心脏移植是终末期心脏病患者疗效确切的治疗方法，通过心脏移植可以提高患者的生活质量、延长其寿命。但由于器官短缺，供心常常需要远距离低温运输使心肌冷缺血时间延长，及供心再灌注导致供心早期无功能、失功能和晚期排斥反应的出现^[1-2]，故临床上心脏移植的冷缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury, IRI)是不可避免的，如何保护供心，减轻心脏移植的冷IRI是目前研究的热点之一。脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶(PI3K/Akt)通路作为细胞内重要的信号转导通路在心肌暖IRI中的作用及莱菔硫烷(sulforaphane, SFN)抗氧化作用已得到证实^[3-5]。本课题组前期研究^[6-8]发现：SFN可通过抗凋亡、抗氧化作用减轻心脏移植中的供心冷IRI。但SFN与PI3K/Akt通路在心脏移植中冷IRI中的关系尚未有文献报道。本实验通过大鼠异体异位心脏移植模型探讨SFN是否通过PI3K/Akt通路对供心冷IRI起到保护作用，为临床心脏移植供心保护提供实验依据。

近交系健康雄性SD大鼠64只，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物合格证号：SCXX京2011-007，体质量220~250 g，SPF清洁级。SFN购于美国LKT实验室，LY294002购自美国Cayman公司，组氨酸-色氨酸-酮戊二酸盐液(HTK液)购自德国克勒化学试剂公司，PV-6001二步法免疫组织化学检测试剂盒购自北京中杉金桥公司，兔Akt、P-Akt、Bax和Bcl-2多克隆抗体购自美国Abcam公司，二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)溶剂购于美国Sigma公司。手术显微镜(德国Leica 650), 显微外科器械(德国Gest公司)。

按照参考文献[8]中的方法制备动物模型。① 麻醉：10%水合氯醛3~4 mL·kg^-1腹腔注射，麻醉SD大鼠；② 供心制备：用4℃生理盐水35 mL和HTK液15 mL先后对供心进行冲洗并取出置于20 mL 4℃ HTK液中保存9 h；③ 受体移植：将供心的升主动脉、肺动脉分别与该大鼠的腹主动脉、下腔静脉端侧吻合，检查无出血后关腹，移植后24 h处死动物，取出供心待组织学、免疫组织化学及Western blotting检测。

64只健康雄性SD大鼠随机分为4组，每组供体和受体各8只。缺血再灌注(冷IRI)组：受体在移植前24 h经尾静脉注射1%DMSO 0.3 mL；SFN组：受体在移植前24 h经尾静脉注射SFN 2.5 mL·kg^-1；LY+冷IRI组：受体于注射DMSO前30 min及移植前30 min分别经鼠尾静脉注射LY294002 0.3 mg·kg^-1，余同IRI组；LY+ SFN组：受体于注射SFN前30 min及移植前30 min分别经鼠尾静脉注射LY294002 0.3 mL·kg^-1，余同SFN组。

10%甲醛固定供心组织24 h，常规脱水，透明，石蜡包埋，切片，HE染色后观察心肌组织结构。

按照试剂盒说明，采用PV-6001免疫组织化学二步法检测丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，即蛋白激酶B (Akt)、磷酸化Akt(p-Akt)、Bax(Bcl-2 Assaciated X protein)、B细胞淋巴瘤/白血病-2 (Bcl-2) 的蛋白表达。石蜡切片常规脱蜡至水，放入沸腾的柠檬酸盐缓冲液中抗原热修复5 min，3%过氧化氢阻断内源过氧化物酶后PBS洗3次(每次3 min)，分别滴加兔多克隆抗体Akt(1:50)、P-Akt(1:50)、Bax(1:200) 和Bcl-2(1:200)，置于4℃冰箱过夜，次日滴加PV-6001试剂，37℃温箱孵育40 min，PBS冲洗3次(每次3 min)，行DAB显色5~6 min后蒸馏水充分洗涤，再行苏木素复染1 min后流水冲洗30 min，常规乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片；用已知阳性组织切片作为阳性对照，PBS代替一抗作为阴性对照，光镜下观察，以心肌细胞细胞质中出现棕黄色颗粒为阳性表达。于400倍镜下每张切片取5个视野，按照伊雪等^[9]免疫组织化学评分法，结合阳性细胞百分比及阳性细胞染色程度进行评分，取均值表示该蛋白表达水平。

