吉林大学学报(医学版)  2017, Vol. 43 Issue (05): 857-861

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毛西京, 王敏, 于挺敏, 姚刚
MAO Xijing, WANG Min, YU Tingmin, YAO Gang
丁苯酞对血管性痴呆大鼠海马CA1区脑源性神经营养因子表达的影响
Effect of 3-n-butylphthalide on brain-derived neurotrophic factor expression in hippocampal CA1 region of vascular dementia rats
吉林大学学报(医学版), 2017, 43(05): 857-861
Journal of Jilin University (Medicine Edition), 2017, 43(05): 857-861
10.13481/j.1671-587x.20170501

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收稿日期: 2016-12-24
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毛西京, 王敏, 于挺敏, 姚刚. 丁苯酞对血管性痴呆大鼠海马CA1区脑源性神经营养因子表达的影响[J]. 吉林大学学报(医学版), 2017, 43(05): 857-861.
MAO Xijing, WANG Min, YU Tingmin, YAO Gang. Effect of 3-n-butylphthalide on brain-derived neurotrophic factor expression in hippocampal CA1 region of vascular dementia rats[J]. Journal of Jilin University (Medicine Edition), 2017, 43(05): 857-861.
丁苯酞对血管性痴呆大鼠海马CA1区脑源性神经营养因子表达的影响
毛西京 , 王敏 , 于挺敏 , 姚刚     
吉林大学第二医院神经内科, 吉林 长春 130041
收稿日期: 2016-12-24
基金项目: 国家自然科学基金资助课题（31372267，81500953）；吉林省科技厅科技发展计划项目资助课题（20150520143JH）
作者简介: 毛西京(1979-), 女, 山西省运城市人, 主治医师, 医学博士, 主要从事认知功能障碍、慢性头痛的基础和临床方面的研究。
通信作者: 姚刚, 副主任医师(Tel:0431-88796816, E-mail:yaogang0431@163.com)
[摘要]: 目的: 观察丁苯酞（NBP）对血管性痴呆（VD）大鼠海马CA1区脑源性神经营养因子（BDNF）表达的影响，探讨丁苯酞对VD的保护作用。方法: 将80只健康Wistar大鼠按随机区组法分为假手术组、NBP对照组（假手术+NBP注射剂）、VD组（VD模型）和NBP处理组（VD模型+NBP注射剂），每组20只，每组又分为4个亚组，即术后1、2、4和8周组，每个亚组5只。永久性双侧颈总动脉结扎法制备VD大鼠模型。NBP对照组和NBP处理组大鼠腹腔注射NBP注射剂5 mg·kg-1·d-1，连续给药7 d。假手术组和VD组大鼠每次腹腔注射4 mL生理盐水，连续注射7 d。各组大鼠在术后各时间点（1、2、4和8周）留取海马组织，应用实时定量PCR和免疫组织化学法检测各组大鼠海马CA1区BDNF表达水平。结果: 定时定量PCR法，术后2、4和8周，VD组大鼠海马BDNF mRNA表达水平明显高于假手术组（P < 0.05），术后4和8周，NBP处理组大鼠海马BDNFmRNA表达水平明显高于VD组（P < 0.05）；免疫组织化学法，VD组大鼠4周时BDNF表达水平明显高于假手术组（P < 0.05），术后8周时NBP组大鼠CA1区BDNF蛋白表达水平明显高于VD组（P < 0.05）。结论: VD模型大鼠海马CA1区神经元在遭受缺血损伤后，BDNF反应性表达增加，而NBP则可明显提高VD大鼠海马CA1区BDNF的表达，发挥神经保护作用。
关键词: 血管性痴呆    海马    脑源性神经营养因子    丁苯酞    
Effect of 3-n-butylphthalide on brain-derived neurotrophic factor expression in hippocampal CA1 region of vascular dementia rats
MAO Xijing, WANG Min, YU Tingmin, YAO Gang     
Department of Neurology, Second Hospital, Jilin University, Changchun 130041, China
[Abstract]: Objective: To study the effect of 3-n-butylphthalide (NBP) on the expression of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) in the hippocampal CA1 region of the vascular dementia (VD) rats, and to explore its protective effect on VD. Methods: Eighty healthy Wistar rats were equally and randomly assigned to sham operation group, NBP control group (sham operation + NBP injection), VD group (VD models), NBP treatment group (VD models + NBP injection)(n=20). Each group was divided into four subgroups (n=5):1, 2, 4, and 8 weeks after operation groups. The VD rat models were established by using permanent bilateral common carotid artery ligation. After consciousness, the rats in NBP treatment group and NBP control group were intraperitoneally injected with 5 mg·kg-1·d-1 NBP for consecutive 7 d. The rats in VD and sham operation groups were intraperitoneally injected with 0.2 mL·d-1 saline for consecutive 7 d. At 1, 2, 4, and 8 weeks after operation, the rats in each group were decapitated. The brains were obtained, and then the hippocampus tissues were isolated. The BDNF expression levels in the hippocampal CA1 region were determined using real-time quantitative PCR and immunohistochemistry methods. Results: At 2, 4, and 8 weeks after s operation, the expression levels of BDNF mRNA in the hippocampus of the rats in VD group were significantly higher those in sham operation group(P < 0.05);at 4 and 8 weeks after operation, the expression levels of BDNF mRNA in the hippocampus of the rats in NBP treatment groups were significantly higher than that in VD group(P < 0.05).The immunohistochemistry results showed that the expression level of BDNF protein in the hippocampal CA1 region of the rats in VD group was higher than that in sham operation group at 4 weeks after operation (P < 0.05); the expression level of BDNF protein in the hippocampal CA1 region of the rats in NBP treatment group was higher than that in VD group at 8 weeks after operation (P < 0.05). Conclusion: The BDNF expression is increased in the hippocampal CA1 region of the rats with VD after the neurons were injured by ischemia. NBP can increase the BDNF expression level in the hippocampal CA1 region of the VD rats and protect the nerves.
Key words: vascular dementia     hippocampus     brain-derived neurotrophic factor     3-n-butylphthalide    

