人参为五加科植物人参（Panax ginseng C.A.Mey.）的干燥根和根茎，其味甘、微苦，具有大补元气、补脾益肺和生津养血等功效^[1]，广泛分布于辽宁东部、吉林东半部和黑龙江东部。人参作为药食同源的植物，享有“百草之王”的美誉，其主要生物活性成分为人参皂苷及人参多糖^[2]。精氨酸双糖苷（AFG）是从红参中发现的一种具有药理活性作用的氨基酸衍生物，其为鲜参在蒸制成红参的过程中，由于发生美拉德反应而产生出新的非皂苷类小分子物质^[3]，分子结构式如图 1所示。AFG在促进微循环、降压、皮肤美白和抗糖尿病方面均有显著的效果^[4-7]，但目前未见关于AFG抗疲劳作用的相关报道。本研究旨在探讨AFG对小鼠抗疲劳作用，为人参中非皂苷类小分子物质的研发与应用提供一定的依据。

图 1 AFG化学结构式 Figure 1 Chemical structural formula of AFG

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80只ICR SPF级小鼠，体质量(20±2) g，购于吉林省长春市亿斯实验动物技术有限责任公司，动物许可证号：SCXK(吉)2016-0003。乳酸(LD)试剂盒、尿素氮(BUN)试剂盒和肝糖原(Gly)试剂盒(南京建成生物制品有限公司)，电泳级琼脂糖(Biowest Agarose)、高纯总RNA快速提取试剂盒、BioTeke super RT Kit、2×SYBR real-time PCR premixture、BCA法蛋白定量试剂盒和RIPA裂解液(北京百泰克生物技术有限公司)，兔抗小鼠PGC-1α抗体、碱性磷酸酶标记山羊抗兔IgG和β-actin抗体(Bio Vision公司)等，其他试剂为分析级。AL104型电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)，KQ-250DB型超声波提取仪(昆山超声仪器有限公司)，FD-1D-50型真空冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司)，ST 16R高速冷冻离心机(美国Thermo公司)，DYY-Ⅲ8A电泳仪(北京六一仪器厂)，Nanodrop2000核酸蛋白检测仪(美国Thermo公司)，Mx3000p荧光定量PCR仪(美国Stratagene公司)，1658001 Bio-rad垂直电泳仪(美国伯乐公司)。

将采购于吉林省抚松县的红参(五年生)进行粉碎，过50目筛网，精密称取10.000 g溶于100 mL 95%乙醇溶液中，超声提取40 min，过滤，弃去滤液，残渣加入1 L蒸馏水，超声提取40 min，用相对分子质量为1000的中空纤维素滤膜进行过滤，最后将滤液真空冷冻干燥，得富含AFG的粉末(RM)，提取率为2%，HPLC-ELSD检测纯度为85%。

实验动物随机分为4组：空白对照组，AFG低剂量组(100 mg·kg^-1)、中剂量AFG组(200 mg·kg^-1)和高剂量AFG组(400 mg·kg^-1)，每组20只，除空白对照组外其他3组灌胃给药28 d，观察小鼠体征变化。小鼠饲养温度(23±1)℃，12 h黑夜白天交替，给予充足的食物和水。

连续给药28 d后，每组随机取10只小鼠，在末次给药30 min后，在每只小鼠尾部系占自身体质量5%的铅皮，放于50 cm×40 cm×40 cm、水深30 cm、恒定水温(25±1)℃的游泳箱里进行游泳实验，把小鼠沉入水中10 s内不能上浮作为一个抗疲劳能力并记录时间。

连续给药28 d后，将每组剩余10只小鼠在末次给药30 min后，进行90 min无负重游泳。休息1 h后，眼球取血，在3 500 r·min^－1、4℃，离心10 min得血清，低温冰箱保存，待用。将小鼠颈椎脱臼处死，取其腓肠肌、肝脏、脾脏、胸腺和肾脏，计算脏器指数(脏器指数=脏器/体质量×100%)。将低温保存的血清按LD、BUN和Gly试剂盒说明检测LD、BUN和Gly水平。