蛋白提取：取出冷冻供心组织，切取100 mg放入冰上已编号的EP管中，加入混匀的细胞裂解液1 mL，用匀浆器打碎，置于4℃离心机中离心10 min(11 000 r·min^-1)，用微量枪析出上清液备用。应用BCA法蛋白测定试剂盒检测蛋白浓度(A液:B液=50:1，混匀)用上样缓冲液配平，配制12%分离胶注入制胶玻璃板待凝固，再次注入5%浓缩胶并插梳子，凝固后拔出梳子并滴加上样蛋白(每孔50 μg)，放入电泳槽进行电泳，用电转仪将蛋白转至PVDF膜，TBST液清洗3次(每次5 min)，用5%脱脂奶粉封闭2 h，再次TBST液清洗3次(10 min^-1)，敷一抗并4℃冰箱过夜，次日TBST液清洗3次(每次15 min)后敷二抗2 h，TBST液清洗3次(每次15min)并显影，待β-actin(1:10 000) 检测平衡后，依次检测Akt、P-Akt、Bcl-2和Bax(均1:5000) 蛋白表达，应用ImageJ V1.47H软件进行条带灰度值测定。

采用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析。Akt、p-Akt、Bcl-2和Bax蛋白表达水平以x±s表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析。以P < 0.05表达差异有统计学意义。

冷IRI组：心肌组织正常结构破坏，可见心肌细胞水肿、排列紊乱、心肌纤维断裂，心肌间质可见大量炎性细胞浸润，小血管扩张、充血，心肌损伤严重；SFN+IRI组：心肌细胞形态较正常，心肌结构较清楚，心肌纤维排列较整齐，心肌间质散在少量炎细胞浸润，心肌损伤较轻；LY +SFN组：应用LY294002阻滞剂后，心肌细胞、心肌纤维及间质中炎细胞的浸润情况介于LY+IRI组和SFN组之间。见图 1(插页五)。

A:Cold IRI group; B:SFN group; C: LY+cold IRI group; D:LY+SFN group. 图 1 供心冷IRI后各组大鼠心肌组织病理学变化(HE，×400) Figure 1 Pathological changes of myocardium tissue of rats in various groups after cold IRI (HE, ×400)

图选项

与冷IRI组比较，SFN组p-Akt蛋白表达水平明显升高(7.27±0.40 vs 5.30±0.37，P < 0.05)，Bcl-2蛋白表达水平升高(5.82±0.34 vs 3.30±0.34，P < 0.05)，而Bax蛋白表达水平降低(4.21±0.25 vs 5.32±0.23，P < 0.05)；应用阻滞剂LY294002后，与LY+冷IRI组比较，SFN+LY组p-Akt蛋白表达水平无明显变化(5.25±0.36 vs 5.00±0.38，P>0.05)，但Bcl-2蛋白表达水平仍增高(4.57±0.30 vs 3.28±0.15，P < 0.05)，Bax仍降低(4.85±0.27 vs 5.28±0.26，P < 0.05)，Bcl-2/Bax比值升高(0.94±0.02 vs 0.62±0.05，P < 0.05)。见表 1和图 2~4(插页五)。

A:Cold ІRI group; B:SFN group; C:LY+cold IRI group; D:LY+SFN group. 图 2 供心冷IRI后各组大鼠心肌组织中P-Akt蛋白表达(免疫组织化学法，×400) Figure 2 Expressions of P-Akt protein in myocardium tissue of rats in various groups after cold IRI(Inmiimohistochemistry, ×400)

图选项

A:Cold IRI group; B:SFN group; C: LY+cold IRI group; D:LY+SFN group. 图 3 供心冷IRI后各组大鼠心肌组织中Bd-2蛋白表达(免疫组织化学法，×400) Figure 3 Expressions of Bcl-2 protein in myocardium tissue of rats in various groups after cold IRI (Immunohistochemistry, ×400)

图选项

A:Cold IRI group; B:SFN group; C: LY+cold IRI group; D:LY+ SFN group. 图 4 供心冷IRI后各组大鼠心肌组织中Bax蛋白表达(免疫组织化学法，×400) Figure 4 Expressions of Bax protein in myocardium tissue of rats in various groups after cold IRI (Immunohistochemistry, ×400)

图选项

与IRI组比较，SFN组p-Akt蛋白表达水平明显升高(1.53±0.03 vs 1.00±0.06, P < 0.05)，Bcl-2蛋白表达水平升高(1.52±0.03 vs 0.81±0.03，P < 0.05)，而Bax蛋白表达水平降低(0.46±0.05 vs 1.31±0.03，P < 0.05)；应用阻滞剂LY294002后，与LY+IRI组比较，SFN+LY组p-Akt蛋白表达水平无明显差异(0.98±0.11 vs 0.98±0.08，P>0.05)，但Bcl-2蛋白表达水平仍增高(1.19±0.07 vs 0.77±0.02，P < 0.05)，Bax蛋白表达水平仍降低(0.94±0.09 vs 1.31±0.08，P < 0.05)，Bcl-2/Bax比值升高(1.27±0.19 vs 0.59±0.03，P < 0.05)。见图 5和表 2。

