding Buffer重悬细胞；加入5 μL Annexin-V-FITC和5 μL PI Staining Solution轻轻混匀；避光，室温反应10 min；加入400 μL Binding Buffer混匀，样品在1 h内采用流式细胞仪检测。流式细胞仪双通道检测1×10⁴个细胞。Annexin-V阳性为凋亡早期细胞，PI阳性为坏死细胞，Annexin-V和PI双阳性为晚期凋亡坏死细胞。计算细胞凋亡百分率。

采用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析。凋亡百分率以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。

分离出的中性粒细胞状态良好，细胞基本呈圆形，内部结构清晰，典型分叶核状，细胞浆红染，着色均匀，细胞膜外缘规整。见图 1(插页五)。

图 1 中性粒细胞形态表现(瑞士姬姆萨，×400) Figure 1 Morphology of neutrophils (Switzerland Giemsa, ×400)

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LPS组细胞培养上清液中TNF-α水平随时间延长而增加，作用4、8和16 h时TNF-α水平较对照组均增加(P < 0.05)，尤其16 h时TNF-α水平增加最明显。NSCP可降低TNF-α水平，其中5.00 g·L^-1 NSCP作用4、8和16 hTNF-α水平较LPS组均下降(P < 0.05)；各浓度NSCP组均以16 h抑制作用最好，与LPS组比较明显下降(P < 0.05)。见图 2。

图 2 不同浓度NSCP作用不同时间中性粒细胞中TNF-α水平 Figure 2 Levels of TNF-α in neutrophils after treated with different concentrations of NSCP for different time

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对照组、LPS组、5.00 g·L^-1 NSCP组中性粒细胞早期凋亡百分率依次为35.6%、13.7%和39.7%，可见LPS处理的中性粒细胞凋亡百分率减少，凋亡延迟，见图 3。LPS组中性粒细胞凋亡百分率随作用时间延长而稍有增加，作用4、8和16 h时凋亡百分率较对照组降低(P < 0.05)。NSCP组凋亡百分率随时间的延长和浓度的增加而增加，其中5.00 g·L^-1 NSCP作用16 h时促进凋亡作用最好，与LPS组比较凋亡百分率明显升高(P < 0.05)。见表 1。

A: Control group; B: LPS group; C: NSCP-3 group. 图 3 流式细胞术检测中性粒细胞凋亡率 Figure 3 Apoptotic rates of neutrophils detected with flow cytometry

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炎症反应是机体消灭侵入病原体和异物的过程，在炎症反应中，中性粒细胞最先募集到炎症部位而发挥免疫防御等作用。中性粒细胞的募集及迁移过程中释放的炎性细胞因子如IL-1β、IL-6及TNF-α，一方面有利于机体杀灭病原微生物，另一方面也加重炎症反应及损伤自身组织和细胞。TNF-α是炎症反应过程中最早释放的炎性细胞因子，具有诱导次级炎性介质释放、激活TLR4/NF-κB信号转导通路、继而引起炎症级联反应及延续局部或全身炎症反应等作用^[10-11]。本研究成功构建了炎症细胞模型，应用LPS (1.0 mg·L^-1)刺激中性粒细胞，随着作用时间的延长，TNF-α水平逐渐增加；NSCP可有效减少LPS刺激中性粒细胞TNF-α的释放，并且呈时间依赖性及剂量依赖性。本课题组前期实验已经证实：NSCP可呈时间及剂量依赖性方式抑制LPS刺激中性粒细胞IL-6的分泌，但对其他炎性细胞因子的作用(IL-1β等)有待于进一步探讨。

中性粒细胞在血液循环中半衰期为8~16 h，成熟的中性粒细胞启动自发性细胞凋亡维持其数量的平衡及内环境的稳态。炎症发生时，中性粒细胞穿过血管内皮细胞后在组织中可存活24~48 h，这是导致炎症反应持续和组织损伤的主要原因^[12-13]。研究^[14-17]表明：在众多自身免疫性疾病中，IL-1β、IL-6及TNF-α等炎性细胞因子明显升高，这些炎性细胞因子可抑制中性粒细胞的凋亡，造成炎症反应加重和自身组织的损伤。在LPS所致大鼠急性肺损伤模型中，肺内中性粒细胞存活时间延长，分泌TNF-α增加，TNF-α进一步激活中性粒细胞，可造成恶性循环^[18-19]。本研究中，1.0 mg·L^-1LPS使中性粒细胞凋亡延迟，凋亡百分率降低，而NSCP可抑制LPS诱导的中性粒细胞凋亡延迟，NSCP组中性粒细胞凋亡百分率随时间的延长和浓度的增加而增加。Vasudevan等^[10]研究表明：NF-κB在中性粒细胞凋亡过程中起重要作用，应用多种NF-κB抑制剂均能提高中性粒细胞凋亡率。NSCP是否通过抑制NF-κB信号通路的作用促进中性粒细胞凋亡，有待进一步研究。

满族药物以其独特的药用价值应用于疾病治疗，北五味子作为特色满族药物被广泛应用。本研究结果显示：NSCP不仅可以通过降低炎性细胞因子TNF-α水平表现出抗炎作用，同时可以通过抑制中性粒细胞的凋亡延迟而发挥抗炎作用。本研究结果为民族医药——满族医药研究开拓了新的研究视点，也为满药北五味子资源的开发和利用提供了更广阔的前景。