丁苯酞(3-n-butylphthalide，NBP)是人工合成的消旋正丁基苯酞，临床研究[1]显示：NBP能够明显减轻急性缺血性脑卒中患者中枢神经功能缺损。随着对NBP研究的不断深入，目前发现NBP对血管性痴呆(vascular dementia，VD)也有较为明显的改善作用[2-3]，但其作用机制尚缺乏深入的研究。神经营养因子在神经元的存亡、生长及分化过程中有着重要的作用，脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)是中枢神经系统中分布最广泛的神经营养因子，其不仅与神经元的生长及存活有关，而且可以调节突触传递和可塑性，与学习记忆功能有密切关联[4]。赵俊等[5]在制备VD大鼠模型2个月后开始灌胃给予NBP胶囊发现：VD大鼠海马区BDNF表达水平增加。在脑缺血发生的急性期开始给予NBP，VD大鼠海马区BDNF的表达随时间延续有何种变化，尚无相关研究。本研究在制备VD大鼠模型的基础上，应用NBP进行干预治疗，观察不同时间点VD模型大鼠海马CA1区BDNF表达变化，进而探讨NBP对VD的保护作用，为临床应用NBP治疗VD提供实验依据。

1 材料与方法 1.1 实验动物、药物及主要试剂

健康SPF级Wistar大鼠(雌雄各半)80只，体质量200~220g，购于吉林大学基础医学院动物中心，动物合格证号：SCXK(吉)2003-001。NBP氯化钠注射液(石药集团恩必普药业有限公司，批准文号：国药准字H20100041)，总RNA提取试剂盒(RNAiso Reagent)、反转录试剂盒RNA、E.coli DH5α菌株、pEASY-T1载体、限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅤ、实时定量PCR试剂盒SYBR Premix Ex TaqTM(大连TaKaRa公司)，胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒(美国Axygen Biosciences公司)，大鼠抗BDNF多克隆抗体(北京博奥森生物公司)。

1.2 实验动物分组

Wistar大鼠按随机区组法分为4组，每组20只。假手术组、NBP对照组(假手术+NBP注射剂)、VD组(VD模型组)、NBP处理组(VD模型+NBP注射剂)；每组又分为4个亚组：术后1、2、4和8周组，每个亚组5只。

1.3 动物模型制备

VD组和NBP处理组大鼠术前禁食禁水8 h，10%水合氯醛(0.3 mL·100 g－1)腹腔注射麻醉大鼠，仰卧位固定于操作台，常规消毒颈部手术区域，颈前正中纵形切口约1 cm、钝性逐层分离皮下软组织、颈前肌群，分离出气管侧后方的颈动脉鞘，进而分离颈总动脉与迷走神经，以1号丝线永久结扎颈总动脉，同法结扎另一侧颈总动脉。局部消毒后恢复组织层次并缝合皮肤。假手术组和NBP对照组大鼠除不结扎双侧颈总动脉外，其余操作与VD组和NBP处理组大鼠一致。术后大鼠另放于干净鼠笼饲养，自由取水及饲料。