Lane1:Cold IRI group; Lane2:LY+cold IRI group; Lane3:SFN group; Lane4:LY+SFN group. 图 5 供心冷IRI后各组大鼠心肌组织中Akt、p-Akt、Bcl-2和Bax蛋白表达电泳图 Figure 5 Electrophoregram of expressions of Akt, p-Akt, Bcl-2 and Bax proteins in myocardium tissue of rats in various groups after cold IRI

图选项

PI3K/Akt通路在对抗组织及细胞的IRI中发挥主要作用^[10]。研究^[11-12]表明：结扎大鼠左冠状动脉前降支制作心肌IRI模型及使用H9C2心肌细胞建立低氧/复氧模型，应用不同抗氧化剂干预结果显示：其心肌的保护作用是通过PI3K/Akt通路起作用。Leoncini等^[3]用大鼠心肌细胞培养模型研究心肌IRI发现：SFN通过Akt通路影响二期酶的表达和活性。

本实验结果显示：Akt蛋白在各组中的表达虽有轻微变化，但差异无统计学意义；与IRI组比较，SFN组p-Akt蛋白表达水平明显升高(P < 0.05)；应用阻滞剂LY294002后，与LY+IRI组比较，SFN+LY组p-Akt蛋白表达水平无明显变化(P>0.05)，本文作者认为SFN可能通过磷酸化Akt对心肌冷IRI起作用，而该过程能够被LY294002所阻断，SFN通过激活PI3K/Akt信号通路对心肌冷IRI起保护作用。

B细胞淋巴瘤/白血病-2基因(Bcl-2) 家族是由2组功能相互拮抗的蛋白组成，其中以Bcl-2及Bax蛋白与启动细胞凋亡的Caspase家族蛋白的关系最为密切。

Bcl-2是最早被确认的具有抗细胞凋亡作用的基因蛋白，主要分布于线粒体内膜等处，许多凋亡因素诱导的细胞凋亡均能被Bcl-2所抑制。Bcl-2的抗凋亡作用主要是通过抑制“线粒体途径”实现。Bax主要存在于细胞浆中，生理状态下是以非活性状态存在。当心肌IRI时，Bax的蛋白构型发生变化，使其活化并转移到线粒体膜与Bcl-2蛋白形成异源二聚体，从而抑制Bcl-2蛋白活性，促进了mPTP开放及线粒体膜电势(△ψm)的下降，维持了“线粒体途径”的促细胞凋亡作用。目前研究^[13-15]认为：Bcl-2/Bax比值更能说明Bcl-2家族在心肌细胞凋亡中的作用，若比值升高说明抗凋亡作用占主导；反之，促凋亡作用占主导。

本实验结果显示：SFN组中Bcl-2蛋白表达水平升高，Bax蛋白表达降低，Bcl-2/Bax比值升高，与IRI组比较差异有统计学意义，说明SFN能够通过提高Bcl-2蛋白表达水平、抑制Bax的蛋白表达水平对心肌冷IRI起保护作用；LY294002干预后：LY+SFN组中Bcl-2蛋白表达水平降低、Bax蛋白表达水平升高，但Bcl-2/Bax比值仍升高，两者的水平均介于SFN组和LY+IRI组之间，并且与SFN组及LY+IRI组比较差异有统计学意义，说明LY294002能够抑制SFN对Bcl-2及Bax蛋白的调控作用，但不能完全阻断。

Xu等^[16]将兔的冠状动脉前降支进行30 min结扎后放开，进行120 min再灌注制作心肌IRI模型，结果显示：毛柳甙能够通过PI3K/Akt信号通路影响Bcl2/Bax，这一通路能够被LY294002阻断。本研究结果显示：SFN能够通过激活PI3K/Akt信号通路进而提高Bcl-2蛋白表达、抑制Bax蛋白表达，从而对心肌冷IRI起保护作用，但SFN对Bcl-2和Bax的调控作用不是完全通过PI3K/Akt信号通路实现。因此，本文作者认为：PI3K/Akt信号通路介导SFN调控心脏移植心肌冷IRI的保护作用，但不是唯一信号通路。SFN的抗凋亡、抗氧化作用的机制尚需进一步研究。