取其大小一致的腓肠肌，采用Trizol法提取组织中总RNA，并采用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度法检测提取总RNA的浓度和纯度^[9]。

体系中加入0.2~2.0 μg Total RNA，1 μL Oligo dT，1 μL dNTP Mixture，4 μL 5×first-strand Buffer，1 μL M-MuLVReverse Transcriptase，1 μL RNase Inhibitor和7 μL RNase free H₂O。42℃、50 min，70℃、10 min，将得到的cDNA放于－20℃冻存备用。

PGC-1α和β-actin基因序列参照GenBank，委托上海生工公司合成。引物序列见表 1。PGC-1α上游序列：5′-AGCGAAGAGCATTTGTCAAC-3′，下游序列：5′-TTCTGTGGGTTTGGTGTGA-3′；β-actin上游序列：5′-GCCCAGAGCAAGAGAGGTAT-3′，下游序列：5′-TTCTGTGGGTTTGGTGTGA-3′。mRNA表达水平以比较Ct法进行计算。

体系中加入10 μL2×Premix，0.4 μL上游引物，0.4 μL上游引物，2 μL模板，0.4 μL ROX和6.8 μL DEPC水。94℃、10 s，94℃、5 s，60℃、30 s，40个循环。

制备蛋白样品，采用BCA法测定蛋白浓度，进行SDS-PAGE电泳，将凝胶上的蛋白转移至PVDF膜上并进行转膜，结束后用5%脱脂牛奶封闭2 h，一抗孵育，4℃过夜，二抗室温孵育1 h，最后加入显影液，待出现明显条带，扫描保存图片^[10]。

采用SPSS 19.0统计软件进行统计学处理。各组小鼠体质量，脏器指数，强迫性游泳时间，血清中LD、BUN、Gly水平和PGC-1α mRNA表达水平以x±s表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。

在小鼠灌胃给药期间，分别于1、14和28 d记录小鼠体质量，给药组小鼠体质量与空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表 1。

待小鼠无负重游泳实验结束后，脱臼处死，解剖小鼠，取肝、脾、胸腺、肾器官进行称质量，给药组小鼠的肝指数、脾指数、胸腺指数和肾指数与空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表 2。

小鼠负重强迫性游泳实验结果显示：与空白对照组(9.98min±1.04 min)比较，低、中和高剂量AFG组小鼠力竭游泳时间(11.91 min±1.15 min、15.01 min ± 1.36 min和15.01 min ±1.36 min)分别高于空白对照组19.43%、50.40%和68.03%。

给药组小鼠游泳后血清中LD水平明显低于空白对照组(P < 0.01)，且随给药剂量的增加LD水平递减；给药组小鼠血清中BUN水平明显低于空白对照组(P < 0.01)，Gly水平明显高于空白对照组(P < 0.01)。见表 3。

从腓肠肌组织中提取总RNA，采用琼脂糖凝胶电泳对提取质量进行检测，18 S和28 S电泳条带均可见，吸光度(A)(260)/A(280)=1.97，表明提取的RNA具有较好的纯度和完整性。见图 2。

Lane 1:Blank control group; Lane2:Low dose of AFG group; Lane 3:Middle dose of AFG group; Lane 4:High dose of AFG group. 图 2 小鼠腓肠肌提取总RNA电泳图 Figure 2 Electrophoregram of total RNA extracted from mouse gastrocnemius

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将逆转录合成的cDNA进行荧光定量分析，扩增曲线拐点清楚，整体平行性好，基线平且无上扬情况，CT值为15~35，表明扩增曲线良好。熔解曲线单一峰，表明产物单一，无二聚体。见图 3。

图 3 β-actin的实时PCR扩增曲线(A)和熔解曲线(B) Figure 3 Real-time PCR amplification curves(A)and melting curves(B)of β-actin