1.4 药物干预

NBP对照组和NBP处理组大鼠清醒后(术后1 d，可在笼中自由活动)，给予NBP氯化钠注射液腹腔注射，剂量为5 mg·kg-1·d-1(药物剂量根据成人常规每日剂量进行换算)，连续给药7 d。假手术组和VD组大鼠每次腹腔注射生理盐水(4 mL·d-1)，连续给予7 d。

1.5 标本采集

各组大鼠在术后各时间点(1、2、4和8周)行10%水合氯醛(0.3 mL·100 g-1)麻醉，每组取5只直接断头取脑，分离出一侧海马，－70℃保存，用于实时定量PCR检测；分离出另一侧海马，迅速置入10%甲醛固定48 h，PBS洗脱3次，80%~100%梯度酒精脱水，二甲苯透明后，石蜡包埋，制成厚度为4 μm的切片，用于免疫组织化学检测。

1.6 实时定量PCR检测

RNAiso Reagent试剂提取海马总RNA，逆转录cDNA。BDNF引物，上游引物：5′-GGTCACAGTCCTGGAGAAAG-3′，下游引物：5′-GTCTATCCTTATGAACCGCC-3′，制备BDNF质粒标准品。SYBR GreenⅠ实时定量PCR 20 μL反应体系：SYBR Premix Ex TaqTM 10 μL，上下游引物各0.4 μL(10 μmol·L-1)，ROX Reference Dye 0.4 μL，cDNA标本2.0 μL，dH2O 6.8 μL。将BDNF质粒标准品进行10倍系列稀释，同时进行PCR反应；反应条件：94℃预变性2 min，94℃变性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40个循环，每个循环退火末期检测荧光信号。在反应条件中加入溶解曲线分析，分析模式：95℃、15 s, 60℃、20 s, 95℃、15 s。

1.7 免疫组织化学检测

免疫组织化学检测采用SP法。每张切片于400倍镜下随机选取5个视野，利用Leica Qwin图像分析系统检测阳性表达水平，同时计算每个视野下的阳性细胞总数占所有细胞总数的比率，细胞表达平均水平计算采用视野灰度×阳性细胞比率(评分公式是∑pi, i代表细胞浆染色强度，p代表同一染色强度细胞所占计数细胞百分比)，以5个视野的平均值表示。

1.8 统计学分析

采用SPSS 13.0软件进行统计学处理。各组大鼠海马组织中BDNF mRNA和蛋白表达水平以x ±s表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 各组大鼠海马组织中BDNF mRNA表达水平

① 不同时间点各组大鼠海马组织中BDNF mRNA表达水平比较：VD组和NBP处理组大鼠2、4和8周时海马BDNF mRNA表达水平明显高于假手术组(P＜0.05)；NBP处理组大鼠4和8周时海马BDNF mRNA表达水平明显高于VD组(P＜0.05)。见表 1。② 不同组别大鼠各时间点海马组织中BDNF mRNA表达比较：NBP处理组大鼠4周时海马BDNF mRNA表达水平明显高于1周时(P＜0.05)，VD组大鼠各时间点海马BDNF mRNA表达水平比较差异无统计学意义(P＞0.05)。见表 1。

表 1 各组大鼠海马组织中BDNF mRNA表达水平 Table 1 Expression levels of BDNF mRNA in hippocampus tissue of rats in various groups
(n=5, x ±s，×104)
GroupExpression level of BDNF mRNA
(week) 1248
Sham operation1.22±0.381.20±0.201.51±0.261.33±0.18
NBP control1.38±0.361.49±0.272.16±0.311.77±0.20
VD2.12±0.323.04±0.35*3.15±0.41*2.87±0.45*
NBP treatment2.40±0.503.63±0.60*4.72±0.43*△4.32±0.42*△
* P＜0.05 compared with sham operation group；△ P＜0.05 compared with VD group.
表选项
2.2 各组大鼠海马组织中BDNF蛋白表达水平