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将逆转录合成的cDNA进行荧光定量分析，扩增曲线拐点清楚，CT值为15~35，表明扩增曲线良好。熔解曲线单一峰，表明产物单一，无二聚体。见图 4。

图 4 PGC-1α的实时PCR扩增曲线(A)和熔解曲线(B) Figure 4 Real-time of PGC-1α PCR amplification curves(A) and melting curves(B)

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对小鼠进行强迫游泳后，低、中和高剂量AFG组小鼠腓肠肌PGC-1α mRNA表达水平[(3.07±0.34)×10^-5、(8.22±0.95)×10^-5和(14.9±1.64)×10^-5]明显高于空白对照组[(1.40±0.22)×10^-5](P < 0.05)。

通过BCA法蛋白定量试剂盒，在波长562nm下，建立标准曲线，在浓度为0~0.045 g·L^-1范围内呈良好的线性关系，回归方程为Y=11.976X+0.10466，R²=0.9990，根据标准曲线得出样品蛋白浓度为0.268~0.282 g·L^-1。

低、中和高剂量AFG均可提高小鼠腓肠肌PGC-1αmRNA表达水平。对此通过免疫蛋白印迹进行蛋白水平验证，低、中和高剂量AFG组小鼠腓肠肌PGC-1α蛋白表达水平明高于空白对照组，与实时荧光定量PCR结果相吻合。见图 5。

Lane 1:Blank control group; Lane2:Low dose of AFG group; Lane 3:Middle dose of AFG group; Lane 4:High dose of AFG group. 图 5 Western blotting法检测PGC-1α蛋白表达电泳图 Figure 5 Electrophoregram of PGC-1α protein expression detected by Western blotting method

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疲劳是人体一种常见的生理反应，其会导致机体发生很多生理上的变化，在消耗体内一些物质的同时也会代谢出一些物质，因此选择检测Gly、LD和BUN代表疲劳时的基本指标，具有一定的意义。当机体能量不足时，体内贮存的Gly转化并提供能量^[11-12]，蛋白质代谢产生能量。本研究结果显示：给药组小鼠的负重游泳时间长于空白对照组，说明AFG可能是增加了小鼠体内肝糖原的贮备量，从而减少蛋白质分解来提供能量。如果运动过于剧烈或持久，则会有大量乳酸产生，堆积的LD若不能被及时地清除，会引起局部肌肉酸痛和影响细胞正常的新陈代谢^[13]，AFG有促进微循环的作用^[5]，使部分LD能够被及时清除，从而减轻肌肉酸痛，起到一定的抗疲劳作用。

提高呼吸肌能力和产生ATP的能力是提高人体肌肉耐疲劳的关键，而肌肉的呼吸能力和产生ATP的能力又依赖于细胞内线粒体浓度的增加。研究^[14]表明：细胞内线粒体的生成和功能主要受PGC-1α基因的控制。对啮齿类动物的研究^[15]显示：无论是短期运动还是耐力训练都可以促进肌肉中PGC-1α的表达。对人体的一系列研究^[16]也表明：急性运动或耐力训练均可提高PGC-1α的表达。本研究结果显示：给药组小鼠PGC-1αmRNA表达水平明显高于空白对照组，可能是通过影响PGC-1αmRNA表达来提高肌细胞的氧化代谢能力。为了进一步验证，本研究采用免疫蛋白印迹法检测小鼠腓肠肌PGC-1α蛋白结果显示：给药组小鼠PGC-1α蛋白的表达水平高于空白对照组，表明AFG抗疲劳作用可能与能量代谢有关。

研究^[17]表明：从植物中提取的多糖成分(如果实类枸杞多糖、根块类黄精多糖、茎和叶类竹叶多糖和真菌类香菇多糖)具有抗疲劳的效果，然而红参中非皂苷类化合物AFG在这方面的报道却不多见。本实验重在探讨AFG在影响能量代谢方面的机制，结果表明：AFG具有抗疲劳的功效，有开发功能性食品的潜力。但其具体作用机制还有待于进一步研究。