BDNF蛋白阳性表达显示为黄棕色颗粒，主要定位于细胞浆。① 不同时间点各组大鼠海马CA1区BDNF蛋白表达水平比较：术后4周，VD组大鼠海马CA1区BDNF蛋白表达水平明显高于假手术组(P＜0.05)；术后2、4和8周，NBP处理组大鼠海马CA1区BDNF蛋白表达水平明显高于假手术组(P＜0.05)；术后8周时，NBP处理组大鼠海马CA1区BDNF蛋白表达水平明显高于VD组(P＜0.05)，NBP对照组大鼠海马CA1区BDNF蛋白表达水平明显高于假手术组(P＜0.05)。② 不同组别大鼠各时间点海马CA1区BDNF蛋白表达水平比较：NBP处理组大鼠8周组海马CA1区BDNF蛋白表达水平明显高于1周组(P＜0.05)；NBP对照组大鼠4和8周组海马CA1区BDNF蛋白表达水平明显高于1周组(P＜0.01)。见图 1(插页一)和表 2。

A-D:1 week; E-H:2 weeks; I-L: 4 weeks; M-P:8 weeks. A,E,I,M: Sham operation group; B,F,J,N: NBP control group; C,G,K,O:VD group; D,H,L,P:NBP treatment group. 图 1 各组大鼠海马CA1区BDNF表达(免疫组织化学，×400) Figure 1 Expressions of BDNF in hippocampal CA1 region of rats in various groups(Immunohistochemistry, ×400)
图选项
表 2 各组大鼠海马CA1区BDNF蛋白表达水平 Table 2 Expression levels of BDNF protein in hippocampal CA1 region of rats in various groups
(n=5, x ±s)
GroupExpression level of BDNF
(week) 1248
Sham operation59.28±3.8851.62±7.8553.74±7.2256.66±6.48
NBP contraol55.02±5.7975.74±11.2394.38±10.3398.24±7.18*
VD88.54±9.0596.60±13.94105.08±11.23*92.54±8.40
NBP treatment84.72±12.74109.50±12.53*117.50±12.99*139.90±12.91*△
* P＜0.05 compared with sham operation group；△ P＜0.05 compared with VD group.
表选项
3 讨论

永久性双侧颈总动脉结扎法制备VD大鼠模型是目前公认的VD造模方法[6-7]，当双侧颈总动脉结扎后，并不会造成前脑组织的血供完全阻断，而是处于缺血状态，接近VD慢性脑灌注不足的发病机制，符合VD发病病理基础，与人类VD的发生具有最大程度的相似性[8-9]，因此本研究VD大鼠模型采用永久性双侧颈总动脉结扎法制备。

BDNF作为神经营养因子家族的成员，广泛分布于中枢神经系统，特别是大脑皮质、海马和脊髓[10]。在胚胎生长发育时BDNF水平很高，发育成熟后BDNF维持在较低水平，发生脑缺血等损伤后，BDNF表达水平会发生很大变化，BDNF反应性表达增加是神经元对缺血缺氧等损伤的一种自身保护作用[11]。BDNF表达增加通过与神经元上的受体(TrkB或p75NTR)结合，维持神经元存活、减轻神经元损伤程度[12]。本研究结果显示：VD组大鼠海马组织中BDNFmRNA表达水平高于假手术组，VD组大鼠4周时BDNF蛋白表达水平明显高于假手术组，提示VD模型大鼠海马CA1区神经元在遭受缺血损伤后，BDNF反应性表达增加，对受损神经元起到一定的保护作用。

BDNF不仅与神经元的生长及存活有关，还可以刺激新的神经元及突触生长与分化，促进脑损伤后神经元修复，调节突触传递和可塑性，与认知和记忆密切关联[13-14]。突触可塑性有关的海马长时程增强(1ong-term potentiation，LTP)参与学习和记忆过程，研究[15]发现：BDNF可以通过TrkB/Akt/Girdin/Src信号通路，促使NMDA受体的NR2B亚单位磷酸化，进而激活NMDA受体参与LTP的形成。水迷宫测试实验[16-18]结果显示：脑损伤后的动物反应和记忆均较差，脑组织中BDNF水平也明显降低，脑内注射BDNF可以在一定程度上改善动物的学习和记忆能力。本研究结果显示：术后4和8周，NBP处理组大鼠海马BDNFmRNA表达水平明显高于VD组，术后8周时NBP处理组大鼠CA1区BDNF蛋白表达水平明显高于VD组，说明NBP可以促进VD大鼠海马CA1区BDNF的表达。

综上所述，本实验在制备VD大鼠的基础上，应用NBP给予干预治疗，观察不同时间点大鼠海马CA1区BDNF表达情况，结果表明：VD模型大鼠海马CA1区神经元在遭受缺血损伤后，BDNF反应性表达增加，而NBP则可以明显提高VD大鼠海马CA1区BDNF的表达水平，发挥神经保护作用。

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